赋予植物黄萎病抗性的lrk2基因及其应用
【专利说明】赋予植物黄萎病抗性的LRK2基因及其应用 -、技术领域
[0001] 本发明提供了一个赋予植物黄萎病抗性的L服2基因及应用，属于植物基因工程领 域。用于通过植物基因工程技术改善植物抗病性和其他有益生产性状。 二、【背景技术】
[0002] 目前，生产上黄萎病危害十分严重，是棉花、番茄、辣椒、茄子等植物的主要真菌病 害，造成减产甚至绝收，尚无有效的防治措施。黄萎病的病原主要为大丽轮枝菌 (Ve;rticillium dahliae)，W微菌核(microsclerotia)形式长期存在于±壤中。黄萎病菌 在寄主植物上会表现出致病性差异，在与寄主相互作用、协同进化及生态环境差异的影响 下，常产生生理分化，出现新的致病类型。张天真等用RAP时旨纹图谱聚类分析将我国棉花黄 萎病菌株划分为8类，但是同一类中可能同时含有强中弱致病菌，说明黄萎病致病机制十分 复杂(张天真，2000)。另外，由转座子和DNA水平转移等引起黄萎病菌的遗传变异也限制了 棉花抗黄萎病育种(Amyotte SG，et al.,2012;de Jonge,et日1.,2012)。因此，克隆抗性基 因、解析抗病机制对抗黄萎病育种意义重大而迫切。
[0003] 然而，目前对黄萎病具有抗性的基因较少，尤其对棉花黄萎病具有稳定广谱高抗 的基因未见报道。Fradin等（2011)将番茄中Vel转化拟南芥，获得了对黄萎病菌的抗性，而 该基因转化烟草和棉花后，不具有黄萎病抗性，表明该基因在植物上的应用具有物种特异 性巧IJ琳琳等，棉花与番茄抗棉花黄萎病不依赖于Vel，中国科学:生命科学，2014(44)卷第8 期：803-814)。从抗黄萎病海岛棉品种H7124中克隆了与番茄Vel基因 （Fradin et al.， 2009)和棉花加 Ve基因 （Zhang et al. ,2011)部分同源的化vel基因，该基因也具有典型的 植物抗病蛋白结构域，利用VIGS沉默加 ve 1基因可使海岛棉H7124对黄萎病的抗性丧失;并 且，Gbvel基因转化拟南芥和陆地棉的结果都表明化vel基因对强致病力的落叶型和非落叶 型黄萎病菌都具有抗性(Zhang et al.，2012a)，但是并未获得高抗黄萎病品种。除了Ve基 因外，一些下游防卫相关基因也用于抗黄萎病防治研究。过量表达AtNPRl基因的转基因棉 花对非落叶型黄萎病具有抗性，但是对落叶型黄萎病不具有抗性(Par化i et al.2010)。另 夕h水稻黄单胞菌harpin蛋白、几下质酶基因、脂质转移酶基因、天麻抗真菌蛋白、抗菌肤、 防御素（目-DefensinsKMiao et al.，2010;Munis，2010;Ni Μ et al.，2013)也对黄萎病表 现出一定的抗性，但是由于防卫基因的过量表达对植物生长发育带来一些不利影响、W及 抗性效果未达到预期目标等，从而限制了运些基因在生产上的应用。
[0004] 本研究通过陆地棉高抗黄萎病品种奥3503的转录组进行分析，发现一个受黄萎病 侵染诱导表达的基因 LRK2，该基因与雷蒙德氏棉LYK2-Like基因 （Gossypium raimondii protein LYK2-like，登录号XM_012602491)相似度98%，W该基因的序列为模板设计引物 将L服2基因克隆，并将该基因转化拟南芥，获得的转基因拟南芥植株对落叶型W及非落叶 型菌系均具有较高的抗性。棉花黄萎病抗性基因 LRK2的分离可W进一步丰富抗性基因资 源，对其功能研究为该类基因的进一步利用奠定基础。 Ξ、
【发明内容】
[000引技术问题
