专利名称：超支化聚合物凝胶固定化酵母载体的制备方法
技术领域：
本发明涉及一种超支化聚合物凝胶固定化酵母载体的制备方法。
背景技术：
酒精发酵是利用酵母通过生化途径把糖转化为酒精，而起着关键作用的就是酵母，酵母强壮、活力强、酵母数多，产酒高，就不容易感染杂菌、出现酸败现象，就能更多更好产酒精。固定化酵母发酵比传统游离酵母发酵具有明显的优越性，其主要特点如下(1)发酵速度快，设备利用率高。酵母密度增加，增强了发酵强度，发酵速度比传统快10-30％(发酵时间在28-35小时)，设备利用率和酒精产量同理提高10-30％。
(2)酵母可以多次使用，减少酵母增殖消耗的糖分，提高了出酒率。省去酒母培养费用，节省非生产时间，酵母载体在发酵罐内形成一个强大的酵母源，故不需进行酒母的逐级培养，避免造成杂菌感染。
(3)抗杂菌感染能力高。选择了优良酵母菌种进行固化，酵母强壮、数量多、形成了酵母优势，更能耐酸、耐酒、耐温、耐高浓度。能消灭酸败现象。
(4)工艺操作简单，方便、粗放，操作条件弹性大，能适应生产条件较大波动，而不影响到正常生产。由于其快速启动性好，特别适合经常停汽、停电的场合，且载体可清洗、用清水浸泡保存，整个生产期不需要换载体，易为工人接受。
(5)提高了经济效益。
固定化酵母生物技术根据固定原理的不同，可分为吸附法、包埋法和共价健(交联)法三大类。包埋法具有细胞受载体保护不易流失，对恶劣环境抗御能力较强等优点，因而是目前应用得比较多的一种生物技术。但目前常用的包埋剂的主要缺点是制作过程复杂，使用成本较高，且载体寿命不长，丧失机械强度的载体可能导致管路堵塞。
发明内容
本发明的目的是为了克服现有技术存在的缺点，提供一种耐冲刷、磨损性能强、能抑制杂菌生长，让活酵母作用发挥充分的超支化聚合物水性凝胶固定化活酵母载体的制备方法。
为实现上述发明目的采取的技术方案是该超支化聚合物凝胶固定化酵母载体的制备方法按以下步骤一、超支化聚合物的合成(1)原料及其重量比偏苯三酸酐 41g-86g环氧丙烷丁基醚 29g-65g丙烯酸缩水甘油酯 2.5g-9.8gN-N-二甲基甲酰胺(DMF) 34g-56g催化剂 0.2g-3g阻聚剂 0.3g-2g；(2)制备方法①将偏苯三酸酐，N-N-二甲基甲酰胺(DMF)加入四口瓶中，加热至80℃，在氮气保护下搅拌使偏苯三酸酐溶解，加入环氧丙烷丁基醚和催化剂，升温至110℃-115℃反应，每半小时取样测酸值至酸值恒定；②将步骤①反应所得聚合物降温冷却至＜60℃，加入N-N-二甲基甲酰胺(DMF)和丙烯酸缩水甘油酯及阻聚剂，升温至90-95℃反应至酸值＜1.5，降温＜50℃出料；③提纯；将聚合物溶液在搅拌下滴加到甲醇/水溶液中，甲醇∶水＝1∶1，沉淀，分离后的聚合物用40-70g丙酮溶解，再用同样的方法沉淀/分离纯化三至五次后，在压力为0.01kpa，温度为60℃的减压烘箱中干燥10小时，得超支化聚合物；二、超支化聚合物凝胶的制备超支化聚合物与丙烯酸酯、丙烯酸或甲基丙烯酸及引发剂在光或热作用下制备；三、固定化活酵母载体的制备在浓度为0.5％-2％的海藻酸钠水溶液中，定量加入种子培养液并混合均匀，使其中酵母细胞含量为106-109个/毫升，将超支化聚合物凝胶浸入其中，充分浸泡10-24小时后，在3％-8％氯化钙溶液中固化10-24小时，无菌清水清洗3次而得超支化聚合物凝胶固定化酵母载体。
