基于乳糖的智能聚合物及其应用的制作方法

本发明属于生物化学技术领域，尤其涉及基于乳糖的智能聚合物及其应用。

背景技术：

蛋白质糖基化是一种非常重要的蛋白质翻译后修饰方式，真核细胞中约有一半的蛋白质发生过糖基化。蛋白质糖基化不仅赋予蛋白质特定的理化性质，更重要的是参与凝血、免疫、细胞生长、分泌和信号传导等关键的生理活动。因此，对糖蛋白的结构进行精确分析和解析非常重要。然而糖链非常复杂且具有微观不均一性，其分析和结构解析一直是糖生物学研究的瓶颈。而且糖肽丰度很低，极易受到高丰度非糖肽的干扰。[Ongay,S.；Boichenko,A.；Govorukhina,N.；Bischoff,R.J.Sep.Sci.2012,35,2341-2372.]

目前主流的分析方法是将大的糖蛋白结构酶解成若干小的糖肽片段进行分析，在操作中，首先需要将糖肽与非糖肽进行分离，之后需要对具有不同糖链结构的糖肽进行分离。目前已有多种材料能够实现对糖肽的选择性富集，即满足前一个操作要求。然而对糖链结构精确区分和色谱分离仍然是一个巨大的难题。解决这一问题，可以极大地降低糖肽样品的复杂性，提高对目标糖肽链的富集能力，这对于内分泌疾病和癌症生物标记物的发现、鉴定、分析和应用至关重要。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种基于乳糖的智能聚合物及其应用。该智能聚合物修饰到不同的基质材料表面后对唾液酸具有显著的响应性，并且能够通过不同的溶剂梯度，分离含有不同糖链结构的糖肽，特别是唾液酸糖肽。

本发明为解决上述技术问题所采用的方案为：

基于乳糖的智能聚合物，其是由乳糖功能单体上的醛基通过席夫碱缩合反应接枝到多氨基类聚合物的主链上所得，所述乳糖功能单体的结构式如下：

所述多氨基类聚合物包括聚丙烯酰胺、聚乙烯亚胺、聚天冬酰胺、聚酰胺、聚甲基丙烯酸氨基乙酯、聚酰胺-胺或者聚甲基丙烯酸氨基丙酯中的一种或两种以上的混合。

上述方案中，所述乳糖功能单体按如下过程进行制备：

1)在反应容器内加入50-250mL的乙酸酐溶液中加入0.5-3ml的高氯酸，缓慢加入所需乳糖10-80g，搅拌后置于冰浴中，依次加入5-20g红磷，10-30mL溴，10-20mL水，之后室温搅拌反应2-6h，所得混合物过滤、干燥及洗涤，萃取液合并旋干后得到乳糖一号位羟基溴取代产物；

2)在反应容器中加入上述产物10-40g，用三氯甲烷溶解，之后加入50-200mL饱和的碳酸钠溶液，加入0.5-10g四丁基碘化铵，1-10g对羟基苯甲醛，30-70摄氏度反应4-24h，之后去除水层，干燥后过滤得到的有机混合物用柱色谱层析法分离提纯之后得到一号位接有对羟基苯甲醛其它羟基被乙酰基保护的产物；

3)于反应容器中加入1-10g上述产物，加入10-50mL甲醇，加入0.1-1g的甲醇钠，反应1-24h后，产物用柱色谱层析法分离纯化，最后得到所述乳糖功能单体。

上述方案中，所述多氨基类聚合物为聚丙烯酰胺，该聚丙烯酰胺接枝乳糖的智能聚合物的合成方法如下：

其中x:0.01～0.7。

上述方案中，将上述基于乳糖的智能聚合物修饰到无机基质材料表面即得到所述基于乳糖的智能聚合物薄膜材料，所述无机基质材料包括半导体Si、金属或氧化物；所述金属为Au、Ag、Cu、Al或Pt；所述氧化物为CuO、Al₂O₃、Fe₃O₄、TiO₂或SiO₂。

基于乳糖的智能聚合物薄膜材料在唾液酸识别中的应用。

基于乳糖的智能聚合物色谱分离材料，将上述基于乳糖的智能聚合物修饰到多孔基质材料上即得到所述基于乳糖的智能聚合物色谱分离材料，所述多孔基质材料包括多孔半导体Si、多孔金属或多孔氧化物；所述多孔金属为Au、Ag、Cu、Al或Pt；所述多孔氧化物为CuO、Al₂O₃、Fe₃O₄、或SiO₂，所述多孔基质材料的粒径是50nm-50μm，孔径分布范围为

