专利名称：结核杆菌基因突变型检测芯片的制作方法
技术领域：
本发明属于体外临床检验和生物芯片技术领域，确切地说，是一种涉及待检测者血液样本处理和结核杆菌抗药性相关基因突变检测的基因微阵列产品及试剂盒。
背景技术：
结核杆菌引起的结核病是以呼吸道传播为主的慢性传染病，曾是危及人类生命的“第一杀手”。随着社会的文明进步，抗结核病药物的开发、预防疫苗的研制和应用，在全世界范围内结核病的发病率和死亡率均有明显下隆。但进入80年代中期，一度被人们控制流行的结核病，近十年来发病率呈大幅上升的趋势。在全球范围内，结核病又呈上升情况。这其中的原因之一就是结核杆菌的耐药性。
第一线抗结核药，包括利福平、异烟肼、吡秦酰胺、乙烯二氨基二丁醇、链霉素，一般能有效治疗结核病，但病人需连续服药六至八个月达多种药，不良的副作用可使病人不能完成指定的疗程，引致耐药结核杆菌的出现，最后治疗失败。这种情况可部分导致多耐药株的出现。自90年代初，结核菌多耐药株的报告渐有增加，尤其是从对爱滋病抗体呈阳性的欧美病人群中。结核菌多耐药株爆发经常导致高死亡率，因此快速诊断结核菌的耐药性是必须的。当病人被诊断已被结核菌感染，应及早开始药物治疗可防止并发症或减低传染其他人的机会。药物敏性测试可帮助医生选择最有效抗结核药及评估病人对治疗的反应，但目前结核菌药敏实验涉及培养生长很慢的结核菌，需时一至两个星期。
有些结核菌的基因DNA突变产生抗结核药耐药性已被证明。例如，超过30种突变在rpoB基因中段已被查出.约97％的耐利福平结核菌与这些突变有关连，这些突变减少利福平和细菌RNA聚合酶的粘合，产生对利福平耐药。利福平耐药性表面上与多耐药性结核菌有关连，故利福平耐药性可能可以用作多耐药性结核菌的标志.katG和inhA可以作为与结核杆菌异烟肼耐药性的相关基因指标。
DNA芯片技术适用突变的检验，一个芯片能同时容纳许多个探针，当和PCR扩增技术结合，根据芯片检查结核菌的药敏实验不同于传统的结核菌药敏实验。可不需要培养生长慢的结核菌。最近有报告高密度DNA芯片用作测试结核菌利福平耐药性，这芯片用光刻导向合成技术制作，但该技术制作成本高，不利于一般临床使用，本发明则利用机器人点样系统不制造芯片。DNA芯片技术是一种高度集成的DNA检测技术。首先采用专用自动化设备将已知DNA寡核苷酸探针排列在玻片或硅片上，然后将待检测样本中的所有DNA成分与芯片探针杂交，有相对应的靶DNA就会出现相应的杂交信号。理论上可以做到一次实验检测多个基因。
DNA芯片技术的设想可追溯到90年代初，美国Affymetrix公司首先开始这方面的研究(www.affymetrix.com)，由于这项技术的广泛的应用前景以及巨大的经济效益，目前美国的斯坦福大学、美国橡树岭国家实验室、Incyte商业公司和Hyseq公司、德国的自动化公司(www.mpimgberlin-dahlem.mpg.da/autom)、都在进行全力研究，竞争市场份额。国内也有公司开始跟进了DNA芯片的研究。
本发明的目的是提供一种可提高诊断效率和诊断准确性、降低检测成本、缩短诊断时间的诊断结核杆菌及其耐药性的DNA芯片。
发明内容
本发明的目的是提供一种可同时对结核杆菌相关基因突变检测，从而进行疾病预测，诊断和预后判断的方法。我们的试剂盒通过检测血清或血浆中可能存在的结核杆菌DNA，来达到这一目的。
在本发明的第一方面，提供了一种结核杆菌抗药突变型集成检测基因芯片，芯片包括片基和片基上的反应区域，所述的反应区域包括12个以上的探针点，1个以上标准点。反应区域特征在于每一反应区域底部是固相载体，且在固相载体上以共价键方式连接能检测包括结核杆菌基因型的DNA探针微点阵。
