球状体制造装置、球状体的回收方法及制造方法

球状体制造装置、球状体的回收方法及制造方法
【专利摘要】本发明提供了通过简单的方法大量制造均一的球状体的球状体制造装置。该球状体制造装置(1)至少设置有第一表面(11)、第二表面(12)和多个壁面(13)。第二表面(12)为面向第一表面(11)的面。壁面(13)形成了贯通第一表面和第二表面的多个孔。此外，第一表面(11)的开口部的内接圆的等效直径大于第二表面(12)的开口部的内接圆的等效直径。
【专利说明】
球状体制造装置、球状体的回收方法及制造方法
技术领域
[0001] 本发明涉及适用于大量且高密度培养具有均一大小的球状体的装置及使用该装 置的方法。
【背景技术】
[0002] 非专利文献1指出三维培养方法适于比二维培养方法更正确地模仿活体组织的机 能。非专利文献1还指出了三维培养方法为用于有效率地分化多能干细胞和iPS细胞的方法 之一。进行了通过使用该技术将三维培养的人造组织送回体内来重建和补充缺失的机能的 尝试。此外，还进行了将该技术应用于辅助受损组织修复的再生医疗的尝试。还进行了使用 该技术来检查医药品的毒性的尝试。特别地，为了再生医疗及其研究，要求大规模制造具有 均一大小和形状的细胞块。另外，比现有方法更简便且成本更低的方法是必要的。
[0003] [制造均一大小和形状的细胞块的意义]
[0004] 在肝细胞的情况下，存在在体外不能再现体内的机能的问题。该问题的一示例为 在肝细胞为二维培养的情况下肝细胞的本来有的药物代谢机能劣化了。用于解决该问题的 手段之一为非专利文献2中公开的形成细胞块的方法。非专利文献2指出了通过该方法制造 的细胞块的机能与二维培养的细胞的机能相比获得了显著地改善。
[0005] 在将胚胎干细胞或诱导性多能干细胞分化为体外的目标细胞的情况下，跟着开发 和分化的过程启动，形成了被称为拟胚体(embryoid body)的细胞块，以由此将胚胎干细胞 或诱导性多能干细胞分化为目标细胞。非专利文献3报告了细胞块的大小会影响分化的方 向性。
[0006] [关于制造大量的均一大小和形状的细胞块的技术]
[0007] 非专利文献4公开了在液滴中进行培养的所谓的悬滴法(hanging drop method) 的培养方法。非专利文献4还公开了底为U形或V形的低粘着性板。非专利文献4还公开了使 用生物反应器的大规模培养方法。悬滴法、U形底的板等适用于制造具有均一大小和形状的 细胞块。另一方面，悬滴法、U形底的板等不适用于大规模培养，因为它们在一个加样孔 (well)中仅允许制造一个细胞块。尽管广泛地采用悬滴法进行研究，但是悬滴法不适于大 规模培养来同时制造数百、数千个以上的级别的细胞块。
[0008] 非专利文献4公开了使用低粘着性容器的方法。非专利文献4还公开了对使用滚瓶 (ro 11 er bo111 e)的方法的开发。此外，还公开了对用于在凝胶(ge 1)或微珠(beads)中固化 细胞以进行悬浮培养的方法的开发。尽管这些方法使得能够以高密度生产数千个细胞块， 但是存在所生产的细胞块不均质的问题。开发了能够大规模生产比较均质的细胞块的低转 动的滚瓶。然而，这些方法要求伴随着复杂操作的大规模设备。此外，即使精确地控制滚瓶 等的转速，但是任意相邻的细胞和细胞块在溶液内可能不规则地彼此会合以形成另一细胞 块。因而难以生产均一大小的细胞块。
