专利名称：重组vpac2型受体特异激动剂rmbay及其表达方法与应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及基因工程领域，具体的说涉及一种VPAC2型受体特异激动剂及其表达方法，与其在制备治疗VPAC2受体相关疾病的药物中的应用。
背景技术：
垂体腺苷酸环化酶激活多肽(pituitary adenylate cyclase activatingpolypeptide，PACAP)是1989年发现的，由脑垂体分泌的具有重要生物学功能的神经多肽，属于是促胰液素/高血糖素/VIP家族中的新成员。PACAP及其受体(PAC1、VPAC1和VPAC2)广泛分布于中枢神经系统、周围神经系统以及非神经组织内，如脑、睾丸、卵巢、呼吸道、肺、胰腺等。目前已证实PACAP具有神经递质/调质、保护神经细胞；促进激素分泌，调节内分泌平衡；调节性腺功能和生殖细胞的产生；参与消化活动，调节能量代谢平衡；参与调节免疫系统等生物学功能。
PACAP的具有3个受体PAC1是PACAP的特异受体；VPAC1和VPAC2是PACAP和血管活性肠肽(VIP)的共同受体；PACAP对3个受体具有相同的激动功能。PACAP的3个受体在肌体的分布不同；例如PAC1型受体及其变体多分布于神经组织，而VPAC2受体是公认与能量代谢密切相关的受体，分布于胰岛等组织。PACAP通过其不同的受体介导不同的生物学功能例如，PACAP通过VPAC2型受体可以促进葡萄糖依赖胰岛素的分泌，提高肌体对高血糖的应激能力，起到降低血糖的作用；而分布于肾上腺的VPAC1型受体介导促进肾上腺素的分泌，简介促进糖原分解，升高血糖浓度；因此，PACAP通过不同受体的共同作用，并不能起到降低血糖的作用。
通过对PACAP关键氨基进行突变，可产生对某一受体具有特异激动功能的衍生多肽，特异激活某一受体，产生特定的生物学功能。例如VPAC2型受体的特异激动剂，特异性激活VPAC2型受体，而对PAC1型受体和VPAC1型受体不具有任何激活功能，因此能通过VPAC2型受体介导葡萄糖依赖的胰岛素分泌，提高肌体对高浓度血糖的应激能力，有效降低血糖，而且不具有其它副作用，被视为治疗糖尿病新型高效的多肽药物。
目前，国外已有VPAC2型受体特异激动剂的报道，但均为化学合成，对于30多个氨基酸组成的多肽，化学合成的成本高、效率低。
本发明的另一个目的是提供上述重组VPAC2型受体特异激动剂RMBAY的表达方法。
本发明根据VPAC2型受体特异激动剂序列，采用基因工程的原理和技术，从多肽的基因入手，结合蛋白内含肽(intein)的可诱导剪切功能实现VPAC2型受体特异激动剂的高效制备，具体如下所示(1)设计并合成RMBAY基因采用4条引物两步法合成RMBAY基因首先引物F2和F3进行链延伸反应，然后以其产物为模板，以F1和F4为引物，PCR反应制得RMBAY基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO1所示；所述引物F1、F2、F3、F4的核苷酸序列分别如SEQ ID NO3、SEQ IDNO4、SEQ ID NO5、SEQ ID NO6所示；(2)用NdeI和SapI进行酶切，将RMBAY基因克隆到质粒pKYB的NdeI和SapI位点间，构建重组质粒pKY-BAY；(3)重组质粒pKY-BAY转化表达宿主菌E.coli Strain ER2566，构建表达工程菌；(4)诱导剂IPTG诱导工程菌表达由目的多肽、蛋白内含肽和几丁质结合域(Chitin binding domain，CBD)组成的“三元”融合蛋白；(5)融合蛋白经几丁质柱纯化，硫醇诱导蛋白内含肽的N端切割，释放目的多肽C端硫酯；透析多肽硫酯，使其在适当条件下水解产生稳定的水解产物。重组VPAC2型特异激动剂RMBAY的氨基酸序列如SEQ ID NO2所示。
