免疫刺激性质粒的制作方法

免疫刺激性质粒的制作方法
【专利摘要】本发明涉及免疫调节剂组合物和使用方法以及制备方法。所述免疫调节剂组合物包含能够引发受体个体中的免疫应答的免疫刺激性质粒或DNA序列。另外，所述免疫刺激性质粒或DNA序列不含抗生素抗性编码序列以帮助降低群体中抗生素抗性的水平转移的可能性。
【专利说明】免疫刺激性质粒 发明领域
[0001] 本发明总体涉及免疫刺激性质粒。所述质粒不包含抗生素抗性基因。所述质粒可 以包含不是抗生素抗性基因的可选择或可筛选的标记基因（例如，lacz基因）。或者，所述质 粒可以缺乏任何可选择或可筛选的标记基因。
[0002] 发明背景 与脊椎动物DNA中相比，非甲基化的CpG基序频繁得多地存在于细菌DNA中。这些基序激 活宿主防御机制，并且导致固有和获得性免疫应答。CpG基序及其免疫刺激作用综述于 Krieg, Ann. Rev. Immunol. 20:709-760 (2002)。
[0003] 先前开发了含有许多CpG基序的免疫刺激性质粒，并且已经证明，当以包含该质粒 和阳离子脂质体递送媒介物的免疫调节剂组合物的形式施用于禽类和牛科动物物种时，有 效地引发免疫应答是有效的。参见美国专利申请公开号2012/0064151 A1 (禽类物种）和 2013/0295167 Al(牛科动物物种），其两者的内容以其整体通过引用并入本文。该质粒， PMB75.6,长度为4242 bp，并且含有288个CpG二核苷酸。pMB75.6的图谱示于图1中，并且 PMB75.6的核苷酸序列提供为SEQ ID N0: 2。如美国专利申请公开号2012/0064151中所述， 含有PMB75.6的免疫调节剂组合物当卵内施用时引发非抗原特异性免疫应答，其保护鸡免 于感染性疾病。至少一种生物试剂诸如疫苗的施用进一步增强该非抗原特异性免疫应答。 此外，发现含有PMB75.6质粒的免疫调节剂组合物具有佐剂作用并引发疫苗效力的增加。类 似地，如美国专利申请号2013/0295167中所述，含有pMB75.6的免疫调节剂组合物在牛中引 发非抗原特异性免疫应答，其保护牛免于感染性疾病。
[0004] 然而，如图1中所示，PMB75.6质粒含有卡那霉素抗性基因（KanR)。由于关于抗生素 抗性基因水平转移至环境中的细菌的担忧，基于抗生素的选择和生产系统变得越来越不受 欢迎。对于直接施用于个体的载体(例如，用于基因疗法或DNA疫苗接种的免疫刺激性质粒 诸如PMB75.6或载体），抗生素抗性基因的潜在水平转移特别使人担忧。因此，本领域中需要 能够在个体中引发免疫应答、同时也缺乏抗生素抗性基因的免疫刺激性质粒。
[0005] 发明概述 本发明涉及免疫刺激性质粒。所述免疫刺激性质粒可以包含与SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 4或其组合的序列具有至少89%序列同一性的核酸序列。在一些方面，所述免疫刺激性 质粒可以包含与SEQ ID N0: 4的序列具有至少84%序列同一,性的核酸分子。在一些方面，所 述免疫刺激性质粒可以包含SEQ ID NO: 1的序列。在一些方面，所述免疫刺激性质粒可以 包含SEQ ID N0: 4的序列。
[0006] 在其它方面，所述免疫刺激性质粒可以由与SEQ ID NO: 1、SEQ ID N0: 4或其组 合的序列具有至少89%序列同一性的核酸序列组成。在一些方面，所述免疫刺激性质粒可 以由与SEQ ID N0: 4的序列具有至少84%序列同一性的核酸分子组成。在一些方面，所述免 疫刺激性质粒可以由SEQ ID NO: 1的序列组成。在一些方面，所述免疫刺激性质粒可以由 SEQ ID N0: 4的序列组成。
[0007] 在一些方面，所述免疫刺激性质粒优选不包含编码全长或功能性可选择或可筛选 的标记物的核酸序列。在其它方面，所述免疫刺激性质粒包含编码不是抗生素抗性基因的 可选择或可筛选的标记物的核酸序列。
[0008] 本发明还涉及包含本文所述的免疫刺激性质粒或DNA序列中的任一种以及药学上 可接受的载体的药物制剂。
[0009] 本发明还涉及包含阳离子脂质体递送媒介物以及本文所述的免疫刺激性质粒或 DNA序列中的任一种的免疫调节剂组合物。
[0010] 在一些方面，本发明涉及使用本文所述的免疫刺激性质粒或DNA序列的方法。合适 的使用方法包括对个体进行治疗性施用。此类治疗性施用包括对一个或多个个体的预防性 治疗、整体预防性治疗和感染后治疗。
[0011] 本发明涉及刺激或引发个体中的免疫应答的方法。在一些方面，所述方法包括通 过向个体施用本文所述的免疫调节剂组合物而刺激该个体中的免疫应答。在一些方面，所 述方法包括通过向个体施用本文所述的免疫刺激性质粒或DNA序列而刺激该个体中的免疫 应答。
[0012] 其它目标和特征将是一部分显而易见的，而一部分在下文中指出。
[0013] 附图简述 以下附图形成本说明书的部分，并且被包括以进一步说明本发明的某些方面。本发明 可以通过参考这些附图中的一个或多个并结合本文提供的具体实施方案的详细描述而更 好地理解。
[0014] 图1显示PMB75.6质粒的图谱； 图2显示pGCMB75.6质粒的图谱； 图3显示pLacZ75.6质粒的图谱;而， 图4图示说明本文所述的免疫调节剂组合物提高了用致病病毒攻击的受体个体的存活 率（图4A和图4B)。
[0015] 发明详述 根据本发明，已经发现了能够引发受体个体中的免疫应答的组合物，以及使用方法。具 体而言，本发明涉及新型核酸组合物或免疫调节剂组合物及其用途。已经发现，此类免疫调 节剂组合物可以包含本文所述的具有提尚的GC含量、CpG基序且在不包含抗生素抗性基因 或编码序列的情况下增殖的DNA序列。本发明的核酸序列可用于刺激或增强个体中的免疫 应答以预防或治疗感染性疾病，其与本领域中已知的其它预防和治疗方法相比具有显著提 高的安全性。本发明尤其可用于治疗和预防由微生物引起的感染性疾病，所述微生物诸如， 但不限于，病毒、细菌、霉菌、真菌、酵母、寄生虫和本领域中已知的其它微生物。下面更详细 讨论了所述免疫调节剂组合物的组成及使用方法。
[0016] I.组合物 可用于本发明中的组合物，诸如本文所述的那些，通常能够用作针对感染性疾病的预 防性疗法、整体预防性疗法或治疗疗法。此类组合物在本文中被称为免疫调节剂组合物。所 述免疫调节剂组合物包含至少一种能够引发受体个体中的免疫应答的免疫刺激性质粒或 免疫刺激性DNA序列。在一些方面，所述免疫调节剂组合物也可以包含脂质体递送媒介物。
[0017] A.核酸 在一些方面，本发明涉及可用于治疗或预防感染性疾病致病剂的核酸分子。本文所述 的核酸分子可以包含在免疫刺激性质粒中，以线性双链或单链DNA、氨基酸序列、核糖核酸 (RNA)或其组合的形式。在一些方面，本发明涉及含有免疫刺激性质粒或免疫刺激性DNA序 列的核酸分子、载体和宿主细胞(体外、体内或尚体）。
[0018]在一些方面，本发明涉及不包含抗生素抗性基因的免疫刺激性质粒或DNA序列。所 述质粒可以缺乏任何可选择或可筛选的标记基因。例如，本文所述的PGCMB75.6质粒不包含 任何全长或功能性可选择或可筛选的标记基因。PGCMB75.6的序列提供于SEQ ID NO: 1中。
[0019] 在一些方面，本文所述的免疫刺激性质粒优选不包含编码全长或功能性可选择或 可筛选的标记物的核酸序列。在一些方面，所述免疫刺激性质粒不包含抗生素抗性基因。例 如，所述质粒不包含卡那霉素抗性基因。在一些方面，本文所述的质粒优选不编码免疫原。
[0020] 在一些方面，所述免疫刺激性质粒可以包含编码不是抗生素抗性基因的可选择或 可筛选的标记基因的核酸序列。例如，本文所述的pLacZMB75.6质粒包含LacZ基因作为可筛 选的标记物。pLacZMB75.6的图谱提供于图3中，并且pLacZMB75.6的核苷酸序列提供为SEQ ID N0: 4。如图3中所示，pLacZMB75.6类似于pGCMB75.6，但含有LacZ可筛选的标记物。 [0021]应当理解的是，可以在不显著不利影响其免疫刺激性特性的特定程度上改变 PGCMB75.6或pLacZMB75.6质粒的核苷酸序列。在一些方面，本发明涉及包含与pGCMB75.6 (SEQ ID NO: 1)的序列具有至少89%序列同一性的核酸序列的免疫刺激性质粒。所述免疫 刺激性质粒优选包含与PGCMB75.6 (SEQ ID NO: 1)的序列具有至少90%、至少91%、至少 92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列同一性的核酸 序列。在一些方面，所述免疫刺激性质粒更优选包含PGCMB75.6 (SEQ ID NO: 1)的序列。 [0022] 在一些方面，本发明涉及包含与pLacZMB75.6 (SEQ ID N0: 4)的序列具有至少 8 4 %序列同一性的核酸序列的免疫刺激性质粒。所述免疫刺激性质粒优选包含与 pLacZMB75.6 (SEQ ID N0: 4)的序列具有至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、 至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少 99%序列同一性的核酸序列。在一些方面，所述免疫刺激性质粒更优选包含pLacZMB75.6 (SEQ ID NO: 4)的序列。