所述催化剂为四丁基溴化胺、四丁基氯化胺、四丁基氟化胺、四乙基溴化胺、四乙基氟化胺、四乙基氯化胺或三乙基苄基氯化铵。
所述阻聚剂为对苯二酚、对羟基苯甲醚或邻氯苯酚。
所述丙烯酸酯为聚乙二醇200二甲基丙烯酸酯、二甲基丙烯酸四甘醇酯、三丙烯酸(三羟甲基丙基)酯、三甲基丙烯酸(三羟甲基丙基)酯、二丙烯酸三丙二醇酯、丙烯酸甲氧基乙酯、一缩二乙二醇二甲基丙烯酸酯或二甲基丙烯酸三甘醇酯。
所述引发剂(热引发)为过氧化二苯甲酰(BPC)、过氧化十二酰(LPO)、过氧化二特丁基、过氧化二碳酸二异丙酯、过氧化二碳酸二环己酯或过氧化乙酰基环己烷磺酰。
所述引发剂(光引发)为光敏剂651、光敏剂184、光敏剂1800、光敏剂907、光敏剂261、光敏剂149、光敏剂1784、光敏剂1173。
所述光作用为光固化方法；所述热作用为热固化方法。
本发明用于载体的超支化聚合物的合成采用偏苯三酸酐与环氧丙烷丁基醚进行开环加成反应合成中心树脂，利用中心树脂分子外围的羟基与丙烯酸缩水甘油酯反应形成分子外围具有可光、热固化的水性超支化不饱和树脂。水性凝胶载体的形成采用合成的功能化超支化聚合物与聚乙二醇200二甲基丙烯酸酯类单体、丙烯酸(甲基丙烯酸)、引发剂等在光或热作用下形成水性凝胶。其固定化活化酵母载体的制作采用载体吸人海藻酸钠活酵母液、氯化钙溶液浸泡、清水洗净。
本发明的优点和效果1、采用超支化聚合物凝胶载体固定酵母发酵生产酒精，提高了发酵成熟醪酒分，降低了成熟醪残糖。
一间日产30吨酒精的工厂采用传统游离酵母生产酒精时，成熟醪酒分9.0×10-2，残糖1.95×10-2，吨酒精耗标准糖蜜4.25吨。投资20万元技改，通过采用该技术，成熟醪酒分为10.6×10-2，残糖1.75×10-2，吨酒精耗标准糖蜜4.20吨。前后相比说明采用该技术后，年可节约糖蜜30×300(4.25-4.2)＝450吨，年可多产酒精450÷4.2＝107.14吨，可多创收107.14×4200＝450000元。
2、解决传统游离酵母发酵酸败现象制备的超支化聚合物凝胶作为固定化酵母载体，特别适合酵母菌的生长，同时对发酵过程的其它杂菌具有强烈的抑制作用。
以日产酒精30吨，每天成熟醪液量为400m3，同样生产2000吨酒精，生产周期68天，传统游离酵母发酵出现酸败一次，时间5天，成熟醪酒分7.6×10-2(V)，残糖2.8×10-2；而采用该技术后成熟醪残糖1.75×10-2，挽回可发酵性糖400(2.8％-1.75％)×5＝21(t)，即标准糖蜜21×2＝42(t)，可产酒精42÷4.2＝10(t)，可多创收10×4200＝42000(元)。
3、降低劳动强度，缩短发酵周期，提高日产量采用该技术后，日产量可提高10-30％，规模30吨/日的酒精厂若按增加3吨/日计，则年产值可增加3×300×4200＝3780000元，可新增利税720000元。单从上述三项估算，采用该技术后，年可增加利税450000+42000+720000＝1212000元。因此，采用该技术，经济效益显著。
图1为合成的超支化聚合物红外光谱图；图2为合成的超支化聚合物热分析结果图。
具体实施例方式
一、超支化聚合物的合成(一)原料及其重量比偏苯三酸酐 41-86g环氧丙烷丁基醚 29-65g丙烯酸缩水甘油酯 2.5-9.8g