[0006] 本发明的目的是:提供了一个赋予植物黄萎病抗性L服2基因的应用，该基因编码 一个表面受体蛋白，受黄萎病病原菌诱导后表达量显著增加。该基因表达可W显著提高受 体植物对落叶黄萎病病原菌V991W及非落叶型黄萎病菌ΒΡ2的抗性。可W利用本发明基因 构建成各种植物表达载体，应用于农业生物技术育种W提高作物抗病性状。
[0007] 技术方案
[000引赋予植物黄萎病抗性的L服2基因，其序列为SEQ ID NO. 1。该基因来源于陆地棉品 种奥3503"LRK2基因完整编码框长度为2016个碱基，编码蛋白含671个氨基酸，分子量为 74邸，等电点为7.85。
[0009] 本发明还提供了含有本发明基因的表达载体和宿主菌W及扩增该基因的任一片 段的引物。
[0010] 本发明赋予植物黄萎病抗性的L服2基因，该基因受棉花黄萎病强致病力菌株V991 (徐荣旗，汪佳妮，陈捷胤等.棉花黄萎病菌T-DNA插入突变体表型特征和侧翼序列分析.中 国农业科学，2010，43(3):489-496)的诱导后表达量增加，将L服2与pCambia2301 (上海北诺 生物科技有限公司）载体构建植物表达载体转化拟南芥，结果该基因对棉花黄萎病强致病 力落叶型菌株V991W及强致病力非落叶型菌株BP2均具有较高抗性。可W利用本发明基因 构建成各种植物表达载体，应用于农业生物技术育种W提高黄萎病相关寄主植物的抗病性 状或用在棉花黄萎病抗性改良中。
[0011] L服2的功能研究可为掲示其表达调控机理W及具体功能打下基础，还可应用于植 物抗病基因工程W及抗逆性的基因工程改良中。
[0012] 所述LRK2基因在拟南芥植物黄萎病抗性中的的应用。包括：
[0013] 1 )LRK2基因的克隆W及植物表达载体的构建
[0014] W陆地棉品种奥3503的cDNA为模板，用引物
[0015] P1:5 '-TGCTCTAGAATGGCATCTGTAATGAGTAA-3 '，
[0016] P2:5 '-CGCGGATCCTCACAGATTGGATGTTGTG-3 '
[0017] 扩增得到2016bp片段，将该片段命名为LRK2，PCR产物纯化后用Xbal/BamHI酶切， 连接到pCambia2301载体，测序后成功构建的重组载体命名为pCambia2301: L服2; 2)转基因 植株的获得
[0018] 将步骤1)中构建好的pCambia2301:L服2质粒用冻融法转化农杆菌LBA4404,用薩 花法转化拟南芥，当代的拟南芥植株为TO代，收获的种子为T1代，T1代种子在含25mg/mL卡 那抗生素的1/2MS培养基上筛选，获得候选的阳性T1植株，分别在DNA和RNA水平上检测目的 基因是否转入W及是否成功表达：
[0019]用引物
[0020] P3:5 '-CAGGATCTCAGAATGCCGGA-3 '
[0021 ] P4:5 ' -TGCCCTTMTTCATCTGCGC-3 '
[0022] 扩增候选的阳性T1代植株的DNA和cDNA进行PCR鉴定，在DNA和cDNA水平均能扩增 获得821bp大小片段的T1植株则为成功转化L服1的阳性转基因植株。收获的种子为T2代。T2 代阳性转基因植株在含25mg/mL卡那抗生素的1/2MS培养基上生长，且具有黄萎病抗性。
[0023] 有益效果
[0024] 1.本发明获得了一个全新的赋予植物黄萎病抗性的L服2基因。本发明获得的L服2 基因来源于陆地棉品种奥3503,该基因受棉花黄萎病病原菌诱导后表达量明显上升。将 LRK2与构建植物表达载体转化拟南芥，结果该基因在转基因植株中表达后对落叶型强致病 力黄萎病菌V991和非落叶型强致病力黄萎病菌BP2均具有较强的抗性，平均发病率分别为 18.95%、16.6%，而对照野生型的发病率分别为61.20%、55.70% dL服2的分离可W进一步 丰富抗性基因资源，其功能研究为该类基因的进一步利用奠定基础。