基于乳糖的智能聚合物色谱分离材料在色谱分离中的应用，其特征在于，在固相萃取模式下，将糖蛋白酶解物负载到由所述基于乳糖的智能聚合物色谱分离材料填充的固相萃取柱上，采用梯度淋洗液洗脱的方法，从高体积浓度的乙腈/水溶液逐渐转换到低体积浓度的乙腈/水溶液，可以分离得到含有不同糖链结构的糖肽。

上述方案中，糖蛋白酶解物与基于乳糖的智能聚合物色谱分离材料的质量比为1:5-1:200。

上述方案中，分离温度为10-60℃。

上述方案中，所述高体积浓度的乙腈/水溶液中乙腈与水的体积比为90/10，所述低体积浓度的乙腈/水溶液中乙腈与水的体积比为10/90。

上述方案中，基于乳糖的智能聚合物薄膜材料或智能聚合物色谱分离材料的制备方法如下：

1)在反应容器中依次加入0.1-10g多氨基类聚合物，0.1g-10g的乳糖单体，同时加1-10mL H₂O以及1-15mL甲醇作溶剂，20-60℃搅拌反应1-48小时。反应所得产物装于透析袋中用体积含量1-99％甲醇和水的混合溶液中透析1-7天，之后将透析袋中的溶液冷冻干燥后得白色固体为基于乳糖的智能聚合物；

2)3-(三乙氧基硅烷)丙基异硫氰酸酯与基质材料中的一种或二种以上于甲苯中反应得到带有异硫氰酸基团的基质材料；3-(三乙氧基硅烷)丙基异硫氰酸酯与基质材料的用量的质量比例为1:5-1：300，于甲苯溶液中回流反应1-6小时。反应结束后，依次用甲醇、水洗涤3-(三乙氧基硅烷)丙基异硫氰酸酯修饰的基质材料，干燥后将得到的材料置于真空干燥器中备用。

其中3-(三乙氧基硅烷)丙基异硫氰酸酯的合成步骤：在反应容器中加入5-30mL四氢呋喃，1-10mL的3-氨基丙基三乙氧基硅烷，滴入1-5mL的二硫化碳搅拌1-3小时，随后加入1-6g双氰胺和0.1-1mL的三乙胺，搅拌反应时间1-8小时，减压蒸馏得到3-异硫氰酸丙基-三甲氧基硅氧烷。

3)将接有3-异硫氰酸基团的基质材料0.1-5g浸入含有上述基于乳糖的智能聚合物(0.1-10g)的水溶液10-50mL中；将反应温度控制在20-60℃静止反应2-24小时；反应结束后用甲醇、水依次洗涤聚合物接枝的基质材料，干燥后得到乳糖的智能聚合物材料，包括基于乳糖的智能聚合物薄膜材料或智能聚合物色谱分离材料，置于真空干燥器中备用。

本发明的有益效果为：本发明开发了基于乳糖的智能聚合物薄膜材料，能够对唾液酸进行高选择性识别和检测，并更进一步发明了乳糖的智能聚合物色谱分离材料能够分离具有不同糖链结构的糖肽，特别是唾液酸糖肽，分离效率高。

附图说明

图1为乳糖功能单体对多种不同单糖的结合力示意图。

图2为基于乳糖的智能聚合物薄膜材料的初始的表面形貌图(插图显示的是表面接触角)。

图3为基于乳糖的智能聚合物薄膜材料浸泡过浓度为0.02mol·L^-1的唾液酸溶液后的表面形貌图。

图4为基于乳糖的智能聚合物薄膜材料的初始的杨氏模量图(其中插图显示的是模量分布的直方图)。

图5为基于乳糖的智能聚合物薄膜材料浸泡过浓度为0.02mol·L^-1的唾液酸溶液后的杨式模量图。

图6为基于乳糖的智能聚合物色谱分离材料在固相萃取模式下，对胎球蛋白和牛血清蛋白(质量比为1:100)混合物的酶解产物进行富集后的MALDI-TOF质谱图。

图7为基于乳糖的智能聚合物色谱分离材料在固相萃取模式下，对胎球蛋白和牛血清蛋白(质量比为1:300)混合物的酶解产物进行富集后的MALDI-TOF质谱图。

图8为通过改变乙腈/水混合溶液的极性，分步将含有不同糖链结构的糖肽进行分离的示意图。

其中(A,B)O-型唾液酸糖肽，(C)N-型唾液酸糖肽的分离。(A,B)中肽段的序列Pep.1:VTCTLFQPVIPQPQPDGAEAEAPS(271)AVPDAAGPTPSAAGPPVASV VVGPSVVAVPLPL HR；(C)中肽段的序列Pep.2:VVHAVEVALATFNAESN(176)GSYLQLVEISR.糖结构:实心方格:GlcNAc；实心圆圈:mannose；空心圆圈:galactose；实心菱形:Neu5Ac。