[0023] 在一些方面，本发明涉及由与pGCMB75.6 (SEQ ID NO: 1)的序列具有至少89%序 列同一性的核酸序列组成的免疫刺激性质粒。所述免疫刺激性质粒优选由与PGCMB75.6 (SEQ ID NO: 1)的序列具有至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少 96%、至少97%、至少98%或至少99%序列同一性的核酸序列组成。在一些方面，所述免疫刺激 性质粒更优选由PGCMB75.6 (SEQ ID NO: 1)的序列组成。
[0024] 在一些方面，本发明涉及由与pLacZMB75.6 (SEQ ID N0: 4)的序列具有至少84% 序列同一性的核酸序列组成的免疫刺激性质粒。所述免疫刺激性质粒优选由与 pLacZMB75.6 (SEQ ID N0: 4)的序列具有至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、 至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少 99%序列同一性的核酸序列组成。在一些方面，所述免疫刺激性质粒更优选由pLacZMB75.6 (SEQ ID NO: 4)的序列组成。
[0025] 本发明的另一个重要方面提供了能够刺激免疫应答的免疫刺激性DNA序列或免疫 刺激性质粒，其包括在高严格条件下与SEQ ID NO: 1或SEQ ID N0: 4杂交的核酸序列。合 适的核酸序列包括与本发明的核酸同源、基本上类似或相同的那些。在一些方面，同源的核 酸序列将与SEQ ID NO: 1或相应的互补序列具有至少约89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、 96%、97%、98%、99%或100%的序列相似性。在其它方面，同源的核酸序列将与3￡〇10勵：4或 相应的互补序列具有至少约 84%、85%、86%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、 98%、99%或100%的序列相似性。可以使用本领域中已知的许多算法，诸如Altschul，S. F.， 等人，J. Mol. Biol. 215:403-10，1990中描述的BLAST，以计算序列相似性。所述核酸可 以由于遗传密码的简并性而与上述核酸在序列上不同。通常，参考序列将为18个核苷酸，更 通常为30或更多个核苷酸，并且可以包含组合物的整个核酸序列用于比较目的。
[0026] 本文设想了可以与SEQ ID NO: 1或SEQ ID N0: 4杂交的核苷酸序列。严格杂交条 件包括条件诸如在50°C或更高以及0.1X SSC (15 mM氯化钠/1.5 mM柠檬酸钠)下的杂交。 另一个实例是在42°C在50%甲酰胺、5X SSC (150 mM NaCl，15 mM梓檬酸三钠）、50 mM磷酸 钠(pH 7.6)、5X Denhardt氏溶液、10%硫酸葡聚糖和20 μg/ml变性、剪切的鲑鱼精DNA的溶 液中温育过夜，随后在0.1 X SSC中在约65°C下洗涤。示例性严格杂交条件是严格性为上述 特定条件的至少约80%、85%、90%或95%的杂交条件。其它严格杂交条件是本领域中已知的， 并且也可以用于鉴定本发明的核酸的同源物（Current Protocols in Molecular Biology, Unit 6, pub. John Wiley & Sons, N.Y. 1989)〇
[0027]可以使用本文所述的DNA分子的突变体核苷酸，只要突变体包含维持刺激如本文 所述的免疫应答的能力的核酸序列。此类突变的DNA序列通常相差一个或多个核苷酸或氨 基酸。序列变化可以是置换、插入、缺失或其组合。用于诱变克隆的基因的技术是本领域中 已知的。用于位点特异性诱变的方法可见于Gustin等人，Biotechniques 14:22，1993; Barany，Gene 37:111-23，1985; Colicelli等人，Mol. Gen. Genet. 199:537-9， 1985;和Sambrook 等人，Molecular Cloning: A Laboratory Manual, CSH Press 1989， pp. 15.3-15.108，并且所有都通过引用并入本文。总之，本发明涉及能够刺激个体中的免 疫应答的核酸序列及其变体或突变体。本发明也涵盖了由所述核酸序列编码的中间RNA，以 及编码的任何所得氨基酸序列。
[0028]当免疫刺激性质粒的核苷酸序列与SEQ ID NO 1和4中提供的序列不同时，所述质 粒中的CpG二核苷酸优选保持完整。或者，如果改变质粒的核苷酸序列、使得CpG二核苷酸被 消除，则可以在另一位置改变质粒的序列，使得质粒中的CpG二核苷酸的总数保持相同。除 了PGCMB75.6或pLacZMB75.6的核苷酸序列中已经存在的那些以外，另外的CpG二核苷酸也 可以被引入质粒中。因此，例如，本文所述的免疫刺激性质粒优选包含至少约200、至少约 220、至少约240、至少约260、至少约270、至少约275、至少约280、至少约283、至少约285或至 少约288个CpG二核苷酸。例如，所述免疫刺激性质粒可以包含283个CpG二核苷酸。
[0029] 具体而言，本发明涉及包含本文所述的免疫刺激性质粒或DNA序列中的任一种以 及药学上可接受的载体的药物制剂。
[0030] B.免疫调节剂 适合与本文所述的免疫刺激性质粒一起使用的免疫调节剂组合物描述于美国专利申 请公开号2012/0064151 A1(禽类物种)和2013/0295167 Al(牛科动物物种），其两者的内容 以其整体通过引用并入本文。
[0031 ]所述免疫调节剂组合物包含脂质体递送媒介物以及本文所述的免疫刺激性质粒 或DNA序列中的至少一种。
[0032] 合适的脂质体递送媒介物包含能够将核酸分子递送至被治疗个体的组织的脂质 组合物。脂质体递送媒介物优选能够在个体中保持足够长时间的稳定以递送核酸分子和/ 或生物试剂。例如，所述脂质体递送媒介物在受体个体中稳定至少约五分钟、至少约1小时 或至少约24小时。
[0033] 本发明的脂质体递送媒介物包含能够与细胞的质膜融合以便将核酸分子递送入 细胞的脂质组合物。当核酸分子编码一种或多种蛋白时，核酸:脂质体复合物优选具有至少 约1皮克(pg)表达的蛋白/毫克(mg)总组织蛋白/微克(yg)递送的核酸的转染效率。例如， 核酸:脂质体复合物的转染效率可以是至少约10 pg表达的蛋白/mg总组织蛋白/yg递送的 核酸;或者至少约50 pg表达的蛋白/mg总组织蛋白/yg递送的核酸。复合物的转染效率可以 低至1毫微微克(fg)表达的蛋白/mg总组织蛋白Axg递送的核酸，上述量是更优选的。
[0034]本发明优选的脂质体递送媒介物直径为约100至500纳米(nm)。例如，所述脂质体 递送媒介物的直径可以为约150至450 nm或者约200至400 nm〇
[0035] 合适的脂质体包括任何脂质体，诸如常用于，例如，本领域技术人员已知的基因递 送方法中的脂质体。优选的脂质体递送媒介物包含多层脂质体(multilamellar vesicle， MLV)脂质和挤出脂质。用于制备MLV的方法是本领域熟知的。更优选的脂质体递送媒介物包 含具有聚阳离子脂质组合物的脂质体（即阳离子脂质体)和/或具有与聚乙二醇缀合的胆固 醇主链的脂质体。示例性阳离子脂质体组合物包含但不限于N-[l-(2,3-二油基氧基）丙 基]-N，N，N-三甲基氯化铵(D0TMA)和胆固醇、N-[卜(2,3-二油酰基氧基)丙基]-^^三甲 基氯化铵(D0TAP)和胆固醇、1-[2-(油酰基氧基）乙基]-2-油基-3-(2-羟乙基)咪唑啉鑰氯 化物(D0HM)和胆固醇、二甲基双十八烷基溴化铵(DDAB)和胆固醇以及其组合。用作递送媒 介物的最优选的脂质体组合物包含DOT頂和胆固醇。