[0009] 例如，专利文献1公开了大量且方便地生产细胞块的集团的方法的一示例。在该集 团中，诸如细胞块的大小和形状以及细胞外的性质等的形态特征是均一的。在专利文献1公 开的方法中，将包含细胞的培养液注入结构构件的中空部中，其中中空部的至少下侧的一 端是开口的。此时，使得培养液的一部分从该开口端向下侧突出。在本方法中，在培养液的 突出部中培养细胞。该方法在中空部的上端关闭的情况下将培养液注入中空部存在问题。 该方法的另一问题是用于形成培养液的突出部的过程复杂。此外，该过程的问题在于必须 精确地调整注入量。尽管当中空部的两端开口的情况下能够有效地进行培养液的注入(吸 入），但是在该方法中存在另一问题。该问题是上端需要封闭或者需要进一步包括用于维持 吸入压力的机构以便维持培养液被注入的状态。由于能够涉及细胞的新陈代谢的培养液的 量受到中空部的容积的限制，因此对该方式产生了新的限制。新限制之一是细胞浓度和培 养期间受到所使用的细胞的新陈代谢活性的限制。细胞块的可用大小和细胞的种类也受到 这种新限制的限制。专利文献2公开了比专利文献1中公开的技术更容易注入培养液的悬浊 板(suspension plate)。专利文献2公开了培养液从第一表面起在第二表面连通的结构。然 而，利用专利文献2公开的方法，与待制成的细胞块的数量成比例地增加了注入操作的数 量。因此，操作复杂的问题依然存在。
[0010] 现有技术文献
[0011] 专利文献
[0012] 专利文献1:日本特许第5074382号公报
[0013] 专利文献2:国际公开第2010/031194号
[0014]非专利文献
[0015] 非专利文献1 :Kenneth M.Yamada等著的"以三维的方式进行组织形态发生与肿瘤 的建模（Modeling Tissue Morphogenesis and Cancer in 3D)，细胞期刊130,2007年9月 24日，第601-610页
[0016]非专利文献2:Erik Eschbach等著的"高细胞密度的肝组织培养的微结构支架:组 织块的形态和生化特征（Microstructured Scaffolds for Liver Tissue Cultures of High Cell Density:Morphological and Biochemical Characterization of Tissue Aggregates )，细胞生物化学期刊95，2005年，第243-255页
[0017]非专利文献3:CL Bauwens等著的"人类胚胎干细胞集落的控制及凝集大小的不均 一性对分化轨迹的影响（Control of Human Embryonic Stem Cell Colony and Aggregate Size Heterogeneity Influences Differentiation Trajectories)，干细胞 期刊26，2008年，第 2300-2310 页
[0018] 非专利文献4:Sasitorn Rungarunlert等著的"基于胚胎和诱导多能干细胞的胚 体形成：生物反应器的益处（Embryoid body formation from embryonic and induced pluripotent stem cells:Benefits of bioreactors)，世界干细胞期刊1(1)，2009年 12月 31日，第11-21页

【发明内容】

[0019] 发明要解决的问题
[0020] 如上所述，使用用于悬滴法的容器的传统的培养方法和使用转瓶的培养方法具有 优点和缺点。因而，难以制造具有均一形状和大小的大量的细胞块。数百或数千个级别的大 规模生产这种细胞块特别困难。
[0021 ]有鉴于上述问题做出了本发明。
[0022]用于解决问题的方案
[0023]本发明人已经调查了用于培养细胞的装置和培养基之间发生的物理现象。作为调 查的结果，本发明人利用简单的方法实现了用于制造球状体(spheroid)的装置。
