检测β-内酰胺抗生素抗性的细菌的诊断方法
【专利说明】检测β-内醜胺抗生轰抗性的细菌的诊断方法 发明领域
[0001] 本发明设及分子诊断、特别是用于确定生物样品中的β-内酷胺抗性细菌的存在的 领域。
[0002] 发明背景 细菌对抗微生物药诸如抗生素的抗性在全世界是严重且正在发展的健康问题。在革兰 氏阴性细菌间，抗药性的最突出原因是β-内酷胺酶的出现，所述β-内酷胺酶破坏β-内酷胺 抗生素的β-内酷胺环。超广谱β-内酷胺酶巧SBUW-内酷胺酶的重要亚群)能够赋予对机构 和口诊护理中使用的最常见的β-内酷胺抗生素(诸如青霉素类、头抱菌素类和单环内酷胺 类)的抗性。ESBL也可W赋予对非β-内酷胺抗生素诸如哇诺酬类、氨基糖巧类和甲氧节氨喀 晚的多药抗药性，缩小了治疗选项。
[0003] 产生ES化的细菌最初在1980年代早期发现于住院患者间，特别是重症监护病房中 的最脆弱的患者，但现在也在基于社区的患者间传播。相关感染症状主要包括尿路感 染，其次包括腹腔内感染。逃至血流后，产生ES化的细菌可导致败血症或其他严重到足W需 要住院治疗的感染。
[0004] 迄今在世界上已经鉴定了超过十种不同类型的ES化。到目前为止，TEM和細V酶已 经形成最常见的ES化类型，但从21世纪开始，已经越来越清楚的是，ES化类型的流行率的变 化正在发生。CTX-M酶已经在很大程度上代替且在数量上超过其他类型的ES化，且现在被认 为是临床上最重要亚类的ES化。
[000引据推测，编码CTX-M的blacTX-M基因源自克吕沃尔氏属种化luyvera SPP)的染色体 编码的酶，但如今作为具有在不同的细菌种群之间移动的能力的质粒缀合基因存在。 blacTX-M的初始载体包括大肠杆菌、肺炎克雷伯氏菌化lebsiella pneumoniae)、鼠伤寒沙口 氏菌（Salmonella typhimurium)和奇异变形杆菌（Proteus mirabilis)，但进一步携带 blacTx-M的细菌菌株越来越出现。迄今已经报道了超过124种不同的CTX-M类型。对于CTX-M类 型的精确分类没有一致意见，但根据D'Amlrea (Int.J.Med., 2013.印刷前电子出版），主 要的CTX-M组群是CTX-M-1、-2、-8、-9、-25和KLUC。各亚组内的氨基酸变化小于5 %，而组群 间的变化为至少10%。
[0006] ES化产生者的检测和鉴定是至关重要的，不仅因为受感染患者的延迟识别和不适 治疗已经与增加的死亡率相关，而且还限制运些多药抗性微生物的传播。广泛使用的灵敏 性测试诸如纸片扩散和稀释抗微生物敏感性测试W及验证测试(大多基于克拉维酸和头抱 菌素之间的协同作用)便宜，且相对容易使用。然而，此类测试是费时的，且受困于有限的灵 敏度。
[0007] 在基因水平测定ES化代表用于鉴定和分型blacTX-M基因的替代方法。为此，已经开 发了许多基于PCR的测定法。此类测定法是精确和灵敏的，但其中许多需要一连串的扩增子 特异性测序引物W及PCR产物的劳动密集且耗时的分析，例如通过DNA测序。可W，至少部分 地，通过通用的简并CTX-M引物或通过采用如Birkett等人于J. Med. Microbiol., 2007, 56:52-55中所公开的基于实时PCR的方法(其允许PCR产物的同时扩增和分析)来避免运些 缺点。
[0008] 与在核巧酸水平鉴定blacTX-M基因型的方法相关的一个进一步缺点是伴随检测高 度同源的非blacTx-M基因序列，特别是产酸克雷伯氏菌的染色体K1基因，引起假阳性结果，因 此，有必要使用验证测试。
[0009] 专利公开US 2009/0163382公开了用于基于许多不同的抗生素抗性基因检测抗生 素抗性的细菌物种的基于微阵列的方法的引物和探针。然而，通过该方法仅检测到124种不 同的目前已知的CTX-M类型中的一部分。
[0010] 此外，Fu等人(J. Microbiol. Methods, 2012，89:110-118)公开了抗药基因检 测的DNA微阵列。该阵列含有来自17类抗药基因的总共115种探针。然而，通过该方法仅检测 到124种不同的目前已知的CTX-M类型中的一部分。
[0011] 为了确保患者安全性、ESMJ勺最佳治疗和扩散控制，本领域需要用于确定生物样 品中的ES化的存在的高度灵敏和特异的宽范围测定法。