[0036] 合适的核酸分子包括本文所述的任何免疫刺激性质粒。编码核酸序列编码蛋白或 肽的至少一部分，而非编码序列不编码蛋白或肽的任何部分。根据本发明，"非编码"核酸可 以包含转录单元的调节区，诸如启动子区。术语"空载体"可以与术语"非编码"互换使用，并 且具体是指不存在蛋白编码部分的核酸序列，诸如没有基因插入物的质粒载体。由本文所 述的质粒编码的蛋白的表达不是引发非抗原特异性免疫应答所必需的；因此所述质粒不需 要含有可操作连接至转录控制序列的任何编码序列。然而，可以通过在组合物中包含编码 免疫原和/或细胞因子的核酸序列(DNA或RNA)而获得另外的优点（即抗原特异的和增强的 免疫力）。此类编码免疫原和/或细胞因子的核酸序列可以包含于本文所述的免疫刺激性质 粒中，或者可以包含于所述组合物中的单独的核酸(例如，单独的质粒)中。
[0037]可以使用本领域标准的方法或美国专利号6,693,086(其内容以其整体通过引用 并入本文)描述的方法实现脂质体与本文所述的免疫刺激性质粒的复合。添加至脂质体的 质粒的合适浓度包括将足够量的质粒有效地递送至个体内、使得引发全身性免疫应答的浓 度。例如，约0.1 yg至约10 yg质粒可以与约8 nmol脂质体组合，约0.5 yg至约5 yg质粒可 以与约8 nmol脂质体组合，或者约1.0 yg质粒可以与约8 nmol脂质体组合。组合物中的质 粒与脂质的比率（yg质粒：nmol脂质）可以为以重量计至少约1:1质粒:脂质（例如，1 yg质 粒：1 nmol脂质）。例如，质粒与脂质的比例可以为至少约1:5,至少约1:10,或至少约1:20。 本文表述的比率基于组合物中阳离子脂质的量，而不是基于组合物中脂质的总量。本发明 的组合物中核酸与脂质的比率合适地为以重量计约1:1至约1:80质粒:脂质；以重量计约1: 2至约1:40质粒:脂质；以重量计约1:3至约1:30质粒:脂质；或者以重量计约1:6至约1:15质 粒:脂质。
[0038] C.生物试剂 除了本文所述的脂质体递送媒介物和至少一种质粒以外，本文所述的任何免疫调节剂 组合物还可以包含至少一种生物试剂。
[0039] 合适的生物试剂是有效预防或治疗禽类或牛科动物疾病的试剂。此类生物试剂包 括免疫增强剂蛋白、免疫原、疫苗、抗微生物剂或其任何组合。合适的免疫增强剂蛋白是已 知增强免疫的那些蛋白。作为非限制性实例，细胞因子(其包括一个蛋白家族），是已知增强 免疫力的蛋白家族。合适的免疫原是引发体液和/或细胞免疫应答的蛋白，使得向个体施用 免疫原获得针对在个体的组织内遇到的相同或类似蛋白的免疫原特异性免疫应答。免疫原 可以包括由细菌、病毒、寄生虫或真菌表达的致病性抗原。优选的抗原包括源自在个体中引 起感染性疾病的生物体的抗原。根据本发明，免疫原可以是天然存在或合成来源的蛋白的 任何部分，其引发体液和/或细胞免疫应答。因此，抗原或免疫原的大小可以是小至约5-12 个氨基酸，并且大至全长蛋白，包括这两者之间的任何大小。所述抗原可以是多聚体蛋白或 融合蛋白。所述抗原可以是纯化的抗原。或者，所述免疫增强剂蛋白或免疫原可以由所述免 疫调节剂组合物中所包含的免疫刺激性质粒或另一种核酸编码。当免疫增强剂蛋白或免疫 原由免疫调节剂组合物中的核酸分子编码时，编码免疫增强剂蛋白或免疫原的核酸序列可 操作连接至转录控制序列，使得在个体的组织中表达免疫原，由此在个体中引发除非特异 性免疫应答之外的免疫原特异性免疫应答。筛选免疫原性诸如病原体抗原免疫原性或细胞 因子活性的技术是本领域技术人员已知的，并且包括各种体外和体内测定法。
[0040] 当生物试剂是疫苗时，所述疫苗可以包括活的感染性的病毒的、细菌的或寄生虫 疫苗或者杀死的灭活的病毒的、细菌的或寄生虫疫苗。一种或多种疫苗(活的或杀死的病毒 疫苗)可以与本发明的免疫调节剂组合物组合使用。合适的疫苗包括本领域中已知的用于 禽类或牛科动物物种的那些。
[0041] 用于禽类物种的示例性疫苗包括而不限于本领域中用于针对以下进行保护的疫 苗:Marek氏病病毒(MDV)、新城疫病毒(NDV)、雏鸡贫血病毒(CAV)、感染性囊病病毒（IBDV)、 感染性支气管炎病毒(IBV)、火鸡疱疹病毒(HVT)、感染性喉气管炎病毒(ILTV)、禽脑脊髓炎 病毒(AEV)、禽痘病毒(FPV)、禽霍乱、禽流感病毒(AIV)、呼肠孤病毒、禽类白血性增生病毒 (ALV)、网状内皮组织增殖病毒(REV)、禽类腺病毒和出血性肠炎病毒(HEV)、球虫目以及本 领域中已知的其它疾病。在另一个实例中，所述疫苗可以是美国专利号5,427,791，6,048， 535和6,406,702描述的疫苗。例如，保护免于Marek氏病的疫苗可以与本发明的免疫调节剂 组合物组合使用。
[0042] 用于牛科动物物种的示例性疫苗包括而不限于本领域中用于针对以下进行保护 的疫苗:感染性牛鼻气管炎（IBR)(1型牛疱疹病毒(BHV1))、副流感病毒3型(PI3)、牛呼吸道 合胞病毒（BRSV)、牛病毒性腹泻病毒（BVDV 1型和2型）、睡眠嗜组织菌 so/zmi)、牛支原体以及本领域中已知的其它疾病。例如，用于针对溶血 曼海姆菌进行保护的疫苗可以与本发明的免疫调节剂组合物组合使用。
[0043] 所述生物试剂可以是抗微生物剂。合适的抗微生物剂包括:喹诺酮类，优选氟喹诺 酮类、0内酰胺类和大环内酯-林可酰胺类-链阳性菌素(MLS)抗生素。
[0044] 合适的喹诺酮类包括培诺沙星、宾氟沙星、西诺沙星、环丙沙星、克林沙星、达氟沙 星、二氟沙星、依诺沙星、恩诺沙星、氟罗沙星、吉米沙星、依巴沙星、左氧氟沙星、洛美沙星、 麻保沙星、莫西沙星、诺氟沙星、氧氟沙星、奥比沙星、帕珠沙星、普多沙星、培氟沙星、沙拉 沙星、司巴沙星、替马沙星和托氟沙星。优选的氟喹诺酮类包括环丙沙星、达氟沙星、恩诺沙 星、莫西沙星和普多沙星。合适的萘啶酮类包括萘啶酮酸。
[0045] 合适的0内酰胺类包括青霉素(例如，阿莫西林、氨苄青霉素、阿洛西林、苄星青霉 素、苄青霉素、羧苄青霉素、氯唑西林、可拉维酸[即阿莫西林/克拉维酸]、双氯西林、氟氯西 林、甲氧西林、美洛西林、萘夫西林、苯唑西林、苯氧甲基青霉素、哌拉西林、普鲁卡因青霉 素、替莫西林和替卡西林）；头孢菌素类(例如，头孢克洛、头孢洛宁、头孢孟多、头孢匹林、头 孢唑林、头孢吡肟、头孢克肟、头孢噻肟、头孢西丁、头孢匹罗、头孢泊肟、头孢喹肟、头孢他 啶、头孢噻呋、头孢曲松、头孢呋辛、头孢氨苄、头孢噻吩和头孢替坦）；碳青霉烯类和青霉烯 类(例如，多利培南、厄他培南、法罗培南、亚胺培南和美罗培南）；单环0内酰胺类(例如， 氨曲南、诺卡霉素A、烟草毒素-0-内酰胺和替吉莫南）；和0内酰胺酶抑制剂(例如，克拉维 酸、舒巴坦和他唑巴坦）。优选的内酰胺类包括头孢菌素类，特别是头孢唑啉。
[0046] 优选的MLS抗生素包括克林霉素、林可霉素、吡利霉素和任何大环内酯抗生素。优 选的林可酰胺抗生素是吡利霉素。
[0047] 其它抗微生物剂包括氨基糖苷类、氯羟吡啶、迪美唑类、红霉素、弗氏菌丝素、呋喃 唑酮、卤夫酮、2-吡啶酮、氯苯胍、磺胺类、四环素类、甲氧苄啶、各种截短侧耳素(例如，泰 妙菌素和沃尼妙林)和各种链霉素(例如，莫能菌素、甲基盐霉素和盐霉素）。
[0048] II ?方法 本发明的目标是提供引发对未感染的个体的保护性免疫、对感染的个体的保护性免 疫、对未感染的个体的增强免疫力、对感染的个体的增强免疫力、对感染的个体的治疗性免 疫力或其组合的免疫调节剂组合物、免疫刺激性质粒(或DNA序列）和方法。因此，本发明的 组合物可用于预防性免疫个体或用于治疗个体。本文所述的方法包括向个体施用本文所述 的免疫刺激性质粒或DNA序列。
[0049] A.免疫刺激的方法 本发明涉及引发受体个体中的免疫应答的方法。所述方法包括向个体施用有效量的免 疫调节剂组合物以引发免疫应答。在一些方面，所述免疫调节剂组合物引发单独有效的非 抗原特异性免疫应答。在一些方面，当在此类疫苗之前施用、与疫苗共同施用、疫苗接种后 施用或与疫苗混合时，所述免疫调节剂组合物增强至少一种生物试剂(诸如疫苗）的作用。 在一些方面，所述方法提供了用于保护受体个体免于感染性疾病并且治疗患有感染性疾病 的群体的新的治疗策略。在一些方面，当免疫调节剂与疫苗组合使用时，相比使用没有所述 免疫调节剂组合物的疫苗，所述方法提供了针对疾病的更快速、更长并且更好的保护。