本发明的重组VPAC2型特异激动剂RMBAY在抗脑损伤、脑缺血、防止神经细胞死亡、抗炎、男性阳痿、性冷淡、不孕不育、神经痛、神经病、神经混乱、焦虑症、记忆损伤、痴呆、认知混乱、中枢神经系统疾病、偏头痛、神经畏缩、心肌缺血、心肌梗死/纤维化、动脉硬化、糖尿病、肌畏缩症、胃溃疡、高血压、内毒性休克、血栓症、视网膜病变、心血管疾病、肾衰竭、心衰竭疾病中有显著的疗效。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果本发明所制备的VPAC2型受体特异激动剂RMBAY与现有的特异激动剂相比，在其N端多了一个甲硫氨酸，并具有特殊的氨基酸序列，在C端通过巯酯键结合硫醇，成为多肽硫酯，多肽硫酯可以水解产生天然的羧基端，也可特异水解成为硫代羧酸。本发明的RMBAY是新型的VPAC2型受体的特异激动剂，具有更高的降低血糖的功能，可应用于与VPAC2型受体密切相关的疾病的诊断和治疗。同时，利用本发明的方法合成的RMBAY多肽硫脂的水解产物比化学合成的多肽的稳定性高10倍以上。本发明的表达方法效率高、成本低，应用前景广阔。
图1为RMBAY的制备示意图；图2为RMBAY基因的引物设计和合成示意图；图3为pKY-BAY的构建示意图；图4为pKY-BAY的测序鉴定图；图5为SDS-PAGE检测RMBAY的制备图；图6为PACAP/RMBAY和125I-PACAP38对VPAC2受体的竞争结合图；图7为PACAP/RMBAY和125I-PACAP38对VPAC1受体的竞争结合图；图8为PACAP/RMBAY和125I-PACAP38对PAC1受体的竞争结合图；图9为PACAP和RMBAY促进VPAC2-CHO细胞胞内cAMP生成的活性测定图；图10为RMBAY降低NIH小鼠血糖浓度的活性测定图；图11为RMROM与RROM活性稳定性比较图。
其中，图5中，a1Protein Marker；2Crude extract from uninducedcells；3Crude extract from cells induced at 30℃ for 4hours；4Clarifiedcrude extract from induced cells；5Chitin column flow through；b1Protein Marker；2、3Fractions of eluted RMBAY after self-cleavagereaction。图10中，(P＜0.01RMBAY，RBAY groups vs Control；P＜0.01RMBAY groups vs RBAY groups P＞0.05RMPACAP group vs Control)。
具体实施例方式
实施例1特异激动剂RMBAY的制备特异激动剂RMBAY制备的示意图如图1所示。
1、RMBAY基因的制备链延伸反应引物F2(0.1OD/μl)5μl，F3(0.1OD/μl)5μl，10×TaKaRa LA Buffer 10μl，dNTP 16μl，H2O 63μl，94℃，10min；降至55℃，加TaKaRa LA Taq酶1μl，保温5min；72℃，5min；所得为延伸反应液。
PCR反应引物F1(0.01OD/μl)1μl，F4(0.01OD/μl)1μl，延伸反应液1μl，dNTP 10μl，10×TaKaRa Ex Buffer 10μl，TaKaRaEx Taq酶1μl，H2O 76μl，94℃，4min；94℃，30Sec、55℃，30sec、72℃，30sec，32个循环；72℃，10min。
F1NNNNNNCAT ATGCAT AGC GAT GCG GTG TTT ACC GAA AAC TATACC AAA CTG CGT AAA CAG；F2CTG GCG GCG AAA AAA TAT CTG AAC GAT CTG AAA AAA GGC GGCACC；F3CGC CAG CTG TTT ACG CAG TTT GGT ATA GTT TTC GGT AAA CACCGC ATC GCT ATG CA；F4NNNNNNGCTCTTCC GCA GGT GCC GCC TTT TTT CAG ATC GTT CAGATA TTT TTT CGC。
其中，N代表保护碱基，CAT ATG为NdeI酶切位点，GCTCTTC为SapI酶切位点。RMBAY基因的合成示意图如图2所示。