[0024] 在本发明的一示例性方面，球状体制造装置至少包括第一表面、第二表面和多个 壁面。第二表面为第一表面的背面。各壁面形成了贯通第一表面和第二表面的多个孔。另 外，第一表面的开口部的内接圆的等效直径大于第二表面的开口部的内接圆的等效直径。 根据上述示例性方面，能够提供适于简单地制造大量球状体的装置。该装置能够使得培养 基从配置在上侧的第一表面注入并且从配置在下侧的第二表面回收所制造的球状体。这便 于细胞的接种步骤以及细胞的培养步骤。因而，能够降低这些步骤所要求的时间。另外，在 球状体制造装置中形成直径从第二表面朝向第一表面增大的孔存在如下优点。首先，能够 容易地将培养液从第一表面朝向第二表面浸入装置。其次，随着落入(sett le)的细胞的密 度在第二表面附近变大，能够促进球状体的形成。除了上述优点，还易于制造装置本身。
[0025] 在球状体制造装置的另一示例性方面，通过孔形成的开口部的内接圆的等效直径 优选地大于第二表面的开口部的内接圆的等效直径的长度。第二表面的开口部的内接圆的 等效直径优选地在200微米至1厘米的范围。各壁面的至少一部分优选地以相对于第二表面 成大于1度且小于90度的角度倾斜。当使用疏水性材料时，优选地，考虑装置的材质和培养 基之间的接触角来确定第二表面的开口部的外接圆的等效半径(等效直径的一半长度）。当 使用亲水性材料时，优选地，考虑装置的材质和培养基之间的接触角来确定第二表面的开 口部的内接圆的等效半径。
[0026] 在用于回收通过使用上述球状体制造装置制造的球状体的方法的另一示例性方 面中，该方法包括使球状体制造装置的第二表面与选自水、培养基和缓解溶液的溶液接触 以回收球状体。可选地，该方法包括对球状体制造装置的第一表面施加压力以使得球状体 通过第二表面的开口部回收。根据以上任意的回收方法，能够容易地回收球状体而不会损 伤球状体。
[0027] 在使用上述球状体制造装置制造球状体的方法的又一示例性方面中，该方法包括 从第一表面将包含细胞的培养基注入各孔中、在各孔中形成液滴并且在液滴中培养细胞以 生产球状体。优选地，使用上述回收方法来回收通过本发明制造的球状体。
[0028]发明的效果
[0029] 本发明的示例性方面为适于通过简单的技术大规模制造均一的球状体的球状体 制造装置、球状体回收方法以及球状体制造方法。本发明的示例性方面能够提供适于大量 制造均一的球状体的简单方法。
【附图说明】
[0030] 图1为示出了根据一示例性实施方式的球状体制造装置的一示例的图。
[0031] 图2为沿着图1中示出的球状体制造装置的线II-II截取的截面图。
[0032] 图3为用于说明球状体制造装置的细节的图。
[0033] 图4为示出了使用根据一示例性实施方式的球状体制造装置的细胞培养容器的一 示例的图。
[0034] 图5为用于说明施加于液滴的力的图。
[0035] 图6为用于说明壁面的材料与培养基之间的接触角的图。
[0036]图7为用于说明角度9〇的图。
[0037] 图8为用于说明液面与水压之间的关系的图。
[0038] 图9为用于说明在水压大于图8中的水压的情况下液面与水压之间的关系的图。
[0039] 图10为用于说明在水压大于图8和图9中的水压的情况下液面与水压之间的关系 的图。
[0040] 图11为用于说明在液面和水压达到平衡的情况下的第二表面的开口部的表面张 力的图。
[0041] 图12为用于说明在气体与水压达到平衡的情况下的第二表面的开口部的表面张 力的图。
[0042 ]图13为用于说明制造球状体的步骤的图。
[0043] 图14为用于说明制造球状体的步骤的另一示例的图。
[0044] 图15为用于说明回收球状体的方法(使用培养基)的图。
[0045] 图16为用于说明回收球状体的另一方法(加压)的图。
[0046] 图17为示出了球状体制造装置的截面的形状例的图。
[0047] 图18为示出了球状体制造装置的截面的另一形状例的图。
[0048] 图19为示出了球状体制造装置的截面的另一形状例的图。