[0050] 可以通过施用有效量的免疫调节剂组合物而在受体个体中引发免疫应答，所述免 疫调节剂组合物包含本文所述的任何脂质体递送媒介物、本文所述的任何免疫刺激性质粒 (对于DNA序列）和本文所述的任何生物试剂。设想了生物试剂可以与免疫调节剂混合或共 同施用，或者其独立施用。独立施用可以在施用免疫调节剂之前或之后。还设想了可以施用 免疫调节剂或生物试剂不止一次用以延长增强的免疫力。此外，不止一种生物试剂可以与 免疫调节剂共同施用、在免疫调节剂之前施用、在免疫调节剂施用之后施用或者同时施用。
[0051] 可以向个体施用有效量的本文所述的任何免疫调节剂组合物。所述有效量足以引 发受体个体中的免疫应答。此类有效量是引起受体个体中的免疫应答的任何量。测量免疫 应答的方法是本领域中熟知的。此外，技术人员将认识到，有效量将取决于年龄、体重、感染 的阶段以及本领域中已知的其它因素。合适的有效量的范围可以为每个个体约0.1 yg至1， 000 yg。在一些方面，所述有效量的范围可以为约0.1 yg至约10 yg、约0.1 yg至约5 yg、约 0.5 yg至约5 yg、约0.25 yg至约5 yg、约0.05 yg至约 10 yg、约5 yg至约 15 yg、约 10 yg至 约 15 yg、约 10 yg至约20 yg、约20 yg至约30 yg、约30 yg至约40 yg、约40 yg 至约50 yg、 约50 yg至约70 yg、约70 yg至约90 yg、约50 yg至约 100 yg、约 100 yg至约 150 yg、约 150 yg至约200 yg、约200 yg至约250 yg、约250 yg至约300 yg、约300 yg至约350 yg、约350 y g至约4〇〇 yg、约400 yg至约450 yg、约450 yg至约500 yg、约500 yg至约550 yg、约550 yg 至约600 yg、约600 yg至约650 yg、约650 yg至约700 yg、约700 yg至约750 yg、约750 yg 至约800 yg、约800 yg至约850 yg、约850 yg至约900 yg、约900 yg至约950 yg、约950 yg 至约1000 yg。优选地，在一些方面，所述有效量范围为约0.5 yg至约10 yg。又优选地，在其 它方面，所述有效量范围为约50 yg至约100 yg。并且优选地，在其它方面，所述有效量范围 为约40 yg至约70 yg。
[0052] 在一些方面，可以通过向禽类物种的成员施用有效量的本文所述的任何免疫调节 剂组合物而在禽类物种的成员中引发免疫应答。所述有效量足以引发禽类物种的成员中的 免疫应答。例如，用于禽类物种的免疫调节剂的有效量可以为约0.05 yg至约10 yg、约0.1 yg至约5 yg、约0.5 yg至约1.5 yg或约1.0 yg至约10 yg。譬如，用于身为禽类物种的个体 的合适的有效量可以为约0.1 ug、0.2 yg、0.3 yg、0.4 yg、0.5 yg、0.6 yg、0.7 yg、0.8 y g、0.9 yg、1.0 yg、1.2 yg、1.4 yg、1.6 yg、 1.8 yg、2.0 yg、2.5 yg、3.0 yg、3.5 yg、4.0 yg、4.5 yg、5.0 yg、5.5 yg、6.0 yg、6.5 yg、7.0 yg、7.5 yg、8.0 yg、8.5 yg、9.0 yg、9.5 yg、10.0 yg、9.5 yg、10.0 yg、10.5 yg、11.0 yg、12 yg、13 yg、14 yg或15 yg。
[0053] 在一些方面，可以通过向牛科动物物种的成员施用有效量的本文所述的任何免疫 调节剂组合物而在牛科动物物种的成员中引发免疫应答。所述有效量足以引发牛科动物物 种的成员中的免疫应答。例如，用于牛科动物物种的免疫调节剂的有效量可以为每只动物 约1 yg至约1000 yg，每只动物约5 yg至约500 yg，每只动物约10 yg至约100 yg，每只动物 约10 yg至约50 yg，或每只动物约40 yg至约60 yg。譬如，用于身为牛科动物物种的个体的 合适的有效量可以为约30 yg、35 yg、40 yg、45 yg、50 yg、55 yg、60 yg、65 yg、70 yg、75 tig、80 yg、85 yg、90 yg、95 yg、100 yg、110 yg、120 yg、130 yg、140 yg、150 yg、160 yg、 170 yg、180 yg、190 yg、200 yg或最多至500 yg、或最多至 1000 yg。
[0054] B.使用条件 本发明的方法在个体中引发免疫应答，使得个体被保护免于易受引发免疫应答治疗的 疾病。如本文所使用，短语"保护免于疾病"是指减轻疾病的症状;减少疾病的发生;减轻疾 病的临床或病理严重性;或者减少引起疾病的病原体的脱落。保护个体可以是指本发明的 治疗组合物当向个体施用时其预防疾病发生、治疗和/或减缓或减轻疾病症状、临床体征、 病理学或病因的能力。例如而非限制，牛呼吸道疾病(BRD)的临床体征包括肺损伤、升高的 体温、抑郁(例如食欲缺乏、对外部刺激降低的应答、下垂的耳部）、流鼻涕和呼吸特征(如呼 吸速率、呼吸努力）。可以向疑似暴露于BRD的牛施用本文所述的免疫调节剂组合物施用于， 以防止或减轻BRD的上述临床体征的严重度。作为另外的实例，而非限制，禽类个体中的 Marek氏病的临床体征包括降低孵化率和鸟存活率。可以向疑似暴露于Marek氏病的禽类个 体施用本文所述的免疫调节剂组合物，以防止或减轻Marek氏病的上述临床体征的严重度。
[0055] 因此，保护个体免于疾病包括预防疾病发生(预防性治疗)和治疗患有疾病的个体 (治疗性治疗）。具体而言，保护个体免于疾病通过诱导有益的或保护性免疫应答而在个体 中引发免疫应答来实现，所述有益的或保护性免疫应答在一些情况下还可以压制、降低、抑 制或阻断过度活跃的或有害的免疫应答。术语"疾病"是指个体的正常健康的任何偏离，并 且包括当存在疾病症状时的状态以及其中已发生偏离(例如感染、基因突变、遗传缺陷等）、 但症状仍未显现的状况。
[0056] 本发明的方法可以用于预防疾病、刺激针对疾病的效应细胞免疫、消除疾病、减缓 疾病和预防由原发性疾病的发生导致的继发性疾病。
[0057] 在一些方面，相比于仅仅施用疫苗，当与疫苗共同施用时，本文所述的方法还可以 用于改善个体的获得性免疫应答。由于需要时间来刺激获得性免疫，因此通常疫苗施用一 次不会立即保护个体。术语"改善"在本发明中是指在个体中引发固有免疫应答，直到疫苗 开始保护个体和/或通过由疫苗给予的获得性免疫来延长保护期间。
[0058]在一些方面，本发明的方法包括施用组合物来提供针对广泛种类病原体的感染的 保护。施用的组合物可以包含或可以不包含引发特异性应答的特异性抗原。设想了本发明 的方法将保护受体个体免于由感染性微生物病原体导致的疾病，所述感染性微生物病原体 包括而不限于病毒、细菌、真菌和寄生虫。技术人员将认识和理解，本文所述的免疫调节剂 组合物针对许多感染病原体(其太多而无法列举)是有效的。本文提供的感染病原体是出于 示例性目的而提供，并且不限制使用范围而提供。
[0059] 禽类物种中的示例性病毒感染性疾病包括而不限于被以下感染而导致的疾病:鸡 感染性贫血病毒(CIAV)、Marek氏病病毒(MDV)、鸡疱疹病毒(HCV)、火鸡疱疹病毒(HTV)、感 染性囊病病毒(IBDV)、新城疫病毒(NDV)、感染性支气管炎病毒(IBV)、感染性喉气管炎病毒 (ILTV)、副粘病毒3型、禽脑脊髓炎(AEV)、禽痘病毒(FPV)、禽霍乱、禽流感病毒(AIV)、呼肠 孤病毒、禽白血病病毒(ALV)、网状内皮组织增殖病毒(REV)、禽类腺病毒、出血性肠炎病毒 (HEV)、肺炎病毒、鸽子痘病毒、其重组体以及本领域中已知的其它病毒。
[0060] 禽类物种中的示例性细菌感染包括而不限于被以下感染而导致的疾病:革兰氏阳 性细菌、革兰氏阴性细菌或真菌诸如博德特氏菌属teDa如/7.)、空肠弯曲杆菌 (Campylobacter jejuni)、肉毒後菌（Clostridium botulimmi)、场後菌（Clostridium 、产气荚膜梭菌（C7ostric/i? jOer/ri/^efls)、红斑丹毒丝菌（i?_r7sij〇e_/otA_rix iflsic/iosa)、大肠杆菌、鸡沙门氏菌（?Salfflo/jeDa 腫)、鸡败血支原体(ifyc〇j〇_/as/?a gallisepticmm)、久鸡支原W(Mycoplasma meleagridis)、滑澈囊支原W(Mycoplasma sjfloriae)、多杀巴斯德氏菌（Pastet/reDa 、鸭疫里氏杆菌 a/?a tijOes tifer)、沙门氏菌属（e_/_/a SjOjO .)、肠炎沙门氏菌（?Sahofle_/_/a e/3 teri tic/is)、鸡白痢沙门氏菌（?Salfflo/jeDa j〇u_/_/or應)以及本领域中已知的其它细菌。