[001引发明概述 在一个方面，本发明设及确定生物样品中的产生CTX-M的细菌的存在或不存在的方法。 所述方法包括W下步骤： a) 提供怀疑含有产生CTX-M的细菌的生物样品； b) 如果有的话，扩增所述样品中的编码CTX-M的DNA;和 C)使用至少一个探针检测扩增的DNA，所述探针与blacTx-M基因的区域杂交，所述区域 对应于CTX-M-15中的沈Q ID N0:23的核巧酸397-617的区域，且所述探针包含沈Q ID NO: 24或SEQ ID NO:72中记载的核酸序列的至少10个连续核巧酸； 其中步骤b)和C)可W单独或同时进行。
[0013] 在本方法的一些实施方案中，所述探针与blacTX-M基因的区域杂交，所述区域对应 于CTX-M-15中的SEQ ID NO: 23的核巧酸503-539的区域。本领域技术人员可W容易识别其 他CTX-M变体中的对应blacTX-M区域。换言之，本实施方案不限于与blacTX-M-15杂交的探针，但 涵盖与任何blacTX-M变体杂交的探针。
[0014] 在本方法的一些其他实施方案中，所述探针可W二分为5'-探针和3'-探针。在一 些又进一步实施方案中，所述5'-探针包含SEQ ID N0:34、35、或63中记载的核酸序列，和/ 或所述3'-探针包含SEQ ID NO:44、45、或70中记载的核酸序列。所述探针也可W与本文公 开的序列具有至少80%的序列同一性，只要它们保留它们在正常杂交条件下与blacTx-M基因 杂交的能力。
[0015] 在本方法的一些其他实施方案中，用包含SEQ ID NO: 1、2、或61中记载的核酸序列 的正向引物和包含SEQ ID NO: 11或12中记载的核酸序列的反向引物进行扩增步骤。
[0016] 所述引物也可W与本文公开的序列具有至少80%的序列同一性，只要它们保留它 们在正常PCR引物杂交条件下扩增blacTX-M基因的能力。
[0017] 在进一步方面，本发明提供分别能够扩增和杂交blacTX-M的寡核巧酸引物和探针。 所述探针可^包含与560 1〇^:34、35、44、45、63、或70中任一者中记载的序列或与560 1〇 NO:24或SEQ ID NO:72的至少10个连续核巧酸具有至少80%序列同一性的核酸序列，只要 它们保留它们在正常杂交条件下与blacTx-M基因杂交的能力。在一些实施方案中，还提供包 含至少Ξ种不同的寡核巧酸分子的寡核巧酸探针混合物，所述寡核巧酸分子彼此独立地各 自包含SEQ ID N0:24或SEQ ID N0:72中包含的核酸序列的至少10个连续核巧酸。在一些实 施方案中，衍生自SEQ ID NO:24或SEQ ID NO:72的探针可W作为二分的双探针存在。所述 引物，进而，可W包含与SEQ ID NO:l、2、ll、12、或61中记载的序列具有至少80%序列同一 性的核酸序列，只要它们保留它们在正常PCR引物杂交条件下扩增blacTx-M基因的能力。
[0018] 值得注意的是，关于本方法所公开的任何特征适用于本引物和探针，反之亦然，如 果适用的话。
[0019] 在W下附图、详述、实例、附表和从属权利要求中记载了本发明的其他方面、具体 实施方案、目标、细节和优点。
[0020] 附图概述 W下，将借助参考附图的优选实施方案更详细地描述本发明，其中 图1是说明基于馨合物互补的检测方法的原理的示意图（Karhunen等人，Anal. 化em.，2010, 82:751-754)。在图1A中，不存在目标寡核巧酸，因此，没有发生馨合物互补。 在图1B中，存在目标寡核巧酸，且在铜系元素-离子-载体-馨合物-缀合的探针和天线-缀合 的探针紧密接近结合至目标寡核巧酸之后能够馨合物互补。图2说明本引物在基于SYBR? Green I的PCR中的表现。在本实验中，分别使用SEQ ID N0:2和SEQ ID N0:12 (正方形）、 SEQ ID N0:2和SEQ ID N0:11 (圆形）、SEQ ID N0:1 和沈Q ID N0:12 (S角形）和SEQ ID NO:1和SEQ ID NO: 11 (菱形）的正向和反向引物混合物扩增初始10000个基因组拷贝的 CTX-M-9-组群-阳性巧屯、符号)或CTX-M-阴性(实屯、符号)大肠杆菌。无模板DNA的对照用上 面解释的符号显示于虚线中。显示用Ξ个平行反应获得的平均结果。RFU，相对巧光单位。 [0021 ] 图3说明K1扩增与blacTX-M扩增的区别。图3A显示用0(圆形）、1000(Ξ角形)或10000 (正方形)个基因组拷贝的CTX-M-1-组群-阳性的大肠杆菌或10000个基因组拷贝的产酸克 雷伯氏菌(叉形）的代表性反应的PCR扩增图。图3Β显示对应的扩增产物的解链曲线。叠加用 初始1000或10000个基因组拷贝的CTX-M阳性大肠杆菌的扩增产物的曲线。R即，相对巧光单 位。