2、用NdeI和SapI进行酶切，将RMBAY基因克隆到质粒pKYB的NdeI和SapI位点间，构建重组质粒pKY-BAY，构建图如图3，测序鉴定图如图4。
3、重组质粒pKY-BAY转化表达宿主菌E.coli Strain ER2566，构建表达工程菌pKY-BAY-ER；挑取单克隆于5mL含50μg/mL卡那霉素的LB培养基，摇菌培养过夜，以1∶20接于1L含50mg/L卡那霉素的LB培养基，37℃摇菌至OD600为0.5～0.8，加入IPTG至终浓度0.3mmol/L，30℃诱导4h。离心收集菌体，重悬于60mL的溶液A(20mM Tris.HCl，500mM NaCl，1mM EDTA，pH8.0)，然后超声破碎，20,000g离心30min，收集上清。
取10mL几丁质珠装填2.5×10cm层析柱，不少于10倍体积的溶液A(20mM Tris-HCl，0.5M NaCl，1mM EDTA，pH8.0)洗柱；以0.5mL/min的流速上破碎上清；大于10倍体积的溶液A以2mL/min洗去杂蛋白，30mL溶液B(20mM Tris-HCl，0.5M NaCl，1mM EDTA，50mMβ-巯基乙醇，pH8.0)快速过柱，使β-巯基乙醇均匀分布并浸泡柱内填料，16℃诱导蛋白肽切割16h。溶液A洗脱目的多肽，分管收集，每2mL为一管，目的多肽大多存在于前10管中。Tricine-SDS-PAGE鉴定目的多肽；4℃透析过夜除去β-巯基乙醇。采用滤过分子量为10kD的超滤管滤除大分子蛋白杂蛋白。RMBAY制备过程的Tricin-SDS-PAGE检测如图5。
实施例2RMBAY的受体选择性测定利用分别特异表达PACAP的3个受体的中国仓鼠卵巢细胞(CHO细胞)，125I标记配体与受体竞争性结合实验(Competitionbinding assay)。
1、胞膜蛋白制备收集特异表达VPAC2型受体的CHO细胞，重悬于1mM NaHCO3，立即冻于液氮2～3小时，取出解冻后，4℃，400g离心10min，取上清4℃，20,000离心10min，沉淀重悬于1mMNaHCO3，作为细胞膜蛋白粗制品。
2、取上述制备的10μg膜蛋白，加入0.1nmol/的125I-PACAP38(1813.14Ci/mmol)和待测重组多肽，并逐步提高多肽的浓度(10-10-10-5mol/L)，反应在100μl缓冲液(20mmol/L HEPES，pH7.4，150mmol/L NaCl，0.5％BSA，2mmol/L MgCl2，0.1mg/mLbacitracin)中进行，37℃温育20min。玻璃纤维滤膜(预先用0.1％polyethylenimine浸泡过夜)过滤反应物，收集膜蛋白，洗涤液(25mmol/L NaPO4，1％BSA)洗膜三次，γ计数器测定放射量E；以1μmol/L PACAP38存在时的放射量为非特异结合。
以没有加竞争多肽，只有125I-PACAP38所测定的放射量为E0，计算各浓度的多肽与125I-PACAP38竞争结合受体后，所测定的放射量E与E0比值，以百分比表示(％E/E0)；以多肽浓度的对数值为横坐标，％E/E0为纵坐标作图；计算当抑制程度达到50％时多肽的浓度，即为半抑制量(IC50，half-maximal inhibitory concentration)。每组实验重复3次。
实验结果对于VPAC2受体，rhPACAP38半抑制量IC50(half-maximal inhibitory concentration)为30±10nmol/L，RMBAY的IC50为70±5nmol/L，如图6。
对于VPAC1受体，rhPACAP38半抑制量IC50(half-maximalinhibitory concentration)为80±5nmol/L，RMBAY的IC50大于10μmol/L，如图7。
对于PAC1受体，RMPACAP半抑制量IC50为20±10nmol/L，RMBAY的IC50大于10μmol/L如图8。
以上结果显示，RMBAY特异竞争125I-PACAP38对VAPC2受体的结合。