[0061] 禽类物种中的示例性真菌或霉菌感染包括而不限于被以下感染而导致的疾病:黄 曲霉/7aras)、烟曲霉、白色念珠菌（Ckoc/ic/a 以及本领域中已知的其它感染性真菌或霉菌。示例性疾病状况包括而不限于以 下导致的疾病状况:来自革兰氏阳性细菌、革兰氏阴性细菌或真菌的毒素，诸如肉毒杆菌毒 素、产气荚膜梭菌(Clostridium perfringesns)毒素、大肠杆菌肠毒素、镰刀菌霉菌毒素、 巴斯德氏菌白细胞毒素、葡萄球菌属毒素以及本领域中已知的其它毒素^
[0062] 禽类物种中的示例性寄生虫包括而不限于，鸡蛔虫卵Di)、环首毛细 线虫（fa)、扭转毛细线虫（、鹤毛细线虫 (Cap i 1 lar ia 珠)(鸟艾美球虫（五 meleagriclis)、鸡异勉线电（Heterakis gallinae)、气管it翼线电（Syngamus trachea)^X 及本领域中已知的其它寄生虫。
[0063] 牛科动物物种中的示例性病毒感染性疾病包括，而不限于，被以下感染而导致的 那些：蓝舌病病毒、牛腺病毒、牛杯状病毒、牛冠状病毒(BCV)、牛肠病毒、牛疱疹病毒1型 (BHV1)、牛疱疹病毒4型(BHV4)、牛白血病病毒、牛细小病毒、牛呼肠孤病毒、牛呼吸道合胞 病毒(BRSV)、牛鼻病毒、牛病毒性腹泻病毒1型(BVDV1)、牛病毒性腹泻病毒2型(BVDV2)、感 染性牛鼻气管炎（IBR)、恶性卡他热病毒、副流感病毒3型(PIV3)、狂犬病病毒、水泡性口炎 病毒(VSV)、其重组体以及本领域中已知的其它病毒。
[0064] 牛科动物物种中的示例性细菌感染包括而不限于，被以下感染而导致的那些:革 兰氏阳性细菌、革兰氏阴性细菌或分枝杆菌诸如化脓隐秘杆菌 、炭疽芽抱杆菌、炭疽芽抱杆菌、流 产布鲁氏菌(份^(^_/_/3 3/?6>2^狀）、胎儿弯曲杆菌（(^卿7_/6>如(^^'/^狀)、空肠弯曲杆菌 (Campylobacter je juni) > ( Clostridium botul inum)、chauveo i 敬舊 (Clostridiwn chauveoi)、藥舊（Clostridimn colintun)、:溶H复舊（Clostridiwn 、诺氏梭菌（謂卯 )、产气荚膜梭菌（謂 perfringens)、%文莺$复舊(Clostridium septicwn){复舊(Clostridium tetaniH$r 状杆菌（、大肠杆菌（fccAericAia co_/i)、坏死梭杆菌 梭杆菌属577/7.)、睡眠嗜组织菌soffiwi)、嗜 组织菌属冲/7.)、钩端螺旋体属（Ze/Kospira冲/7.)、溶血曼海姆氏菌 (Mannheimia haemolytica)、莫H克琢氏舊M(Moraxella spp?、、缪勒M(Muellerius 577/7.)、副结核分枝杆菌para 、分枝杆菌属 577/7.)、牛鼻支原体(鄭cc>p_/a57??a 、牛支原体(鄭c6>jCL/a57??a 、殊异支原体 細 diSjDar)、支原体属細 *5即.）、多杀巴斯德氏菌 皿也）、沙门氏菌属577/7.)、密螺旋体属（7>印ooeffia 577/7.)、差异脲原体 (?備rans?)以及本领域中已知的其它细菌。
[0065] 牛科动物中的示例性真菌或霉菌感染包括而不限于被以下感染而导致的真菌或 霉菌感染:放线细菌属(Ki'加如57私）、曲霉属dpergiDiAs 577/7.)和组织滴虫属 577/7.)以及本领域中已知的其它感染性真菌或霉菌感染 [0066] 牛科动物中的示例性寄生虫包括而不限于无形体属(如備印p.)、边缘无形 体備_叹_^彻_/6)、巴贝虫属577/7.)、足螨属577/7.)、古桕线 虫属（Cboperia)、囊尾蝴属（577/7.)、牛毛虱、嗜皮菌属 577/7. 577/7?、艾美球虫属(fiffiaria 577/7.)、附红细胞体属 (你s即?）、拟片吸虫属sad.)、血矛线虫属（ZfeaffloocAws SjOjO.)、蜱绳属（UopAagus SjOjO.)、缪勒线虫属（J/ueDei-ius SjOjO.)、细颈线虫属 (Afe/satoc/irus sfl〇.)、新孢子虫属(Afeosjoora sfl〇..)、狂绳属（Oestrus SAD.)、奥斯特线虫 属（Ostertagia sfto.)、痒螨属（PsorOjDtes sfto.)、挤螨属（5rarco/7tes sfto.)、蛇形菌属 (?Seipe/js sfto.)、类圆线虫属（5rt_rao《7_/oic/es sfto.)、弓形体属（rojTOjCL/asffa sfl〇.)、毛癣 菌属（rricAojoAjto/? SjOjO.)、三毛滴虫属（TYitricAo/sas SjOjO.)、毛圆线虫属 (r_ricAostro/^j^us)、鞭形线虫属（TricAuris sfl〇.)以及本领域中已知的其它寄生虫。
[0067] 牛科动物中的示例性感染性疾病致病剂还包括引起乳腺炎、子宫炎、隐孢子虫病 和牛科动物易患的任何其它感染性疾病的那些致病剂。
[0068] C ?施用 多种施用途径是可用的。选择的具体模式当然将取决于选择的具体生物试剂、个体的 年龄和总体健康状态、所治疗的具体状况和治疗效力所需的剂量。本发明的方法可以使用 任何施用模式来实施，其产生有效水平的免疫应答而不引起临床上不可接受的副作用。所 述组合物可以方便地以单位剂型提供，并且可以通过本领域熟知的任何方法制备。
[0069] 所述免疫调节剂组合物可以静脉内、肌内、皮内、腹膜内、皮下、通过喷雾、通过羽 囊法卵内、口服、眼内、气管内、鼻内或通过本领域中已知的其它方法来施用。在一个方面， 皮下施用所述免疫调节剂。在另一个方面，可以肌内施用所述免疫调节剂。在另一个方面， 作为喷雾施用所述免疫调节剂。在另一个方面，可以口服施用所述免疫调节剂。
[0070] 在一个方面，可以在攻击(或感染)之前向个体单独施用所述免疫调节剂。在另一 个方面，可以在攻击(或感染)之后向个体单独施用所述免疫调节剂。在另一个方面，可以在 攻击(或感染)的同时向个体单独施用所述免疫调节剂。
[0071] 在一些方面，可以在攻击之前，在疫苗接种的同时共同施用所述免疫调节剂组合 物。在一些方面，可以在攻击(或感染)的同时，在疫苗接种的同时共同施用所述免疫调节剂 组合物。在一些方面，共同施用可以包括在个体的相同惯用局部的彼此相邻的两个不同部 位上（即在个体的颈部上彼此相邻地注射）、在个体的相同惯用局部的相对侧面上（即颈部 每一侧上各一次）、或在相同个体的不同局部上施用疫苗和免疫调节剂。在一些方面，可以 在疫苗接种和攻击之前施用所述免疫调节剂组合物。在一些方面，可以在疫苗接种之后、但 在攻击之前施用所述免疫调节剂组合物。可以在攻击之后向已在攻击(或感染)之前疫苗接 种的个体施用所述免疫调节剂组合物。
[0072] 技术人员将认识到，施用途径可以根据个体和个体的健康或状态而变化。出于示 例性目的提供了禽类和牛科动物物种的施用途径，并且不加限制。
[0073] 可以在任何年龄进行禽类物种的疫苗接种。可以向18日龄胚胎(卵内）及以上施用 活微生物的疫苗接种，向3周龄及以上施用灭活微生物或其它类型疫苗的疫苗接种。对于卵 内疫苗接种，可以在发育的后1/4期间施用疫苗接种。可以皮下、通过羽囊法、通过喷雾、口 月艮、眼内、气管内、鼻内、卵内或通过本领域中已知的其它方法施用疫苗。口服疫苗可以在饮 用水中施用。另外，设想了可以基于常规疫苗接种方案来使用本发明的方法。
[0074] 也可以皮下、通过羽囊法、通过喷雾、眼内、气管内、鼻内、卵内或通过本领域中已 知的其它方法向禽类物种施用所述免疫调节剂组合物。例如，可以卵内施用所述免疫调节 剂组合物。或者，可以作为喷雾施用所述免疫调节剂组合物。
[0075]可以在禽类配体发育的后1/4期间向其卵内施用所述免疫调节剂组合物。例如，可 以将所述免疫调节剂组合物卵内施用于18日龄或19日龄胚胎。向蛋的施用可以在攻击(或 感染)之前或攻击之后。
[0076] 可以在攻击之前约1至约14天或者在攻击之后约1至约14天向禽类或牛科动物物 种的动物施用所述免疫调节剂。例如，可以在攻击之前约1至约7天或者在攻击之后约1至约 7天施用所述免疫调节剂。在攻击之前1、2、3、4、5、6、7天或攻击之后1、2、3、4、5、6、7天合适 地施用所述免疫调节剂。
[0077] 可以在任何年龄进行牛科动物物种的疫苗接种。可以静脉内、肌内、皮内、腹膜内、 皮下、通过喷雾、口服、眼内、气管内、鼻内或通过本领域中已知的其它方法施用疫苗。另外， 设想了可以基于常规疫苗接种方案使用本文所述的方法。