在一优选例中，所述的固相载体是修饰了的玻片，硅片，朔胶，尼龙膜，NC膜，纳米材料，高分子材料。
在另一优选例中，所述反映区域内探针数量为12个以上。
在另一优选例中，所述的检测结核杆菌基因突变的探针在固相载体上各有2个以上探针点。
在另一优选例中，所述每个反应区域设有1个以上定位基准点。
在本发明的第二方面，提供了一种结核杆菌基因突变集成检测芯片的配套试剂盒，它包括本发明上述的结核杆菌基因突变集成检测芯片。
在另一优选例中，还包括样品处理试剂盒，样品扩增液，杂交液，工作液和标准品。
在另一优选例中，所述的样品处理试剂盒提供结核杆菌DNA抽提处理的试剂盒。
在另一优选例中，所述的样品扩增液包括所设计的探针和PCR扩增溶液。
在另一优选例中，所述的工作液由亲和素标记的HRP与亲和反应液现配现用。
在另一优选例中，所述的发光物为鲁米诺、异鲁米诺或其衍生物。
附图的简要说明从下面给出的说明结合附图，本发明的上面和其它目的和特征将变得明了，其中
图1是本发明一种固相载体上结核杆菌基因突变型检测的9项指标和1个定位标准点的点样示意图。
图2是本发明的反应孔中进行的各探针——标靶扩增产物反应的示意图具体实施方式
结核杆菌抗药突变型检测的关健是检测的灵敏度和特异性均达到要求，以保证结果的准确可靠，而相应的难点是如何将不同的代表性抗药基因突变整合到一个反应区域里来检测。经过深入而广泛的研究，本发明通过对抗药突变序列的查找和比对分析，进行了专一性探针的设计，再结合DNA扩增的技术进行样本处理，经过杂交反应和亲和反应，再结合化学发光检测方法，达到对不同基因型突变的同时检测。
具体而言，为提高基因突变型的检测效率，本发明应用微点阵检测技术，结合微阵列基因杂交技术和化学发光检测技术设计了一种多个基因突变平行检测的集成检测微阵列。微阵列包括载体和位于载体上的反应区域，所述的反应区域包括12个以上探针序列，5个以上标准对照，其特征是每一反应区域上偶联着能检测结核杆菌不同基因突变型的DNA探针。
在本发明中，反应区域为阵列型。
在本发明中，偶联结核杆菌基因突变型检测探针的固相载体可以选用本领域常用的各种固相载体，包括(但并不限于)玻璃片、塑料、带正电尼龙膜，硅胶片等，较佳的固相载体包括玻片和硅胶片。
在固相载体上，各探针序列有2个以上重复点样点。此外，较佳地在固相载体上还包括一个定位点(见图1)。
在本发明中，各指标的检测采用基因杂交法，检测原理如图2所示。详细叙述如下1)将特异性探针与固相载体连接，形成固相探针。封闭，除去未结合的位点。
2)用DNA处理试剂盒，处理受检血清，进行BIOTIN标记的扩增。将扩增产物与反应孔内的探针进行杂交反应，与探针形成探针-目标DNA产物-BIOTIN的复合物3)洗涤除去未结合的目标核酸产物，及反应杂质。
4)与HRP标记的亲和素进行亲和反应。使已经检测到的核酸产物间接标记上HRP。
5)加底物固相上的酶催化底物，化学发光，CCD检测，光强度与标本中受检抗原的量呈正相关。
本发明巧妙地综合利用了基因微点阵检测技术，亲和反应，以及化学发光检测技术，实现了多种突变的同时检测。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆实验室手册(New YorkCold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1检测反应板的制备取醛基化玻片，在每个反应区域上分别针对结合杆菌rpoB，基因kat G，基因inh A基因各偶联3个能检测基因突变的DNA探针，和上述三个基因的标准定位点作为反应结果的阳性对照，组成基因序列微列阵(图1)。
实施例2试剂盒制备试剂盒一，用于血清中结核杆菌DNA的抽提制备。