实施例3RMBAY促进VPAC2-CHO细胞cAMP生成的活性测定采用所筛选的高效表达VAPC2受体的VPAC2-CHO细胞检测RMBAY促进胞内cAMP合成的活性。
细胞刮刮取对数生长期的VPAC2-CHO细胞，PBS洗2遍，调整细胞悬液浓度为1×106个/ml，加入相同浓度的RMPACAP或RMBAY，调节多肽的浓度从10-12mol/L到10-6mol/L；37℃温育5min，100μl细胞悬浮液，加入2倍体积的0.2mol/L HCl，室温放置20min，tip头吹打溶解细胞并混匀，1000g离心10min，吸取上清按Cyclic AMP Enzyme Immunoassay Kit说明测定cAMP浓度。
RMBAY和RMPACAP均能有效刺激胞内cAMP的生成，RMBAY的EC50(half-maximal effective concentration，EC50)为1.8±0.5nM，RMPACAP的EC50为5.3±0.3nM(图9)。
RMBAY不仅特异竞争125I-PACAP38对VAPC2受体的结合，而且有效激活受体，对VPAC2受体显示具有选择性和激动性，是VPAC2受体的特异激动剂。
实施例4重组多肽RMBAY降低血糖的功能清洁级(SPF级)NIH雄性小鼠(使用许可证号粤检证字2002-2009；合格证号粤检证字2003A076)，由第一军医大学实验动物中心提供，体重25±5g，按体重随机分组，每组10只。称重，编号，禁食18h，按体重腹腔分别注射葡萄糖和待测重组多肽，注射15min后，后眼眶静脉丛采血，用OneTouch Ultra血糖自动分析仪(美国JOHNSON公司)测定血糖；或按需要，摘眼球取血500μL/只，4000g离心15min分离血清，送东山区医院测定胰岛素水平。组间比较采用t检验。
采用NIH小鼠进行动物学实验1.8mmolGlucose/kg、50ng/kgpeptides腹腔注射，15min后测定血糖。，结果表明(如图10)RMBAY具有显著降低血糖的功能，而且降糖作用比N端比不带甲硫氨酸(Met)多肽RBAY的作用更强。
实施例5重组多肽RMBAY促进葡萄糖依赖的胰岛素分泌的功能采用NIH小鼠进行动物学实验1.8mmolGlucose/kg、50ng/kgpeptides腹腔注射，15min后采血样测定胰岛素；结果(表1)显示，RMBAY可有效促进葡萄糖依赖的胰岛素的分泌，说明其可特异激活分布在胰岛β细胞上的VPAC2受体。
表1小鼠血浆胰岛素检测Detection of plasma insulin in NIH mice
aP＜0.01，Experimental group vs Control；实施例6RMBAY稳定性的测定配制相同浓度的RMBAY和RBAY(化学合成N端不带Met，C端为羧酸的线性多肽)，室温(25℃)放置，分段取出测定其降血糖的活性，以放置前的降糖活性为100％，多肽活性稳定性＝放置后的降糖活性/放置前的降糖活性×100％，实验结果(图11)显示RMBAY具有比RBAY更高的稳定性。
重组VPAC2型受体特异激动剂RMBAY及其表达方法与应用序列表SEQUENCE LISTING<110>暨南大学<120>重组VPAC2型受体特异激动剂RMBAY及其表达方法与应用<130>
<160>2<170>PatentIn version 3.2<210>1<211>96<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>CDS<222>(1)..(96)<400>1atg cat agc gat gcg gtg ttt acc gat aac tat acc cgt ctg cgt aaa48Met His Ser Asp Ala Val Phe Thr Asp Asn Tyr Thr Arg Leu Arg Lys1 5 10 15cag ctg gcg gcg aaa aaa tat ctg cag agc att aaa aac aaa cgt tat96Gln Leu Ala Ala Lys Lys Tyr Leu Gln Ser Ile Lys Asn Lys Arg