具体实施方式

为使本发明的内容、技术方案和优点更加清楚明白，以下结合具体实施例和附图进一步阐述本发明，这些实施例仅用于说明本发明，而本发明不仅限于以下实施例。

实施例中所用原料及设备:

硅片由Silicon Materials Corporation(Germany)购得，HPLC柱色谱填料硅胶由上海月旭公司购得。以聚丙烯酰胺溶液(重均分子量：10000)为例，由Sigma-Aldrich公司购得。乳糖,甲醇，对羟基苯甲醛，溴化氢等由Alfa公司购得。其他试剂均使用市售分析纯。¹H spectra在Bruker ARX300spectrometer检测获得。

实施例1

乳糖功能单体的合成

1)在反应容器内加入200mL的乙酸酐溶液加入1mL的高氯酸，缓慢加入所需乳糖20g，搅拌30min后，置于冰浴中，依次加入6g红磷，20mL溴，14mL水，之后室温搅拌反应4h。所得混合物经过过滤，干燥之后，用50％石油醚/乙醚混合溶剂洗涤三次，减压蒸馏旋干后得到一号位溴基取代，其它羟基被乙酰基保护的乳糖的衍生物；

2)在干净的反应容器中加入上述产物20g，用150mL三氯甲烷溶解，之后加入150mL饱和的碳酸钠溶液，加入5g四丁基碘化铵，8g对羟基苯甲醛，60摄氏度反应12h，之后除水层，干燥后的混合物使用柱色谱层析法分离提纯的一号位接有对羟基苯甲醛其它羟基被乙酰基保护乳糖衍生物；

3)在反应容器中加入5g上述产物，加入50mL甲醇，加入1g的甲醇钠，反应4h后，产物使用柱层析法提纯，最后得乳糖单体。

实施例2

聚丙烯酰胺接枝乳糖的智能聚合物的合成

乳糖聚合物中，x:0.01～0.7；

以x＝0.2为例，

在反应容器中依次加入1g聚丙烯酰胺，0.2g的乳糖单体，同时加入10mL H₂O以及15mL甲醇作溶剂，40℃搅拌12小时，得到的产物装于透析袋中用体积含量50％甲醇和水的混合溶液中透析3天后冷冻干燥后得聚丙烯酰胺接枝乳糖的智能聚合物白色固体。

聚丙烯酰胺接枝乳糖的智能聚合物的表征数据¹H NMR(500MHz,D2O):δ(ppm):1.62(m,80H,C-CH₂),2.19(d,40H,C-CH),3.36-3.96(m,11H,CH-OH and CH₂-OH),4.41(t,J＝3.0Hz,1H,CH-OH),5.11(d,J＝7.9Hz,1H,O-CH-O),5.24(d,J＝7.8Hz,1H,O-CH-O),7.21(d,J＝8.9Hz,2H,Ph-H),7.89(d,J＝8.8Hz,2H,Ph-H),9.76(s,1H,CH＝N).IR(cm-1):3335,3186,2931,2885,1654,1606,1562,1449,1403,1346,1320,1184,1118,1076,1043.

实施例3

聚丙烯酰胺接枝乳糖的智能聚合物柱色谱分离材料的制备，包括如下步骤：

1)在50mL的圆底烧瓶中加入10g多孔硅胶与30mL的5wt％HCl混合，常温搅拌48h。抽滤得到大量白色固体粉末，分多次用30mL超纯水洗涤；真空干燥后得到羟基化修饰的硅胶产品；

2)将3-氨基丙基三乙氧基硅烷30mmol溶解在20mL的四氢呋喃中，再缓慢滴入二硫化碳，在冰浴中搅拌反应3h。随后恢复常温，加入3.8g双氰胺，紧接着加入3滴三乙胺，20mL四氢呋喃，该混合物加热到40℃继续搅拌反应3h。该溶液减压蒸馏得到3-(三乙氧基硅烷)丙基异硫氰酸酯；

3)将步骤2)得到的3-(三乙氧基硅烷)丙基异硫氰酸酯与步骤1)得到的羟基化修饰的硅胶加入到甲苯中，随后加入2mL三乙胺常温搅拌反应12h，可得到由3-(三乙氧基硅烷)丙基异硫氰酸酯修饰的硅胶；

4)将该硅胶加入上述实施例2中得到的基于乳糖的智能聚合物水溶液中随后加入2mL三乙胺常温搅拌24h就可得基于乳糖的智能聚合物修饰的硅胶色谱材料。使用相同的方法可以制备不同颗粒尺寸(包括硅胶粒径，孔径)、基于乳糖的智能聚合物接枝的硅胶样品，用作色谱分离材料。硅胶粒径是50nm-50μm，孔径分布范围为