[0078] 其它递送系统可以包括定时释放、延迟释放或持续释放的递送系统。此类系统可 以避免组合物的反复施用，从而提高便利性。许多类型的释放递送系统是可用的，并且为本 领域普通技术人员所知。它们包括基于聚合物的系统例如聚（丙交酯-乙交酯）、共聚草酸 酯、聚己酸内酯、聚酰胺酯、聚正酯、聚羟基丁酸和聚酐。含有药物的上述聚合物的微胶囊 在，例如美国专利号5,075,109中有述。
[0079]递送系统也包括非聚合物系统，其为脂质，包括留醇诸如胆固醇、胆固醇酯和脂肪 酸或中性脂肪诸如单、双和三甘油酯;水凝胶释放系统;硅橡胶系统;基于肽的系统;蜡质包 衣;使用常规结合剂和赋形剂的压制片剂;部分融合的植入物等。具体实例包括但不限于侵 蚀系统(本发明的试剂以基质内形式包含其中，诸如描述于美国专利号4,452,775、4,675， 189和5，736,152中的那些)和扩散系统(其中活性成分以受控速率从聚合物渗出，诸如描述 于美国专利号3,854,480、5，133,974和5,407,686)。此外，可以使用基于栗的硬件递送系 统，其中一些适于植入。
[0080]因为在不背离本发明范围的情况下可以对上述组合物、产品和方法进行多种变 化，所以预期上文描述和下文给出的实施例中包含的所有内容均应被解释为说明性而非限 制性的涵义。
[0081 ] 定义 术语"有效量"是指必需或足以实现期望的生物效应的量。例如，用于治疗或预防感染 性疾病的免疫调节剂的有效量是暴露于微生物后引起免疫应答的发生所必需的量，因而引 起个体内微生物量的降低并且优选根除微生物。对于任何具体应用的有效量可以根据因素 诸如所治疗的疾病或病状、个体的大小或疾病或病状的严重性而变化。本领域普通技术人 员无需过度实验，通过经验就可以确定免疫调节剂的有效量。
[0082]术语"细胞因子"是指增强免疫的蛋白家族。细胞因子家族包括造血生长因子、白 介素、干扰素、免疫球蛋白超家族分子、肿瘤坏死因子家族分子和趋化因子（即调节细胞、特 别是吞噬细胞的迀移和活化的蛋白）。示例性细胞因子包括而不限于白介素-2 (IL-2)、白 介素-12 (IL12)、白介素-15 (IL-15)、白介素-18 (IL-18)、干扰素 -a (IFNa)和干扰素-y (IFN y ) 〇
[0083]术语"引发"可以与术语活化、刺激、产生或上调互换使用。
[0084]术语在个体中"引发免疫应答"是指特异性控制或影响免疫应答的活性，并且可以 包括活化免疫应答、上调免疫应答、增强免疫应答和/或改变免疫应答(诸如通过引发一类 免疫应答，其进而将个体中免疫应答的优势类型从有害或无效的类型转变为有益或保护性 的类型）。
[0085]术语"可操作连接"是指以这样的方式将核酸分子连接至转录控制序列，所述方式 使得当被转染（即转化、转导或转染)入宿主细胞时能够表达所述分子。转录控制序列是控 制转录的起始、延伸和终止的序列。尤其重要的转录控制序列是控制转录起始的那些序列， 诸如启动子、增强子、操纵子和抑制子序列。多种此类转录控制序列是本领域技术人员已知 的。优选的转录控制序列包括在禽类、鱼类、哺乳动物、细菌、病毒、植物和昆虫细胞中发挥 功能的那些。尽管本发明可以使用任何转录控制序列，但所述序列可包括天然存在的转录 控制序列，其与编码免疫原或免疫刺激蛋白的序列天然缔合。
[0086]术语"核酸分子"和"核酸序列"可以互换使用，并且包括DNA、RNA、或DNA或RNA的衍 生物。该术语还包括寡核苷酸和更大的序列，诸如质粒，诸如本文所述的免疫刺激性质粒， 且包括编码蛋白或其片段的核酸分子以及包含调节区、内含子或其它非编码DNA或RNA的核 酸分子。通常，寡核苷酸具有长度为约1到约500个核苷酸的核酸序列，并且更通常，长度为 至少约5个核苷酸。核酸分子可以源自任何来源，包括哺乳动物、鱼类、细菌、昆虫、病毒、植 物、合成来源或其组合。核酸分子可以通过本领域众所周知的方法来产生，诸如重组DNA技 术(例如，聚合酶链式反应(PCR)、扩增、克隆)或化学合成。核酸分子包括天然核酸分子及其 同源物，包括但不限于天然等位基因变体和经修饰的核酸分子(其中已经以这样的方式插 入、缺失、置换或倒置核苷酸，所述方式使得此类修饰基本上不干扰核酸分子引发可用于本 发明的方法的免疫应答的能力）。核酸同源物可以使用本领域技术人员已知的许多方法来 产生（参见，例如，Sambrook等人，Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Labs Press, 1989)，其通过引用并入本文。
[0087] 术语"可选择的标记物"和"可选择的标记基因"是指编码产物的基因，所述产物保 护其中表达所述基因的生物体免于通常会杀死该生物体或抑制其生长的选择剂(例如，抗 生素)或病状的影响。最常用的可选择的标记基因是抗生素抗性基因（例如，卡那霉素抗性 基因、氨苄青霉素抗性基因、氯霉素抗性基因、四环素抗性基因等）。因此，例如，当大肠杆菌 细胞经受转化程序以引入编码卡那霉素抗性基因的质粒，然后在含有卡那霉素的培养基上 或其中生长时，只有已经成功摄取质粒并表达卡那霉素抗性基因的大肠杆菌细胞才将存 活。术语"可选择的标记物"和"可选择的标记基因"还包括编码参与对于生物体的生长所必 需的化合物的合成的酶的基因。当被引入到不能合成必需化合物的营养缺陷型生物体时， 此类基因允许生物体在已经补充有必需化合物的培养基中生长。例如，由于参与赖氨酸生 物合成的酶中的突变或不存在所述酶而对于氨基酸赖氨酸营养缺陷的细菌细胞通常无法 在尚未补充有赖氨酸的培养基中生长。当此类细菌经受转化程序以引入编码参与赖氨酸生 物合成的酶的质粒时，已经成功摄取所述质粒并表达所述酶的细菌当在尚未补充有赖氨酸 的培养基中生长时将存活。术语"可选择的标记物"和"可选择的标记基因"还包括允许毒 物/解毒剂选择的基因。例如基因编码结合DNA促旋酶(对于细胞分裂所必需的酶)的 蛋白。结合DNA促旋酶之后，必基因产物损害基因复制并诱导细胞死亡。因此，表达 基因产物的细菌不能存活。cc必基因编码充当cc必基因产物的天然抑制剂的蛋白（"解毒 剂"）。因此，当在其细菌基因组中具有cc必基因的细菌经受转化程序以引入编码cc必基 因产物的质粒时，只有成功摄取所述质粒并表达％必基因的细胞才将存活。
[0088] 术语"可筛选的标记物"和"可筛选的标记基因"是指编码产物的基因，所述产物允 许观察者区分表达可筛选的标记基因的细胞和不表达可筛选的标记基因的细胞。可筛选的 标记基因系统是本领域中熟知的，并且包括，例如，hcZ基因和编码荧光蛋白的基因，所述 荧光蛋白诸如绿色荧光蛋白（GFP)、黄色荧光蛋白（YFP)、红色荧光蛋白（RFP)、蓝色荧光蛋 白（BFP)或青色荧光蛋白（CFP)。
[0089] 如本文所用，术语"个体"是指具有中枢神经系统的活生物体。具体而言，个体包 括，但不限于，人类个体或患者和伴侣动物。示例性伴侣动物可以包括家养哺乳动物(例如， 狗、猫、马）、具有显著商业价值的哺乳动物(例如，禽类物种、牛科动物物种、奶牛、肉牛、体 育动物）、具有显著科学价值的哺乳动物(例如，濒危物种的俘获或自由样本)或具有其它价 值的哺乳动物。合适的个体还包括:小鼠、大鼠、狗、猫、有蹄类动物(诸如牛、猪、绵羊、马和 山羊）、兔类动物(诸如家兔和野兔）、其它啮齿动物和灵长类动物(诸如猴、黑猩猩和猿）。个 体可以是禽类物种的任何成员，无论是驯养的还是野生的，并且可以进行商业饲养用于繁 殖、产肉或产蛋。示例性禽类物种包括，但不限于，鸡、火鸡、鹅、鸭、野鸡、鹌鹑、鸽子、鸵鸟、 笼中鸟、动物园保藏中心和鸟类饲养场中的鸟类等。个体可以是牛科动物物种的任何成员， 无论是驯养的还是野生的，并且可以进行商业饲养用于繁殖、产肉或产奶。示例性牛科动物 物种包括，但不限于，羚羊、水牛、牦牛、牛、野牛等。牛的物种包括，但不限于，奶牛、公牛 (bulls)、小公牛、小母牛、公牛(ox)、肉牛、奶牛等。个体可以是水产养殖物种的任何成员， 包括但不限于，生活在淡水或咸水中的鱼类、甲壳类动物、软体动物的任何物种。在一些方 面，个体可以被诊断为患有感染性疾病、可以具有感染性疾病的风险或者可以正在经历感 染性疾病。个体可以是任何年龄的，包括在子宫内的、新生的、青春期的、成年的、中年的或 老年的。 实施例
[0090] 提供了以下非限制性实施例以进一步举例说明本发明。