[002引2.本发明有助于更好地了解抗病基因的作用机制。L服2的克隆为进一步了解病原 菌与抗病基因互作，抗病信号传导通路奠定基础。LRK2是怎样将抗性信号传导的，此基因参 与了哪些信号传导过程，可W利用该基因的转基因植株进行进一步分析，从而获得抗性信 号传导通路。LRK2的分离W及功能鉴定为研究抗病基因的作用机制奠定基础。
[0026] 3.本发明应用于黄萎病抗性育种。L服2抗性效果良好，对测试的落叶型黄萎病菌 系V991和非落叶型黄萎病菌系BP2,发病率均低于20%，而对照的发病率在50% W上，大幅 提高了对黄萎病的抗性，在育种中有较大的应用价值。 四、
【附图说明】
[0027] 图1落叶型黄萎病菌系V991和非落叶型菌系BP2处理陆地棉品种奥3503后LRK2的 表达。
[002引图2 L服2转基因植株的DNA水平分子检测。M，MarkerDWT为未转化植株;L服2为卡 那霉素筛选出的抗性转化株。
[0029] 图3 L服2转基因植株的RNA水平检巧UdWT为未转化植株;L服2为卡那霉素筛选出的 抗性转化株。上排WcDNA为模板，L服2引物扩增，下排是内参Actin引物扩增。
[0030] 图4落叶型黄萎病菌系V991和非落叶型菌系BP2接种L服2转化植株和对照株的发 病率调查。WT为未转化植株，LRK2为转化株。
[0031] 图5落叶型黄萎病菌系V991和非落叶型菌系BP2接种L服2转化植株和对照株的表 型。WT为未转化植株，LRK2为转化株。
[0032] 图6落叶型黄萎病菌系V991和非落叶型菌系BP2接种L服2转化植株和对照株的相 对菌丝含量。WT为未转化植株，LRK2为转化株。 五、
【具体实施方式】
[0033] 下述实施方式中所用方法如无特别说明均为常规方法，所用引物序列均由上海英 驗生物技术有限公司合成。本实验中基因来源于陆地棉品种奥3503(Gossypium hirsutum) (刘小双，刘廷利，袁洪波，张保龙，王荣富.棉花钢尿肤基因化PNPl的耐旱功能分析.中国农 业科学，2015,48(12): 2306-2316)。
[0034] (一)棉花LRK2克隆W及序列分析
[003引根据雷蒙德氏棉LYK2-L;Lke基因 （Gossypium raimondii ,protein LYK2-like，登 录号XM_012602491)设计引物
[0036] P1:5'-TGCTCTAGAATGGCATCTGTAATGAGTAA-3'，
[0037] P2:5 '-CGCGGATCCTCACAGATTGGATGTTGTG-3 '
[003引 w陆地棉品种奥3503的cDNA模板扩增，在25μ1反应体系中加入cDNA模板化1，引物 各5nmol，扣 1 SXprimeSTAR buffer(Mg2+plus)PCR缓冲液，0.2mM dNTP，lU primeSTAR HS DM Polymerase(TaKaRa公司）进行PCR扩增。PCR扩增条件为：94°C 3'后94°C 45"，56°C 45"，72°C 2/，循环36次，再72°C延伸l0/ dPCR产物在1%的琼脂糖凝胶上检测，得到片段为 2016bp，将该片段命名为L服2基因，其序列为SEQ ID N0.1。将该片段进行末端加 A处理(北 京天恩泽基因科技有限公司）并与pGEM-T easy载体(Promega公司）连接。连接产物用JM109 (北京全式金生物技术有限公司)感受态细胞进行热激转化。测序由上海英驗生物工程公司 完成，成功构建的质粒命名为pGEM-T easy:LRK2。用DNA club进行基因开放阅读框的确定， 用DNAMAN进行序列比较分析，同时利用网上数据库化ttp://www.ncbi .nlm.nih. gov/)进行 BLAST分析。数据库ExPASy化ttp: //cn. expasy. org/)进行