Tyr20 25 30<210>2<211>32<212>PRT<213>人工序列<400>2Met His Ser Asp Ala Val Phe Thr Asp Asn Tyr Thr Arg Leu Arg Lys1 5 10 15Gln Leu Ala Ala Lys Lys Tyr Leu Gln Ser Ile Lys Asn Lys Arg Tyr20 25 30<210>3<211>60<212>DNA<213>引物F1<400>3NNNNNN CAT ATG CAT AGC GAT GCG GTG TTT ACC GAA AAC TAT ACC AAA CTG CGT AAA CAG<210>4<211>45<212>DNA<213>引物F2<400>4CTG GCG GCG AAA AAA TAT CTG AAC GAT CTG AAA AAA GGC GGC ACC<210>5<211>56<212>DNA<213>引物F3
重组VPAC2型受体特异激动剂RMBAY及其表达方法与应用序列表<400>5CGC CAG CTG TTT ACG CAG TTT GGT ATA GTT TTC GGT AAA CAC CGC ATC GCT ATG CA<210>6<211>56<212>DNA<213>引物F4<400>6NNNNNN GCTCTTC C GCA GGT GCC GCC TTT TTT CAG ATC GTT CAG ATA TTT TTT CGC
权利要求
1.重组VPAC2型特异激动剂RMBAY，其氨基酸序列如SEQ IDNO2所示。
2.一种编码权利要求1所述重组VPAC2型特异激动剂RMBAY的基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO1所示。
3.一种权利要求1所述重组VPAC2型特异激动剂RMBAY的表达方法，如下所示(1)合成RMBAY基因首先引物F2和F3进行链延伸反应，然后以其产物为模板，以F1和F4为引物，PCR反应制得RMBAY基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO1所示；所述引物F1、F2、F3、F4的核苷酸序列分别如SEQ ID NO3、SEQ ID NO4、SEQ ID NO5、SEQ ID NO6所示；(2)用NdeI和SapI进行酶切，将RMBAY基因克隆到质粒pKYB的NdeI和SapI位点间，构建重组质粒pKY-BAY；(3)重组质粒pKY-BAY转化表达宿主菌，构建表达工程菌；(4)用诱导剂IPTG诱导工程菌表达；(5)用几丁质柱亲和层析纯化表达产物，硫醇诱导蛋白内含肽的N端切割，释放目的多肽C端硫酯，多肽C端硫酯水解得到特异激动剂RMBAY。
4.如权利要求3所述的表达方法，其特征在于步骤(3)所述的宿主菌为E.coli Strain ER2566。
5.权利要求1所述的重组VPAC2型特异激动剂RMBAY在制备治疗脑损伤、脑缺血、防止神经细胞死亡、抗炎、男性阳痿、性冷淡、不孕不育、神经痛、神经病、神经混乱、焦虑症、记忆损伤、痴呆、认知混乱、中枢神经系统疾病、偏头痛、神经畏缩、心肌缺血、心肌梗死/纤维化、动脉硬化、糖尿病、肌畏缩症、胃溃疡、高血压、内毒性休克、血栓症、视网膜病变、心血管疾病、肾衰竭、心衰竭疾病的药物中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种重组VPAC2型特异激动剂RMBAY及其表达方法与应用。本发明的RMBAY是新型的VPAC2型受体的特异激动剂，具有更高的协助机体降低血糖的功能，可应用于与VPAC2型受体密切相关的疾病的诊断和治疗。同时，利用本发明的方法制备的RMBAY多肽的C端硫脂的水解产物比化学合成的多肽的稳定性高10倍以上，本发明的表达方法效率高、成本低，应用前景广阔。
文档编号C12N15/09GK1778820SQ200510100229
公开日2006年5月31日 申请日期2005年10月11日 优先权日2005年10月11日
发明者洪岸, 余榕捷 申请人:暨南大学