检测人FGFR3基因突变的引物组及其试剂盒的制作方法

本发明涉及检测人FGFR3基因突变的引物组及其试剂盒，属于遗传性骨病基因检测技术领域。

背景技术：

成纤维细胞生长因子受体3(fibroblast growth factor receptor 3，FGFR3)属于酪氨酸蛋白激酶型受体，其亲和力很高。FGFR3主要是由三部分构成，细胞内的酪氨酸蛋白激酶活性结构域、疏水氨基酸组成的跨膜结构域及细胞外3个免疫球蛋白样重复序列组组成的结构域，分别称为Loop I、Loop II与Loop III。LoopII与LoopIII构成了FGF配基的结合位点。在LoopI与LoopII之间含有一段酸性的、富含丝氨酸的区域，是FGFRs统一的保守结构。FGFR3在脑、肺、脊索以及软骨中表达，主要调控软骨细胞生长，进而限定长骨的长度。对角质形成细胞、黑素细胞、上皮细胞、淋巴细胞和精母细胞等同样有作用。FGFR3结合的配基有FGF1、FGF2、FGF4、FGF7、FGF8、FGF9、FGF17～20等。

FGFR3基因突变会导致皮肤过度生长疾病表皮痣与脂溢性角化病；各种形式的肿瘤，如多发性骨髓瘤、膀胱癌、宫颈癌与精原细胞瘤等。故FGFR3可促进癌细胞增殖与存活，被看做癌基因。FGFR3基因突变是人类软骨发育不良(Achondroplasia，ACD)、CATSHL综合征(camptodactyly,tall stature,scoliosis,and hearing loss)、软骨发育低下(hypochondroplasia,HCD)、软骨发育低下样发育不全(Hypochondroplasia-like dysplasias)、严重软骨发育不良伴发育迟缓和黑棘皮症(Severe achondroplasia with developmental delay and acanthosisnigricans(SADDAN))、I型与II型致死性发育不良(Thanatophoric dysplasia type 1,2,TD1,2)等遗传性疾病的致病基因。

FGFR3突变根据突变位置的不同，存在不同的机制。软骨发育不良G380R氨基酸替代导致在两个精氨酸侧链间形成氢键，以不依赖配基的方式，增强了FGFR3二聚体的稳定性。是最常见侏儒症的遗传形式。I型TD Y373C与R248C碱基替代分别位于近膜结构域、或两Ig结构域连接区域，通过在半胱氨酸残基间形成二硫键，而激活FGFR3。胞内酪氨酸激酶区域突变如，K650M(TDI)或K650E(TDII),能够模拟酪氨酸激酶结构域的构象变化，诱导配基介导FGFR3二聚体化及其自身磷酸化反应。故对于FGFR3基因突变及其突变位置与突变类型的检测，对于临床疾病的辅助确诊与产前诊断等意义重大。

技术实现要素：

本发明针对现有技术的不足，提供检测人FGFR3基因突变的引物组及其试剂盒。

本发明的技术方案如下：

检测人FGFR3基因突变的引物组，该引物组包括12对特异性扩增FGFR3基因第2至第7外显子以及第9至第19外显子的引物；

所述的FGFR3基因外显子2的PCR扩增引物，包括核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的引物FP1与核苷酸序如SEQ ID NO.2所示的引物RP1；

所述的FGFR3基因外显子3的PCR扩增引物，包括核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示的引物FP2与核苷酸序如SEQ ID NO.4所示的引物RP2；

所述的FGFR3基因外显子4的PCR扩增引物，包括核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示的引物FP3与核苷酸序如SEQ ID NO.6所示的引物RP3；

所述的FGFR3基因外显子5与外显子6的PCR扩增引物，包括核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示的引物FP4与核苷酸序如SEQ ID NO.8所示的引物RP4；

所述的FGFR3基因外显子7的PCR扩增引物，包括核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示的引物FP5与核苷酸序如SEQ ID NO.10所示的引物RP5；

所述的FGFR3基因外显子9的PCR扩增引物，包括核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示的引物FP6与核苷酸序如SEQ ID NO.12所示的引物RP6；