[0022] 图4显示当两个独立的CTX-M-1-组群（圆形）、CTX-M-2-组群角形）或CTX-M-9- 组群-阳性(正方形）大肠杆菌样品、Ξ个独立的产酸克雷伯氏菌样品（叉形）和一个CTX-M- 阴性大肠杆菌样品（叉形）Wl〇〇〇〇个基因组拷贝/反应的量用作模板时作为Ξ个平行反应 的平均值的基于馨合物互补的PCR扩增图。在本实验中，SEQ ID N0:2和SEQ ID N0:11的引 物混合物与Eu-探针(SEQ ID NO:35)和天线-探针(SEQ ID NO:45)混合物(0.05 μΜ的各个 别探针)一起使用。仅CTX-M-阳性样品提供与背景信号可区别的信号。
[0023] 图5表明作为Ξ个独立反应的平均值的本诊断的基于馨合物互补的PCR方法的分 析灵敏度。来自CTX-M-1-组群-阳性（图5A)、CTX-M-2-组群-阳性（图5B)或CTX-M-9-组群-阳 性（图5C)大肠杆菌样品的DNAW10000(圈形）、1000(Ξ角形）、100(正方形）、10(菱形）、1(减 号）、〇.1(加号）、〇.〇1(无符号的线)或〇(叉形)个基因组拷贝/PCR反应用作模板。阔值循环 是其中反应信号超过阔值水平(信号背景比1.5)的PCR循环。
[0024] 图6呈现作为Ξ个独立反应的平均值的用SEQ ID NO:63的Eu-探针混合物和SEQ ID NO:70的天线-探针混合物用延伸的CTX-M变体目标种类的基于馨合物互补的PCR的分析 特异性的结果。Ξ十个CTX-M-阳性样品（叉形）W100个基因组拷贝/反应的量用作模板。二 十五个CTX-M-阴性样品（Ξ角形）W100 000个基因组拷贝/反应的量用作模板。仅CTX-M-阳 性样品产生与背景信号可区别的信号。
[002引图7说明作为Ξ个独立反应的平均值的用SEQ ID N0:63的Eu-探针混合物和SEQ ID NO:70的天线-探针混合物用延伸的CTX-M变体目标种类的基于馨合物互补的PCR的分析 灵敏度。来自CTX-M-2-组群-阳性样品的DNAW100 000(无符号的线）、10000(圈形）、1000 (Ξ角形）、100(正方形）、10(菱形）、1(减号）、0.1(加号）或0(叉形)个基因组拷贝/PCR反应 用作模板。用CTX-M-1-组群、CTX-M-8-组群、CTX-M-9-组群或CTX-M-25-组群-阳性样品获得 了类似的结果。
[0026] 图8表明使用CTX-M-2-阳性细胞作为模板用细菌细胞的用SEQ ID ^:63的611-探 针混合物和SEQ ID N0:70的天线-探针混合物用延伸的CTX-M变体目标种类的基于馨合物 互补的PCR的表现。该图的数据点代表Ξ个独立反应的平均值。在分析之前不从细菌细胞分 离DNA，但将细胞W300 000 (无符号的线）、30000(圈形）、3 000(Ξ角形）、300 (正方形）、30 (菱形）、3(减号）、0.3(加号）或0(叉形)个菌落形成单位/PCR反应完整地作为模板添加至 PCR反应。
[0027] 发明详述 本发明设及用于确定生物样品中的产生0-内酷胺酶、尤其是超广谱0-内酷胺酶巧SBL) 的细菌的存在的方法和装置。更具体地，产生ES化的细菌是产生CTX-M的细菌。
[0028] 如本文所使用，术语"超广谱β-内酷胺酶"或巧SBL"是指能够通过降解所有β-内酷 胺抗生素共有的β-内酷胺环结构提供对β-内酷胺抗生素诸如青霉素类、头抱菌素类(例如， 头抱嚷朽、头抱曲松、头抱他晚、头抱化朽和氧基亚氨基-单酷胺氨曲南)和单环内酷胺的抗 菌特性的抗性或使0-内酷胺抗生素诸如青霉素类、头抱菌素类(例如，头抱嚷朽、头抱曲松、 头抱他晚、头抱化朽和氧基亚氨基-单酷胺氨曲南）和单环内酷胺的抗菌特性失活的任何 酶。
[0029] 如本文所使用，术语乂ΤΧ-Μ"是指ES化的亚组的任何成员，即比其他氧基亚氨基头 抱菌素具有显著更大的针对头抱嚷目亏的活性的质粒编码的酶。本领域技术人员理解，术语 乂 ΤΧ-Μ"