N-N-二甲基甲酰胺 34-56g四丁基溴化胺 0.2-3g对羟基苯甲醚 0.3-2g(二)制备方法将偏苯三酸酐及N-N-二甲基甲酰胺(DMF)加入四口瓶中，加热至80℃，在氮气保护下，搅拌使偏苯三酸酐溶解，加入环氧丙烷丁基醚及四丁基溴化胺，升温至110℃-115℃反应，每半小时取样测酸值至酸值恒定。将上述反应所得聚合物降温冷却至＜60℃，加入配方量的N-N-二甲基甲酰胺和丙烯酸缩水甘油酯及对羟基苯甲醚，升温至90℃-95℃反应至酸值＜1.5，降温＜50℃出料。并通过如下方法提纯将聚合物溶液在搅拌下滴加到甲醇/水溶液中(甲醇∶水＝1∶1)沉淀，分离后的聚合物用40-70g丙酮溶解，用同样的方法沉淀/分离纯化三至五次后，在减压烘箱中(压力0.01kpa，60℃)干燥10小时。图1的红外光谱分析表明无酸酐760cm-1，1850cm-1和环氧基905cm-1振动吸收峰，说明偏苯三酸酐、环氧丙烷丁基醚、丙烯酸缩水甘油酯均已反应完全。而791cm-1和1618cm-1处双键的吸收峰十分明显，说明丙烯酰氧基已接到超支化聚合物分子上。从图2TG曲线的变化可知，树脂在100℃以内没有失重，在100-200℃范围内，失重较小，而从200℃开始特别是在300-400℃热失重特别严重。而DTA曲线表明在400℃左右有一吸热峰，这是树脂分解的吸热峰。根据热分析结果，树脂在300℃以内没有分解，具有较好的热稳定性。
二、超支化聚合物凝胶的制备方法一(热固化)原料及其重量比超支化聚合物 10-30g聚乙二醇200二甲基丙烯酸酯 40-80g二丙烯酸三丙二醇酯 1-6g丙烯酸 2-10g过氧化二苯甲酰 2-8g工艺将超支化聚合物、聚乙二醇200二甲基丙烯酸酯、二丙烯酸三丙二醇酯及丙烯酸混合均匀，加入过氧化二苯甲酰后，搅拌条件下升温至70-80℃反应2-4小时，得到轻度交联的超支化聚合物，该聚合物吸水量可达到聚合物∶水＝2∶8。
方法二(光固化)原料及其重量比超支化聚合物 15-35g聚乙二醇200二甲基丙烯酸酯 40-90g二丙烯酸三丙二醇酯 1-5g一缩二乙二醇二甲基丙烯酸酯 8-15g光敏剂184 2-8g工艺将超支化聚合物、聚乙二醇200二甲基丙烯酸酯、二丙烯酸三丙二醇酯及一缩二乙二醇二甲基丙烯酸酯混合均匀，加光敏剂184后，用1000w汞灯照射20-50秒，得到轻度交联的超支化聚合物，该聚合物吸水量可达到聚合物∶水＝1.5∶7。
固定化活酵母载体的制备在浓度为0.5％-2％的海藻酸钠水溶液中，定量加入种子培养液并混合均匀，使其中酵母细胞(酒精酵母204号)含量为106-109个/毫升，取上述混合液8-10份，并加入2-4份轻度交联的超支化聚合物，充分浸泡(约10-24小时)后，在3％-8％氯化钙溶液中固化10-24小时，无菌清水清洗3次，得超支化聚合物凝胶固定化酵母载体。此时即可投入发酵罐内进行增殖培养，也可以直接投入发酵阶段运转，发酵过程的条件控制与常用的固定化酵母发酵技术基本一致。
权利要求