所述的FGFR3基因外显子10的PCR扩增引物，包括核苷酸序列如SEQ ID NO.13所示的引物FP7与核苷酸序如SEQ ID NO.14所示的引物RP7；

所述的FGFR3基因外显子11的PCR扩增引物，包括核苷酸序列如SEQ ID NO.15所示的引物FP8与核苷酸序如SEQ ID NO.16所示的引物RP8；

所述的FGFR3基因外显子12与外显子13的PCR扩增引物，包括核苷酸序列如SEQ ID NO.17所示的引物FP9与核苷酸序如SEQ ID NO.18所示的引物RP9；

所述的FGFR3基因外显子14与外显子15的PCR扩增引物，包括核苷酸序列如SEQ ID NO.19所示的引物FP10与核苷酸序如SEQ ID NO.20所示的引物RP10；

所述的FGFR3基因外显子16与外显子17的PCR扩增引物，包括核苷酸序列如SEQ ID NO.21所示的引物FP11与核苷酸序如SEQ ID NO.22所示的引物RP11；

所述的FGFR3基因外显子18与外显子19的PCR扩增引物，包括核苷酸序列如SEQ ID NO.23所示的引物FP12与核苷酸序如SEQ ID NO.24所示的引物RP12。

一种用于检测FGFR3基因突变的测序引物组，该引物组包括12条第2至第7外显子以及第9至第19外显子的测序引物；包括：

外显子2的PCR测序引物核苷酸序列为SEQ ID NO.1的引物FP1；

外显子3的PCR测序引物核苷酸序列为SEQ ID NO.3的引物FP2；

外显子4的PCR测序引物核苷酸序列为SEQ ID NO.5的引物FP3；

外显子5与外显子6的PCR测序引物核苷酸序列为SEQ ID NO.7的引物FP4；

外显子7的PCR测序引物核苷酸序列为SEQ ID NO.9的引物FP5；

外显子9的PCR测序引物核苷酸序列为SEQ ID NO.11的引物FP6；

外显子10的PCR测序引物核苷酸序列为SEQ ID NO.14的引物RP7；

外显子11的PCR测序引物核苷酸序列为SEQ ID NO.15的引物FP8；

外显子12与外显子13的PCR测序引物核苷酸序列为SEQ ID NO.17的引物FP9；

外显子14与外显子15的PCR测序引物核苷酸序列为SEQ ID NO.19的引物FP10；

外显子16与外显子17的PCR测序引物核苷酸序列为SEQ ID NO.21的引物FP11；

外显子18与外显子19的PCR测序引物核苷酸序列为SEQ ID NO.24的引物RP14。

一种用于检测FGFR3基因突变的试剂盒，包括：

上述用于检测FGFR3基因突变的由第2至第7外显子以及第9至第19外显子的PCR扩增引物组成的引物组；

PCR扩增试剂；

PCR产物纯化试剂；

含有上述用于检测FGFR3基因突变的测序引物组的DNA测序试剂。

根据本发明优选的，所述PCR扩增试剂包括：2.5mM dNTP，含Mg²⁺的10×PCR缓冲液，5U/μl Taq DNA聚合酶，去RNase与DNase水；

所述PCR扩增体系中各组分的工作浓度为：200μM dNTP，1×PCR缓冲液，0.025U/μl Taq DNA聚合酶，上游引物和下游引物均为0.4μM，模板浓度为2.5～5ng/μl。

根据本发明优选的，所述PCR产物纯化试剂包括：1U/μl SAP酶、10U/μl ExoI酶、去RNase与DNase水；

PCR产物纯化体系中各组分的工作浓度为：0.05U/μl SAP酶、0.5U/μl ExoI酶。

根据本发明优选的，所述DNA测序试剂包括：上述用于检测FGFR3基因突变的测序引物组、BigDye 3.1混合液、0.125M EDTA溶液、无水乙醇、体积百分比75％乙醇溶液、Hi-Di甲酰胺溶液、去RNase与DNase水。

根据本发明进一步优选的，所述测序引物中的测序引物的工作浓度为0.64pMol/L。

有益效果

1、本发明采用特异性引物组，针对FGFR3基因的第2至第7外显子以及第9至第19外显子进行突变检测，确保了测定结果的准确性与特异性。与传统的单一突变位点的检测而言，扩大了检测突变范围至FGFR3外显子区所有位点，覆盖已报道的突变位点与可能的突变位点。与传统的通过荧光定量PCR采用探针法检测相比，降低了检测成本，同时PCR产物通过DNA序列测定以及后续序列比对完成，其准确性要高于荧光定量PCR。与高通量测序相比较，直接对FGFR3致病基因进行检测，避免了高通量测序中因原始数据筛选、阈值设定等问题而可能出现的假阳性与假阴性问题；