[0091] 实施例l:pGCMB75.6质粒的制备 PGCMB75.6的图谱示于图2中。在pGCMB75.6中，pMB75.6(参见图1)的卡那霉素抗性基因 已经被替换为来自大肠杆菌K-12的非编码序列。为了生成pGCMB75.6质粒，将AscI单切割限 制性位点引入PMB75.6的卡那霉素抗性基因的5 '侧的位点以生成pMB75.6_AscI (SEQ ID NO: 3)。为了引入AscI限制性位点，将pGCMB75.6的序列中存在的一个腺嘌呤突变为鸟嘌 呤，由此将PGCMB75.6质粒中的序列AGCGCGCC改变为GGCGCGCC。使用基于诱变的方法通过扩 增期间连接来实现该修饰。使用了单个引物，其在其中部携带Asc I限制性位点。
[0092] 由Life Technologies GmbH (Darmstadt, Germany)合成 1779 nt长的AscI (GGCGCGCC) / Xhol (CTCGAG)片段。该片段含有包含来自大肠杆菌K-12的非编码序列的五 个区域(交换1-5,在图2中缩写为"^(3.1"、"^(：.2"等）、？1复制起点和截短的1 &(^基因（参 见图2)。在交换4的情况下，在几个位置手动改变大肠杆菌的序列，以提高质粒的GC含量。此 外，在交换2中，改变单个核苷酸以缺失Dral限制性位点，使得质粒中将只有单个Dral位点。 [0093] 如图2中所示，pGCMB75.6含有若干个调控元件(F1复制起点、CMV启动子和pUC复制 起点）和多克隆位点。PGCMB75.6还含有截短的lacZ基因。然而，pGCMB75.6不包含任何全长 或功能性可选择或可筛选的标记基因。PGCMB75.6长度为4242 bp，并且含有283个CpG二核 苷酸。
[0094]用AscI (GGCGCGCC) / Xhol (CTCGAG)消化一个携带新引入的AscI位点的阳性克 隆(pMB75.6_AscI)，以生成含有CMV启动子、多克隆位点和pUC复制起点的2463片段(参见图 2)。同样用AscI / Xhol消化 1779 nt AscI (GGCGCGCC) / Xhol (CTCGAG)合成片段。
[0095]通过使用来自Qiagen的QIAquick凝胶提取试剂盒从1 %琼脂糖凝胶凝胶洗脱两个 片段（2463 nt载体片段和1779 nt插入物片段）。在16°C下，在20 yl的总体积中使用600 ng 1779 nt片段和400 ng 2463 nt pMB75.6_AscI载体片段进行连接过夜。然后在冰上将 20 yl针对20 ml H20透析2小时，然后与5 yl电感受态DH5a大肠杆菌细胞和40yl H20 (Invitrogen F-f801acZAM15 A (lacZYA-argF) U169 recAl endAl hsdR17 (rk-, mk + ) gal- phoA supE44 A- thi_l gyrA96 relAl;批号 1376481，部件号44-0097)混合。转 化并在S0C培养基中再生1小时之后，将细胞以10 4稀释度铺板于不含卡那霉素的LB板上。该 稀释度使得能够分离单个克隆。
[0096] 使用表1中列出的以下引物对单个克隆进行菌落PCR。
[0097] 表1.PCR引物。
AH-13 rev和AH-22 for引物的位置示于图2中。使用含有Taq聚合酶的预混物。将PCR反 应物上样至含有溴化乙啶的1 %琼脂糖凝胶上。携带正确质粒(PGCMB75.6)的阳性克隆显示 606 bp的产物。
[0098] 筛选了总共超过10,000个克隆以鉴定出三个阳性克隆。将这三个阳性克隆立即转 移至新鲜LB板，并用于生成3个研究细胞库(RCB; Sys 3733、Sys 3734和Sys 3735)。
[0099]平行地，用这三个克隆疫苗接种培养基，并生成质粒DNA。使用表2中列出的以下引 物完成三个亚克隆中每个的完整序列验证。
[0100] 表2 ?用于序列验证的PCR。
实施例2: pLacZMB75.6质粒的生成。
[0101] 为了生成pLacZMB75.6质粒（图3; SEQ ID N0: 4)，由Life Technologies GmbH (Darmstadt, Germany)合成 1307 nt Xhol (CTCGAG) / Dral (ITTAAA)片段。该 1307 nt核 苷酸片段含有lacZ基因的部分（265 nt)。因此，当被连接入pGCMB75.6时，该片段使位于 XhoI限制性位点上游的截短的LacZ基因延长，并且允许表达LacZ基因（比较图2和图3)。此 外，用大肠杆菌非编码序列交换多克隆位点的91 nt，以便消除与新引入的LacZ基因区域的 序列同源性，并避免重组。此外，缺失CMV启动子的5'区域（265 nt)，以便生成与质粒 PGCMB75.6大小相同的质粒。
[0102] pGCMB75.6和1311 nt合成片段均用Xhol和Dral消化。通过使用来自Qiagen的 QIAquick凝胶提取试剂盒从1%琼脂糖凝胶凝胶洗脱这两个片段。
[0103] 在16°C下，在20 yl的总体积中使用240 ng 1311 nt片段和240 ng载体片段进行 连接过夜。将3 yl与10 yl电感受态DH5a大肠杆菌细胞（Invitrogen F-f801acZAM15 A (lacZYA-argF) U169 recAl endAl hsdR17 (rk-, mk+) gal- phoA supE44 入-thi-1 gyrA96 relAl;批号1376481，部件号44-0097)和40yl 10%甘油溶液混合。转化并在SOC培 养基中再生1小时之后，将细胞以1〇_2和1〇_4稀释度铺板于不含卡那霉素的LB X-Gal/IPTG 板上。该稀释度使得能够分离单个克隆。
[0104]经由蓝/白选择进行含有质粒的菌落的鉴定，并且使用表3中列出的以下引物进行 菌落PCR以进行验证。
[0105]表3?用于菌落验证的PCR引物。
AH-15和AH-39引物的位置示于图3中。使用含有Taq聚合酶的预混物。将PCR反应物上样 至含有溴化乙啶的1 %琼脂糖凝胶上。携带正确质粒(pLacZMB75.6)的阳性克隆显示777 bp 的产物。
[0106]鉴定出四个阳性克隆，并将其立即转移至新鲜LB板，并用于生成研究细胞库(RCB; Sys 3736、Sys 3737、Sys 3738和Sys 3739)。
[0107]平行地，用这四个克隆疫苗接种培养基，并生成质粒DNA。使用与用于pGCMB75.6的 相同的引物完成四个亚克隆中每个的完整序列验证，但使用引物AH-24,而不是使用引物 AH-16 (SEQ ID N0: 10)(参见表4)。
[0108] 表4?用于AH-24的PCR引物。
实施例3:免疫调节剂组合物 所述免疫调节剂是包含本文所述的阳离子脂质和非编码DNA序列的组合物。配制合成 的免疫调节剂脂质组分[l-[2-[9-(Z)_十八碳烯酰基氧基]]-2-[8](Z)_十七碳烯基]-3-[羟乙基]咪唑啉鑰氯化物(D0TIM)和合成的中性脂质胆固醇，以产生直径约200 nm的脂质 体(参见，美国专利6，693，086) ANA组分是pGCMB75.6或pLacZMB75.6。带负电荷的质粒DNA 与带正电荷（阳离子)的脂质体缔合(参见，美国专利6,693,086)。
[0109] 实施例4:向哺乳动物模型施用免疫调节剂组合物提高了病毒攻击中的存活率。
[0110] 在用病原体攻击的哺乳动物模型中评价本文所述的免疫调节剂组合物的功效。经 由腹膜内注射向小鼠施用含有PGCMB75.6 DNA和阳离子脂质体的免疫调节剂组合物。以 0.01 yg、0.02 yg、0.04 yg和1.00 yg浓度施用所述免疫调节剂组合物。经由腹膜内注射向 对照小鼠施用0.9% NaCl溶液。免疫调节剂施用后二十四小时，所有动物都经由腹膜内注射 用病毒施加攻击(0.2 ml 1(^4 KID5Q/ml)。攻击病毒为伪狂犬病毒(PR)。存活率描绘于图4 中。与对照小鼠相比，接受本文所述的免疫调节剂组合物的小鼠具有更高的剂量依赖的存 活率。
[0111] 实施例5:向禽类模型施用免疫调节剂组合物提高了病原体攻击中的孵化率和存 活率。
[0112] 在第E19天(胚胎第19天)通过喷雾用病原体攻击的禽类模型中评价本文所述的免 疫调节剂组合物的功效。在第E18天(胚胎第18天)经由卵内施用向鸡蛋施用含有pGCMB75.6 DNA和阳离子脂质体的免疫调节剂组合物。对照蛋接受安慰剂对照稀释剂(D5W)(卵内）。冊1 培养液(喷雾)用作模拟攻击(T1)。研究治疗组的详情提供于下表5中。
[0113] 表5.禽类免疫调节剂组合物治疗描述。
1蛋孵化的第18天;2每个平板16只蛋;3每个子托盘64只蛋(分隔以容纳每个托盘两组） ;4从托盘的每个部分孵化的小鸡被转移至一个围栏;5禽致病性大肠杆菌(APEC)。