1.一种超支化聚合物凝胶固化酵母载体的制备方法，按以下步骤一、超支化聚合物的合成(1)原料及其重量比偏苯三酸酐 41g-86g环氧丙烷丁基醚 29g-65g丙烯酸缩水甘油酯 2.5g-9.8gN-N-二甲基甲酰胺 34g-56g催化剂 0.2g-3g阻聚剂 0.3g-2g；(2)制备方法①将偏苯三酸酐，DMF加入四口瓶中，加热至80℃，在氮气保护下搅拌使偏苯三酸酐溶解，加入环氧丙烷丁基醚，升温至110℃-115℃反应，每半小时取样测酸值至酸值恒定；②将步骤①反应所得聚合物降温冷却至＜60℃，加入DMF和丙烯酸缩水甘油酯及阻聚剂，升温至90-95℃反应至酸值＜1.5，降温＜50℃出料；③提纯；将聚合物溶液在搅拌下滴加到甲醇/水溶液中，甲醇∶水＝1∶1，沉淀，分离后的聚合物用40-70g丙酮溶解，再用同样的方法沉淀/分离纯化三至五次后，在压力为0.01kpa，温度为60℃的减压烘箱中干燥10小时，得超支化聚合物；二、超支化聚合物凝胶的制备超支化聚合物与丙烯酸酯、丙烯酸或甲基丙烯酸及引发剂在光或热作用下制备；三、固定化活酵母载体的制备在浓度为0.5％-2％的海藻酸钠水溶液中，定量加入种子培养液并混合均匀，使其中酵母细胞含量为106-109个/毫升，将超支化聚合物凝胶浸入其中，充分浸泡10-24小时后，在3％-8％氯化钙溶液中固化10-24小时，无菌清水清洗3次而得超支化聚合物凝胶固定化酵母载体。
2.据权利要求1所述的超支化聚合物凝胶固化酵母载体的制备方法，其特征在于所述催化剂为四丁基溴化胺、四丁基氯化胺、四丁基氟化胺、四乙基溴化胺、四乙基氟化胺、四乙基氯化胺或三乙基苄基氯化铵。
3.据权利要求1所述的超支化聚合物凝胶固化酵母载体的制备方法，其特征在于所述阻聚剂为对苯二酚、对羟基苯甲醚或邻氯苯酚。
4.据权利要求1所述的超支化聚合物凝胶固化酵母载体的制备方法，其特征在于所述丙烯酸酯为聚乙二醇200二甲基丙烯酸酯、二甲基丙烯酸四甘醇酯、三丙烯酸三羟甲基丙基酯、三甲基丙烯酸三羟甲基丙基酯、二丙烯酸三丙二醇酯、丙烯酸甲氧基乙酯、一缩二乙二醇二甲基丙烯酸酯或二甲基丙烯酸三甘醇酯。
5.据权利要求1所述的超支化聚合物凝胶固化酵母载体的制备方法，其特征在于所述引发剂为过氧化二苯甲酰、过氧化十二酰、过氧化二特丁基、过氧化二碳酸二异丙酯、过氧化二碳酸二环己酯或过氧化乙酰基环己烷磺酰。
6.据权利要求1所述的超支化聚合物凝胶固化酵母载体的制备方法，其特征在于所述引发剂为光敏剂651、光敏剂184、光敏剂1800、光敏剂907、光敏剂261、光敏剂149、光敏剂1784、光敏剂1173。
7.据权利要求1所述的超支化聚合物凝胶固化酵母载体的制备方法，其特征在于所述光作用为光固化方法。
8.据权利要求1所述的超支化聚合物凝胶固化酵母载体的制备方法，其特征在于所述热作用为热固化方法。
全文摘要
本发明涉及一种超支化聚合物凝胶固化酵母载体的制备方法。本发明的目的是为了克服现有技术存在的缺点，提供一种耐冲刷、磨损性能强、能抑制菌生长，让活酵母作用发挥充分的超支化聚合物水性凝胶固定化活酵母载体。本发明用于载体的超支化聚合物的合成采用偏苯三酸酐与环氧丙烷丁基醚进行开环加成反应合成中心树脂，利用中心树脂分子外围的羟基与丙烯酸缩水甘油酯反应形成分子外围具有可光、热固化的水性超支化不饱和树脂。水性凝胶载体的形成采用合成的功能化超支化聚合物与聚乙二醇200二甲基丙烯酸酯类单体、丙烯酸(甲基丙烯酸)、引发剂等在光或热作用下形成水性凝胶。其固定化活化酵母载体的制作采用载体吸入海藻酸钠活酵母液、氯化钙溶液浸泡、清水洗净。
文档编号C12N1/16GK1807614SQ20051010143
公开日2006年7月26日 申请日期2005年11月14日 优先权日2005年11月14日
发明者冯宗财, 汪德凤, 莫辰希, 黄强 申请人:湛江师范学院