2、本发明所涉及的每对引物的PCR扩增与DNA测序条件完全一致，可以同时进行扩增测序，极大降低了检测过程的工作量；

3、本发明提供的FGFR3基因突变组及其检测试剂盒可用于FGFR3基因突变所导致的遗传性疾病CATSHL综合征、软骨发育低下、软骨发育不全、SADDAN发育不全、致死性骨发育不全、仙台类型的短肢致死性骨发育不全等的基因突变检测，进而辅助临床确诊该类疾病，同时还为研究COMP基因突变与基因功能之间的关系以及基因型与表型之间的相互关系奠定基础。

附图说明

图1为对11例软骨发育不全患者基因检测结果；

其中：A、8例患者存在1138G>GA杂合突变，该突变导致氨基酸残基380位甘氨酸由精氨酸替代的检测结果图；

B、1例患者存在1388C>CT杂合突变，该突变导致450位苏氨酸由甲硫氨酸替代的检测结果图；

C、1例患者存在1620C>CG杂合突变，该突变引起540位点天冬氨酸被赖氨酸所替代的检测结果图；

D、1例患者存在1620C>CA杂合突变，该突变引起540位点天冬氨酸被赖氨酸所替代的检测结果图。

具体实施方式

为详细说明本发明的技术内容、所实现的目的及效果，具体实施方式说明如下。

试剂来源

全血基因组DNA提取试剂盒购自Omega公司；

2.5mM dNTP混合物、5U/μl Taq DNA聚合酶、10×PCR反应缓冲液均来自TakaRa公司；

1U/μl SAP与10U/μl ExoI购自NEB公司；

BigDye 3.1测序溶液、Na₂EDTA﹒2H₂0、去RNase与DNase水与Hi-Di甲酰胺均购自ThermoFisher Scientific公司；

无水乙醇购自国药集团；

琼脂糖为西班牙进口；引物由华大基因合成。

实施例1

根据NCBI GeneBank数据库分析FGFR3基因mRNA序列，进行第2到第19外显子扩增引物的设计。扩增区域包括FGFR3全部外显子及其外显子与内含子交界处不少于50bp的内含子序列。PCR扩增中所采用引物核苷酸序列如表1所示。

表1

实施例2

一种用于检测FGFR3基因突变的试剂盒，包括：

上述用于检测FGFR3基因突变的由第2至第7外显子以及第9至第19外显子的PCR扩增引物组成的引物组；

PCR扩增试剂：2.5mM dNTP，含Mg²⁺的10×PCR缓冲液，5U/μl Taq DNA聚合酶，去RNase与DNase水；其中各溶液工作浓度分别为200μM，1×PCR缓冲液，0.025U/μl；

PCR产物纯化试剂：1U/μl SAP酶，10U/μl ExoI酶，去RNase与DNase水；其中SAP酶工作浓度为0.05U/μl，ExoI酶工作浓度为0.5U/μl。

DNA测序试剂：上述用于检测FGFR3基因突变的测序引物组、BigDye 3.1混合液，0.125M EDTA溶液，无水乙醇，体积百分比75％乙醇溶液、Hi-Di去离子甲酰胺溶液、去RNase与DNase水；测序引物组中的测序引物工作浓度为0.64pMol/L。

本试剂盒于-20保存，尽量减少反复冻融。

实施例3

利用上述用于检测FGFR3基因突变的试剂盒进行人FGFR3基因突变检测方法，步骤如下：

(1)外周血基因组DNA的提取

采集患者外周血5ml，采用Omega公司DNA提取试剂盒(D3392-01)进行全血基因组DNA的提取，采用NanoDrop 2000/2000c分光光度计进行DNA浓度和纯度测定；具体操作步骤条件参见产品说明书；

(2)PCR扩增

PCR反应体系为20μl，其中包括：

10×PCR Buffer 2μl，2.5mM dNTP 1.6μl，Taq DNA聚合酶0.1μl，5μM上游引物1.6μl，5μM下游引物1.6μl，DNA模板50ng-100ng，去RNase与DNase水补足至20μl。

