专利名称：一种结核杆菌融合蛋白Mtb8.4-HspX及其制备方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种结核杆菌融合蛋白Mtb8. 4-HspX和其制备方法，以及其在制备抗结核的候选疫苗中的应用。
背景技术：
结核病是长期危害人类健康的严重疾病之一。全世界仍有近1/3的人感染过结核分枝杆菌。大约有5%的结核感染者在2-5年内会发展为肺结核病人；其余的有可能会形成结核病的潜伏感染者。我国是结核病高负担的国家之一，每年约有13万人因结核病而死亡。目前，卡介苗BCG的接种是有效预防结核病的重要措施。然而，不同研究显示，BCG在不同人群中的保护性不稳定，尤其是对成人肺结核的保护效率介于0-80%不等。因此，研制和开发全面高效的抗结核疫苗是控制结核病的重要途径。可供研究的抗结核疫苗有亚单位疫苗，重组BCG，减毒的MTB活疫苗。而亚单位疫苗又包括蛋白疫苗，DNA疫苗和以病毒为载体的疫苗；其中的蛋白疫苗具有成分明确，使用安全等优点，相对易于被人们接受。利用基因工程技术将具有优势的不同的单个结核保护性抗原进行重组，从而构建成融合蛋白。大量研究表明，与单个抗原相比，融合抗原的免疫原性会增强，显示出更好的保护效果；因此受到国内外研究的重视。然而在以往的研究中，为了后期简便的纯化方法， 往往构建成带有各种标签(如His · Tag，GST · Tag，S· Tag等)形式的融合蛋白，却未考虑这种融合蛋白所带有的标签是否会影响到动物实验以及更进。
发明内容
基于以上的研究背景情况，本发明利用基因工程技术，克隆构建了无任何标签的结核分枝杆菌融合蛋白Mtb8. 4-HspX，并且进行了表达和纯化，以期望成为抗结核的候选疫
田ο本发明的目的就是针对上述现有技术中的缺陷，提供了一种结核杆菌融合蛋白 Mtb8. 4-HspX，是序列表中序列2的蛋白质。本发明的另一个目的是提供一种上述结核杆菌融合蛋白Mtb8. 4-HspX的编码基因。所述融合蛋白Mtb8. 4-HspX的编码基因，是如下1)或2)的基因a)其核苷酸序列是序列表中的序列1 ；b)在严格条件下与a)限定的DNA序列杂交且编码所述融合蛋白的DNA分子。含有上述融合蛋白Mtb8. 4-HspX的编码基因的重组表达载体，所述重组表达载体为PET30a质粒。 含有上述重组表达载体的宿主细胞，所述宿主细胞为大肠杆菌BL21。本发明的第三个目的是提供一种上述结核杆菌融合蛋白Mtb8. 4-HspX的制备方法，其特征在于包括有以下步骤1)获得上述结核杆菌融合蛋白Mtb8. 4-HspX的编码基因；
2)将步骤1)得到的结核杆菌融合蛋白Mtb8. 4-HspX的编码基因导入重组表达载体；3)将步骤2)载体导入宿主细胞；4)培养步骤3)得到的宿主细胞；5)将步骤4)得到的宿主细胞进行处理得到上述结核杆菌融合蛋白Mtb8. 4-HspX 并纯化和表达。所述编码基因为序列1所示的核苷酸序列；所述重组表达载体为PET30a质粒；所述宿主细胞为大肠杆菌BL21。本发明的第四个目的是提供一种上述结核杆菌融合蛋白Mtb8. 4-HspX在制备抗结核的候选疫苗中的应用。所述候选疫苗的制备方法是将结核杆菌融合蛋白Mtb8. 4-HspX中加入DDA水溶液。所述DDA水溶液的制备方法为DDA用无菌蒸馏水配制成2. 5mg/ml，80°C水浴 10-20min，冷却至室温；将结核杆菌融合蛋白Mtb8. 4_HspX用PBS调至浓度0. 2mg/ml，并与 DDA水溶液按照体积比1 1混合。本发明的有益效果是结核杆菌Ag85B、ESAT-6、Mtb8. 4和HspX是最有可能对结核病起到保护作用的抗原。本发明选用的结核分枝杆菌Mtb8. 4是从结核杆菌培养滤液中纯化分离的一种低分子治疗蛋白抗原，具有较强的细胞免疫活性，能诱导CD4+Thl型细胞免疫反应和特异性CTL的产生，分泌高水平的IFN- γ。研究显示，用Mtb8. 4加不完全弗氏佐剂免疫C57BL/6小鼠能诱导强烈的Thl型细胞反应和细胞毒性T细胞反应，对结核菌毒力株的攻击起到有效的保护作用。HspX是一种相对分子质量为16000的热休克蛋白，由基因hspX(rV2031c)表达，属于结核菌休眠期调控子(DosR regulon)，研究表明HspX是结核分枝杆菌在静止生长期或低氧状态下产生的主要蛋白。有研究表明HspX在结核分枝杆菌感染后短时间内减缓其在体内生长速度方面可能起到某种关键作用。结核病患者及潜伏期感染者体内存在的针对HspX的特异性体液免疫和细胞免疫应答，均表明HspX是结核分枝杆菌潜伏感染期机体免疫反应的重要靶抗原。