[0049] 图20为示出了球状体制造装置的截面的另一形状例的图。
[0050] 图21为示出了球状体制造装置的截面的另一形状例的图。
[0051] 图22为示出了球状体制造装置的截面的另一形状例的图。
[0052]图23为示出了球状体制造装置的开口部的形状例的图。
[0053]图24为示出了球状体制造装置的开口部的另一形状例的图。
[0054]图25为示出了球状体制造装置的开口部的另一形状例的图。
[0055]图26为示出了球状体制造装置的开口部的另一形状例的图。
[0056]图27为用于说明在实施例中使用的球状体制造装置的形状的图。
[0057] 图28为沿着图27的线XXVIII-XXVIII截取的截面图。
[0058]图29为用于说明在实施例中使用细胞培养容器的构造的图。
[0059]图30为沿着图29的线XXX-XXX截取的截面图。
[0060]图31为实施例1的球状体回收前的培养面的照片。
[0061 ]图32为图31的被放大的照片。
[0062]图33为根据实施例1和比较例1的回收后的球状体的显微镜照片。
[0063]图34为在实施例1中球状体回收后的装置表面的照片。
[0064]图35为根据比较例1的球状体的照片。
[0065] 图36为示出了根据实施例1和比较例1的颗粒直径分布的图表。
[0066] 图37为示出了根据实施例1的细胞数改变的情况下的颗粒直径分布的图表。
【具体实施方式】
[0067] 以下，将参照附图来说明示例性实施方式。为了明确说明，以下的记载一部分和附 图的一部分已经被适当地省略或简化。注意，在附图中，具有相同构造或功能的元素以及对 应的部分采用相同的符号进行标识，并将省略重复的说明。
[0068] 第一示例性实施方式
[0069] 图1为根据一示例性实施方式的球状体制造装置的一示例。图2为沿着图1中示出 的球状体制造装置的线II-II截取的截面图。球状体制造装置1为用于通过在以液滴形状形 成的培养基中培养细胞、然后凝集(aggregating)细胞以得到球状体来制造球状体的装置。 球状体为三维的、大量凝集的细胞。
[0070] 球状体制造装置1至少包括第一表面11、第二表面12和壁面13。图1为示出了从第 一表面11侧观察球状体制造装置1的图。
[0071] 第一表面11为球状体制造装置1的上表面并且为在注入培养基等以培养细胞时位 于上侧的面。
[0072] 第二表面12为面对第一表面11的面。第二表面12形成了球状体制造装置1的底(底 面)并且为上表面(第一表面11)的背面。
[0073] 壁面13形成了贯通第一表面11和第二表面12的孔（贯通孔）。此外，壁面13用于形 成在第一表面11和第二表面12中的开口部并且使得第一表面11与第二表面12连通。
[0074] 另外，在球状体制造装置1中，采用如下方式设计通过壁面13形成的孔:该孔的靠 近第二表面12形成的开口部将小于该孔的靠近第一表面11形成的开口部。使用等效直径来 比较开口部的大小。
[0075] 术语"等效直径"被用作内接圆的等效直径和外接圆的等效直径的统称。"外接圆 的等效直径"为外接于开口部的圆的直径并且用作在与第二表面12平行的平面上绘制的外 接圆的直径。例如，在与第二表面12平行的平面上绘制的外接圆的直径被用作在第一表面 11和第二表面12之间形成的孔的开口部的等效直径。"内接圆的等效直径"为内接于开口部 的圆的直径并且用作在与第二表面12平行的平面上绘制的内接圆的直径。例如，在与第二 表面12平行的平面上绘制的内接圆的直径被用作在第一表面11和第二表面12之间形成的 孔的开口部的等效直径。由附图中的符号"D"表示的长度为外接圆的等效直径Dout或内接 圆的等效直径Din。符号"D"没有明确区分Dout和Din。