[0114] 所述免疫调节剂组合物的DNA组分包括pGCMB75.6 DNA的分离的三个克隆之一（即 Jv77、X5872或X5928)。如从下表6中汇总的结果可以观察到，当施用本文所述的免疫调节剂 组合物时，平均孵化率和平均存活率与接收对照治疗的蛋相比得到改善。
[0115] 表6.禽类孵化率和存活率。*
*通过了所有验证测试(两个对照组之间的比较）。与对照攻击组相比有显著差异。
[0116] 当介绍本发明或其优选实施方案的要素时，冠词"一 (a，an)"、"该(the)"和"所述 (said)"意指存在所述要素中的一者或多者。术语"包含（comprising)"、"包括 (including)"和"具有(having)"旨在是包括性的，并且意指可以存在除了列出的要素以外 的另外的要素。
[0117] 鉴于上述内容，将看到，实现了本发明的若干个目标，并且得到了其它有利的结 果。
[0118] 因为在不背离本发明范围的情况下可以对上述产品、组合物和方法进行多种变 化，所以预期上文描述中含有和附图中显示的所有内容均应被解释为说明性而非限制性的 涵义。
【主权项】
1. 免疫刺激性DNA序列组合物，其包含与SEQ ID NO: 1的序列具有至少89%序列同源 性的核酸分子。2. 权利要求1的免疫刺激性DNA序列组合物，其中所述核酸分子包含与SEQ ID NO: 1的 序列具有选自91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%和99%的序列同源性的核酸序列。3. 权利要求1的免疫刺激性DNA序列组合物，其中所述核酸分子包含SEQ ID NO: 1。4. 权利要求1的免疫刺激性DNA序列组合物，其还包含药学上可接受的载体。5. 免疫刺激性DNA序列组合物，其包含与SEQ ID NO: 4的序列具有至少84%序列同源 性的核酸分子。6. 权利要求5的免疫刺激性DNA序列组合物，其中所述核酸分子与SEQ ID NO: 4的序列 具有至少85 %序列同源性。7. 权利要求5的免疫刺激性DNA序列组合物，其中所述核酸分子与SEQ ID NO: 4的序列 具有至少86 %序列同源性。8. 权利要求5的免疫刺激性DNA序列组合物，其中所述核酸分子包含与SEQ ID NO: 4的 序列具有选自 87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%和99%的序列同源性 的核酸序列。9. 权利要求5的免疫刺激性DNA序列组合物，其中所述核酸分子包含SEQ ID NO: 4。10. 权利要求5的免疫刺激性DNA序列组合物，其还包含药学上可接受的载体。11. 免疫调节剂组合物，其包含： a. 与SEQ ID NO: 1的序列具有至少89%序列同源性的核酸序列;和 b. 脂质体递送媒介物。12. 权利要求11的免疫调节剂组合物，其中所述核酸分子包含与SEQ ID NO: 1的序列 具有选自91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%和99%的序列同源性的核酸序列。13. 权利要求11的免疫调节剂组合物，其中所述核酸分子包含SEQ ID NO: 1。14. 权利要求11的免疫调节剂组合物，其中所述脂质体递送媒介物包含选自以下的脂 质对:N-[l-(2,3-二油基氧基)丙基]-N，N，N-三甲基氯化铵(D0TMA)和胆固醇;N-[l-(2,3-二油酰基氧基）丙基]-N，N，N-三甲基氯化铵(D0TAP)和胆固醇；1-[2-(油酰基氧基）乙基]-2-油基-3-(2-羟乙基）咪唑啉鑰氯化物(D0TIM)和胆固醇；以及二甲基双十八烷基溴化铵 (DDAB)和胆固醇。15. 权利要求11的免疫调节剂组合物，其还包含药学上可接受的载体。16. 免疫调节剂组合物，其包含： a. 与SEQ ID NO: 4的序列具有至少84%序列同源性的核酸序列;和 b. 脂质体递送媒介物。17. 权利要求16的免疫调节剂组合物，其中所述核酸分子包含与SEQ ID NO: 4的序列 具有选自 85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%和99%的序列同 源性的核酸序列。18. 权利要求16的免疫调节剂组合物，其中所述核酸分子包含SEQ ID NO: 4。19. 权利要求16的免疫调节剂组合物，其中所述脂质体递送媒介物包含选自以下的脂 质对:N-[l-(2,3-二油基氧基)丙基]-N，N，N-三甲基氯化铵(D0TMA)和胆固醇;N-[l-(2,3-二油酰基氧基）丙基]-N，N，N-三甲基氯化铵(D0TAP)和胆固醇；1-[2-(油酰基氧基）乙基]- 2- 油基-3-(2-羟乙基）咪唑啉鑰氯化物(DOTIM)和胆固醇；以及二甲基双十八烷基溴化铵 (DDAB)和胆固醇。20. 权利要求16的免疫调节剂组合物，其还包含药学上可接受的载体。21. 刺激个体中的免疫应答的方法，其包括向所述个体施用免疫调节剂组合物，其中所 述免疫调节剂组合物包含与SEQ ID NO: 1的序列具有至少89%序列同源性的核酸序列和 脂质体递送媒介物。22. 权利要求21的方法，其中所述脂质体递送媒介物包含选自多层囊泡脂质和挤出脂 质的脂质。23. 权利要求21的方法，其中所述脂质体递送媒介物包含选自以下的脂质对:N-[l-(2， 3- 二油基氧基）丙基]-N，N，N-三甲基氯化铵(D0TMA)和胆固醇;N-[ 1-(2,3-二油酰基氧基） 丙基]-N，N，N-三甲基氯化铵(D0TAP)和胆固醇；1 - [ 2-(油酰基氧基）乙基]-2-油基-3- (2-羟 乙基)咪唑啉鑰氯化物(D0HM)和胆固醇；以及二甲基双十八烷基溴化铵(DDAB)和胆固醇。24. 权利要求21的方法，其中施用选自静脉内、肌内、皮内、腹膜内、皮下、通过喷雾、通 过气溶胶、卵内、口服、眼内、气管内和鼻内。25. 权利要求21的方法，其中所述免疫调节剂组合物还包含生物试剂。26. 权利要求25的方法，其中所述生物试剂选自免疫增强剂蛋白、免疫原、疫苗、抗微生 物剂及其任何组合。27. 权利要求21的方法，其中所述施用是在暴露于感染病原体之前。28. 权利要求21的方法，其中所述施用是在暴露于感染病原体之后。29. 权利要求21的方法，其中所述刺激的免疫应答选自非抗原特异性免疫应答、抗原特 异性免疫应答、固有免疫应答、适应性免疫应答、体液免疫应答、细胞介导的免疫应答或其 组合。30. 权利要求21的方法，其中所述个体选自哺乳动物物种、水产养殖物种和禽类物种。31. 权利要求21的方法，其还包含药学上可接受的载体。32. 刺激个体中的免疫应答的方法，其包括向所述个体施用免疫调节剂组合物，其中所 述免疫调节剂组合物包含与SEQ ID NO: 4的序列具有至少84%序列同源性的核酸序列和 脂质体递送媒介物。33. 权利要求32的方法，其中所述脂质体递送媒介物包含选自多层囊泡脂质和挤出脂 质的脂质。34. 权利要求32的方法，其中所述脂质体递送媒介物包含选自以下的脂质对:N-[l-(2， 3-二油基氧基）丙基]-N，N，N-三甲基氯化铵(D0TMA)和胆固醇;N-[ 1-(2,3-二油酰基氧基） 丙基]-N，N，N-三甲基氯化铵(D0TAP)和胆固醇；1 - [ 2-(油酰基氧基）乙基]-2-油基-3- (2-羟 乙基)咪唑啉鑰氯化物(D0HM)和胆固醇；以及二甲基双十八烷基溴化铵(DDAB)和胆固醇。35. 权利要求32的方法，其中施用选自静脉内、肌内、皮内、腹膜内、皮下、通过喷雾、通 过气溶胶、卵内、口服、眼内、气管内和鼻内。36. 权利要求32的方法，其中所述免疫调节剂组合物还包含生物试剂。37. 权利要求36的方法，其中所述生物试剂选自免疫增强剂蛋白、免疫原、疫苗、抗微生 物剂及其任何组合。38. 权利要求32的方法，其中所述施用是在暴露于感染病原体之前。39. 权利要求32的方法，其中所述施用是在暴露于感染病原体之后。40. 权利要求32的方法，其中所述刺激的免疫应答选自非抗原特异性免疫应答、抗原特 异性免疫应答、固有免疫应答、适应性免疫应答、体液免疫应答、细胞介导的免疫应答或其 组合。41. 权利要求32的方法，其中所述个体选自哺乳动物物种、水产养殖物种和禽类物种。42. 权利要求32的方法，其还包含药学上可接受的载体。
【文档编号】A61K38/00GK106029867SQ201580010413
【公开日】2016年10月12日
【申请日】2015年2月27日
【发明人】A.艾克, H.韦尔曼, M.蒙内斯, R.绍尔, A.阿伯拉罕, C.魏斯, E.费尔德休斯
【申请人】拜耳动物保健有限责任公司