图1为初次诱导时目的蛋白表达情况(SDS-PAGE)。图2为诱导条件优化后目的蛋白表达情况(SDS-PAGE)。图3为目的蛋白纯化(SDS-PAGE)。
具体实施例方式构建一种新型去标签融合蛋白Mtb8. 4-HspX,并且进行了表达和纯化，以期望成为抗结核的候选疫苗。引物应用引物设计软件I^rimer Premier 5. 0自行设计引物，由大连宝生物生物工程公司合成，其中划线部分为限制性内切酶的酶切位点序列。MH即Mtb8. 4-HspX的简写。MH 中 Mtb8. 4 上游引物5，AAT CATATG AGGCT GTCGT TGACC GCA 3，(NdeI)；
MH 中 Mtb8. 4 下游引5，TAGC GAGCTC ATA GTTGT TGCAG GAGCC 3，(SacI)；MH 中 Hspx 上游弓| :5，A GAGCTC ATGGC CACCA CCCTT CCC 3，(SacI)；MH 中 Hspx 下游引5，TAGGC AAGCTT TCAGT TGGTG GACCG GAT3，(HindIII)。以结核分枝杆菌H37Rv株基因组为模板，分别以Mtb8. 4和Hspx (含不同酶切位点)各自引物进行PCR扩增。PCR条件为Mtb8. 4基因:98°C 15s，63°C 15s，72°C 45s，30个循环；Hspx基因98°C 15s，66°C 15s，72°C lmin，30个循环。用PCR产物纯化试剂盒或胶回收纯化试剂盒纯化回收。PCR反应体系如表1所示。表 权利要求
1.一种结核杆菌融合蛋白Mtb8. 4-HspX，是序列表中序列2的蛋白质。
2.权利要求1所述的结核杆菌融合蛋白Mtb8.4-HspX的编码基因。
3.如权利要求2所述的基因，其特征在于所述融合蛋白Mtb8.4-HspX的编码基因，是如下1)或2)的基因a)其核苷酸序列是序列表中的序列1；b)在严格条件下与a)限定的DNA序列杂交且编码所述融合蛋白的DNA分子。
4.含有权利要求2或3所述融合蛋白Mtb8.4-HspX的编码基因的重组表达载体，所述重组表达载体为PET30a质粒。
5.含有权利要求4所述重组表达载体的宿主细胞，所述宿主细胞为大肠杆菌BL21。
6.-种如权利要求1所述的结核杆菌融合蛋白Mtb8.4-HspX的制备方法，其特征在于 包括有以下步骤1)获得如权利要求2所述的结核杆菌融合蛋白Mtb8.4-HspX的编码基因；2)将步骤1)得到的结核杆菌融合蛋白Mtb8.4-HspX的编码基因导入重组表达载体；3)将步骤2、载体导入宿主细胞；4)培养步骤幻得到的宿主细胞；5)将步骤4)得到的宿主细胞进行处理得到如权利要求1所述的结核杆菌融合蛋白 Mtb8. 4-HspX并纯化和表达。
7.如权利要求6所述的制备方法，其特征在于所述编码基因为序列1所示的核苷酸序列；所述重组表达载体为PET30a质粒；所述宿主细胞为大肠杆菌BL21。
8.—种如权利要求1所述的结核杆菌融合蛋白Mtb8. 4-HspX在制备抗结核的候选疫苗中的应用。
9.如权利要求8所述的应用，其特征在于所述候选疫苗的制备方法是将结核杆菌融合蛋白Mtb8. 4-HspX中加入DDA水溶液。
10.如权利要求9所述的应用，其特征在于所述DDA水溶液的制备方法为DDA用无菌蒸馏水配制成2. 5mg/ml，80°C水浴10-20min，冷却至室温；将结核杆菌融合蛋白 Mtb8. 4-HspX用PBS调至浓度0. 2mg/ml，并与DDA水溶液按照体积比1 1混合。
全文摘要
本发明公开了一种结核杆菌融合蛋白Mtb8.4-HspX，是序列表中序列2的蛋白质。本发明的有益效果是发明选用的结核分枝杆菌Mtb8.4是从结核杆菌培养滤液中纯化分离的一种低分子治疗蛋白抗原，具有较强的细胞免疫活性，能诱导CD4+Th1型细胞免疫反应和特异性CTL的产生，分泌高水平的IFN-γ。HspX是一种相对分子质量为16000的热休克蛋白，HspX足结核分枝杆菌在静止生长期或低氧状态下产生的主要蛋白。结核病患者及潜伏期感染者体内存在的针对HspX的特异性体液免疫和细胞免疫应答，均表明HspX是结核分枝杆菌潜伏感染期机体免疫反应的重要靶抗原。
文档编号C12N15/63GK102190734SQ201110068829
公开日2011年9月21日 申请日期2011年3月22日 优先权日2011年3月22日
发明者刘万波, 吴玉敏, 朱丽, 林孝发, 王秉翔, 祝秉东, 胡丽娜, 谭继英, 辛奇 申请人:兰州大学