试剂盒二，用于样本处理获得结核杆菌DNA的扩增和标记。
洗涤浓缩液、酶标工作液实施例3结核杆菌基因突变型检测按以下方法对各测试血请样品进行检测1.按照产品说明书对血清样本进行处理，提取结核杆菌DNA。
2.加入PCR扩增液，对处理得到的DNA样品进行扩增标记，用带BIOTIN标记的引物给产物标记上生物素。
3.加入反应区域，10-20ul。
4.50℃保温保湿反应30分钟。
5.用洗液洗涤4-6次，每次2分钟，振动。
6.加入亲和反应液，10-20ul。
7.在50℃反应15-20min。
8.用洗液洗涤4-6次，每次2分钟，晃动。
9.加检测液20ul/孔，使检测液均匀分布于反应区域。
10.CCD检测，视发光信号强度曝光30-60秒。
结果判定依据不同指标的CutOff值，参考标准品梯度曲线，判定样品血清的阴阳性。
与此同时，用常规方法对测试的血清样品进行常规检测。结果表明，用本发明的试剂盒得出的测试结果与常规方法相同。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权力要求书所限定的范围。
权利要求
1.一种结核杆菌抗药基因突变型检测芯片试剂盒，由结核杆菌抗药突变型集成检测基因芯片和配套使用的试剂盒组成，其特征在于结核杆菌抗药突变型集成检测基因芯片由固相载体和固相载体上偶联的探针组成；配套使用的试剂盒包括对血清样本进行处理的处理液，对处理样本进行扩增标记的扩增液，进行杂交反应的杂交液，用于洗涤的洗涤液，用于亲和反应的工作液，和用于化学发光的检测液；在血清样本的检测过程中配套试剂盒与结核杆菌抗药突变型集成检测基因芯片是联合使用的。
2.如权利要求1所述的结核杆菌抗药基因突变型检测芯片试剂盒，其特征在于，固相载体为玻片、硅片、膜、纳米材料、高分子材料；所述的载体可以是不修饰也可以是经过特殊修饰的。
3.如权利要求1所述的结核杆菌抗药基因突变型检测芯片试剂盒，其特征在于，所述的固相载体上偶联的探针是可以检测出结核杆菌基因组与抗药性相关的突变的长度为12bp以上的DNA，同时还包括两个长度为15bp以上扩增的阳性对照探针序列；阴性对照探针用于检测杂交信号错误或者污染，阳性对照探针用于检测是否正常杂交。
4.如权利要求1所述的结核杆菌抗药基因突变型检测芯片试剂盒，其特征在于，所述的样本处理液可以对含有结合杆菌的血清进行处理并抽提血清中的DNA。
5.如权利要求1所述的结核杆菌抗药基因突变型检测芯片试剂盒，其特征在于，所述的配套使用的扩增液可以以不对称方式，通过ONE-STEP RT PCR方法同时扩增和以生物素标记结核杆菌DNA，其包含的引物为有生物素标记的15bp以上的DNA，每一对病毒特异性引物能够扩增出GENEBANK中记录的所有该种病毒的相应片断。
6.如权利要求1所述的结核杆菌抗药基因突变型检测芯片试剂盒，其特征在于，所述的工作液由辣根过氧化物酶标记的亲和素组成，能在4摄氏度和60摄氏度之间正常工作。
7.如权利要求1所述的结核杆菌抗药基因突变型检测芯片试剂盒，其特征在于，所述的检测液由发光物和过氧化氢二种试剂组成，使用前混合；发光物为鲁米诺、异鲁米诺或其衍生物。
全文摘要
本发明涉及结核杆菌的DNA水平诊断的三项指标集成检测基因芯片和基因芯片试剂盒，所述的基因芯片包括基片和反应区域，所述的反应区域包括12－200个探针点，1－10个标准品点。本发明的基因芯片和试剂盒可简便，快速，准确地实现结核杆菌抗药突变基因型的诊断。
文档编号C12Q1/68GK1869247SQ20051010246
公开日2006年11月29日 申请日期2005年9月14日 优先权日2005年5月24日
发明者汪宁梅 申请人:汪宁梅