采用BIO-RAD公司PIC-200型PCR仪，进行降落PCR，PCR反应条件如下：

94℃预变性5分钟；94℃变性20秒，62℃退火30秒，退火温度每一循环降低0.5℃，72℃延伸40秒，循环次数14；然后，94℃变性20秒，55℃退火30秒，72℃延伸40秒，循环次数21；72℃终延伸5分钟。

(3)PCR产物纯化

PCR纯化体系为20μl，其中包括：

PCR产物8μl，1U/μl SAP酶1μl，10U/μl ExoI酶1μl，去RNase与DNase水10μl。

反应条件为37℃消化60分钟，然后65℃灭活15分钟。产物纯化后经1％琼脂糖凝胶电泳或是微量核酸定量仪进行浓度测定。

(4)DNA测序反应及纯化

DNA测序反应的体系为10μl，包括4μl BigDye，3.2pMol/L测序引物2μl，5～20ng纯化的PCR物，用去RNase与DNase水补足至10μl。

反应条件为：

96℃10秒，50℃5秒，60℃4分钟，共28个循环反应。PCR循环完并冷却到4℃，取下并马上进行短时间离心。测序反应结束后将反应产物中加入2.5μl 0.125M的EDTA溶液,然后加入30μl无水乙醇，颠倒混匀后室温放置15分钟。在12000g离心10分钟后，移除上清。加入60μl体积百分比浓度为70％的乙醇溶液，4℃12000g离心15分钟后，移除上清。重复一次后，待乙醇挥发干净后将沉淀溶于10μlHi-Di甲酰胺。95℃变性4分钟后采用ABI3130XL测序仪进行测序分析。

(5)测序结果分析

测序结果采用Mutation Survey软件进行突变位点的识别。

实验例

采用实施例1至实施例3所述方法，对来自山东省立医院的11例临床诊断为软骨发育不全的患者进行了FGFR3基因检测，患者基本信息如表2。患者除具有身材矮小特征外，存在四肢粗短，头颅大，前额与顶骨圆凸，手指短小且呈“三叉戟”样，面中部发育不良等典型特征。

表2

对11例软骨发育不全患者基因检测结果表明(图1)，8例患者存在10号外显子1138G>GA杂合突变，该突变导致氨基酸残基380位甘氨酸由精氨酸替代(图1A)，1例患者存在1388C>CT杂合突变，该突变导致450位苏氨酸由甲硫氨酸替代(图1B)，1例患者存在1620C>CG杂合突变，该突变引起540位点天冬氨酸被赖氨酸所替代(图1C)，1例患者存在1620C>CA杂合突变，该突变引起540位点天冬氨酸被赖氨酸所替代(图1D)。

基因突变检测结果表明，来自临床的11例软骨发育不全患者均检测到FGFR3基因的突变，其中8例属于常见的1138G>GA(380G/GR)杂合突变。该结果与患者临床表型以及临床诊断结果相一致。

SEQUENCE LISTING

<110> 山东省医药生物技术研究中心

<120> 检测人FGFR3基因突变的引物组及其试剂盒

<160> 24

<170> PatentIn version 3.5

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<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成

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<213> 人工合成

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<212> DNA

<213> 人工合成

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ccatctggga ggggcac 17

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<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 6

tagtccctca gctgcctgtg 20

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<212> DNA

<213> 人工合成

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<212> DNA

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aactccacgt cgctgcc 17

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<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 9

tggacgtgct gggtgag 17

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<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 10

caacccctag acccaaatcc 20

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<211> 18

<212> DNA

<213> 人工合成

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tgaccaagtt ggcggtgg 18

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<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 12

cggccgtaag tcacaggatt 20

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<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成

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<212> DNA

<213> 人工合成

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accctaggct ctacatggtg a 21

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<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成

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tcattcaatg ctggtggaag 20

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<212> DNA

<213> 人工合成

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catacacccg tcccaggag 19

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<212> DNA

<213> 人工合成

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ctggaggtgg tggctctg 18

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<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 18

ggacacgggc tcctcag 17

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<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 19

ggtaggtgcg gtagcgg 17

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<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 20

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<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 21

acaagaagac gaccaacgtg a 21

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<212> DNA

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ccgccttatt cgggaacagc 20

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agcccttcag gctgttcc 18

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<211> 18

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 24

actgagtctc atgccggg 18