实施例4

聚丙烯酰胺接枝乳糖的智能聚合物薄膜材料的制备

将接有异硫氰酸基团的Si、SiO₂、Au、Ag、Pt、CuO、Al₂O₃、TiO₂、ZrO₂或Fe₃O₄等基质材料浸入含有上述实施例2中得到的基于乳糖的智能聚合物的水溶液中；将烧瓶的温度控制在60℃静置反应4-6小时；反应结束后用甲醇，H₂O依次洗涤聚合物接枝表面，此聚合物表面的厚度为10-50nm，氮气吹干表面后置于真空干燥器中备用。使用相同的方法聚合得到不同比例的基于乳糖的智能聚合物薄膜材料。

实施例5

采用荧光滴定的方法测定了乳糖功能单体对多种不同单糖的结合力。图1展示了在pH＝7.4与3.8溶液条件下，测得乳糖功能单体与其它糖之间的结合常数。从图1中可以看到乳糖功能单体对不同类型的单糖体现出优异的区分能力，对唾液酸的结合能力显著高于其他种类的单糖。同时发现在微酸性(pH＝3.8)溶液中对唾液酸的结合力远远大于在中性溶液(pH＝7.4)中的结合力，为唾液酸糖肽的选择性富集和分离奠定了基础。

将实施例4制备好的于平整基质上接枝的基于乳糖的智能聚合物得到的薄膜材料，浸泡于唾液酸溶液中。之后通过接触角仪和原子力显微镜及其力学模式观察浸泡唾液酸溶液前后的基于乳糖的智能聚合物薄膜材料表面的变化。可以明显的观察到基于乳糖的智能聚合物薄膜材料原接触角为78°，泡完唾液酸之后变为了54°，并且聚合物薄膜表面形貌发生了明显变化，进一步发现薄膜的软硬也变化明显，从杨氏模量270±66MPa变化到110±23MPa。然而乳糖智能薄膜泡过其它糖溶液之后表面都没有发生大的变化。如图2-5所示，说明基于乳糖的智能聚合物薄膜对唾液酸具有响应性，能够应用于识别和检测唾液酸。

实施例6

按实施例3所述方法将聚丙烯酰胺接枝乳糖的功能聚合物接枝到多孔硅胶表面得到基于乳糖的智能聚合物色谱分离材料，然后以其为柱填料制成固相萃取柱SPE柱备用。

将实施例3制备的1mg色谱分离材料装入微型柱中，1μL(40pmol)蛋白酶解液上样后，分别用30μL的体积浓度85％乙腈/0.1％甲酸(pH 3)洗脱两次；然后用30μL含有体积浓度80％乙腈/0.1％甲酸(pH 3)溶液洗脱两次；最后用20μL体积浓度50％乙腈/2％甲酸溶液洗脱。洗脱液直接在质谱上进行分析。

糖肽可以从聚合物修饰材料上洗脱下来，当胎球蛋白和牛血清蛋白质量比为1:100时采用该色谱分离材料可以富集出28个唾液酸糖肽(图6)；当胎球蛋白和牛血清蛋白质量比为1:300时采用该色谱分离材料仍然可以富集出10个唾液酸糖肽(图7)，说明基于乳糖的智能聚合物色谱分离材料能特异性的富集唾液酸类糖肽。

实施例7

将实施例3制备的1mg色谱分离材料装入微型柱中，加入20μL体积浓度50％CH₃CN/0.1％TFA溶液。使用20μL体积浓度80％CH₃CN/20mM NH₄FA(pH＝3.8)溶液平衡，1μL(40pmol)蛋白酶解液上样到微型柱中。之后微型柱按照顺序依次用20mM NH₄FA含有体积浓度75％CH₃CN,70％CH₃CN,65％CH₃CN,60％CH₃CN和55％CH₃CN分别清洗。之后通过微型柱洗涤出来的溶液经过冷冻干燥浓缩之后采用质谱分析，得到的结果如图8所示。该材料能够将含有不同糖链结构但是相同肽段的糖肽都通过改变淋洗液中乙腈的含量从而达到分离的效果。如图8所示，糖链的末端都是唾液酸，说明对唾液酸糖肽的分离效果最好。

本发明发现乳糖对唾液酸具有很强的结合能力，将乳糖单体和多氨基类聚合物制备成智能聚合物。该聚合物接枝在无孔基质表面的得到的基于乳糖的智能聚合物薄膜，对唾液酸具有很高的选择性，能够识别和检测唾液酸。同时，在对应的无机多孔基质材料上接枝可得到基于乳糖的智能聚合物制备得到的色谱分离材料，能够实现对唾液酸糖肽的高选择性富集，以及对含有不同糖链结构的唾液酸糖肽的分离。该材料在唾液酸糖肽的分离研究和与唾液酸糖肽相关的癌症，内分泌等疾病检测相关领域具有广阔的应用前景。