[0076] 以下将参照图3说明开口部的大小的细节。
[0077]除了图1和图2之外，将参照图3更详细地说明球状体制造装置1的构造。图3为用于 说明球状体制造装置的细节的图。图3使用了图2中示出的截面图，其为了易于说明而没有 使用表示截面的斜线。
[0078]至少考虑角度0i、第二表面12的开口部的外接圆的等效直径Dout或第二表面12的 开口部的内接圆的等效直径Din、用于装置的材质、以及用于细胞培养的培养基8来设计球 状体制造装置1。优选地，还可以考虑厚度T和宽度W。
[0079]角度0i为壁面13的斜面相对于第二表面12形成的角度。壁面13的斜面的至少一部 分可以相对于第二表面12形成角度0i。另一方面，形成了孔的整个壁面13可以不以角度0i 进行倾斜。角度优选地大于1度且小于90度，更优选地在30度至80度的范围。这便于培养 基8注入孔中。可选地，这使得所有接种的细胞在它们自身的重量的作用下沉降（settle down)到液滴的下部而不会停留在壁面13上。因此，可以有效率地培养细胞。
[0080]厚度T为球状体制造装置1的从第一表面11至第二表面12的厚度。厚度T可以为能 够承受培养基8的重量的厚度。
[0081]第二表面12的开口部的外接圆的等效直径Dout为外接于在第二表面12形成的开 口部的外接圆的直径。
[0082]第二表面12的开口部的内接圆的等效直径Din为内接于在第二表面12形成的开口 部的圆的直径。此外，外接圆的等效半径Rout为外接圆的等效直径Dout的长度的一半。内接 圆的等效半径Rin为内接圆的等效直径Din的长度的一半。
[0083]在一示例性实施方式中，以如下方式设计第一表面11的开口部的内接圆的等效直 径:该内接圆的等效直径将大于第二表面12的开口部的内接圆的等效直径Din。
[0084]另外，第二表面12的开口部的内接圆的等效直径Din优选地为球状体的期望大小 的1倍至10倍(例如200wii至lcm)。此外，每单位面积的孔的数量越多，则在小面积范围能够 制造越多的细胞块。因而，第二表面12的开口部的内接圆的等效直径Din更优选地为细胞块 的期望直径的1倍至2倍。
[0085] 上表面的宽度W为形成一个孔的壁面13与形成另一个相邻的孔的壁面13之间的宽 度。此外，上表面的宽度W为相对于第二壁面12以角度0i倾斜的壁面13终止的位置处的宽 度。换句话说，形成相邻的孔的两个壁面13具有从第二表面12向第一表面11的斜面，并且上 表面的宽度W能够被认为是使得斜面具有角度0i的端部的宽度。
[0086] 图3示意性地示出了直到培养基8的高度(深度)达到高度(深度)H地从第一表面11 (从第一表面11的开口部)对孔和球状体制造装置1的上方的空间注入培养基8的状态。如图 4所示，该空间对应于加样孔容器91内的空间。在图3中示出的球状体制造装置1的构造例 中，以如下方式注入培养基8:使培养基8从第二表面12的开口部突出。从第二表面12突出的 部分为液滴81。换句话说，以使得形成液滴81的方式将培养基8注入球状体制造装置1。液滴 81在培养细胞以形成球状体时用作三维的细胞培养器。液滴81的向下的液面形成为具有预 定的曲率半径的曲面。能够通过杨-拉普拉斯的关系式、即AP = Hp=Yi(l/rl+l/r2)来表 示液滴周围的空气与液体之间的压力差△ P(P-Pair)。在该关系式中，y l为液体的表面张 力[g/cm]，rl和r2为彼此正交的曲率半径。在液滴81的表面为球面的情况下满足rl=r2。随 着这些曲面向下凸，形成液滴81。
[0087] 作为图3的变形例，当从第一表面11 (从第一表面11的开口部)注入培养基8时，能 够以如下的方式调整该注入:培养基8的高度(深度)H将比上述高度(上述深度)低。在这种 情况下，在图3中示出的球状体制造装置1的构造例中，以如下的方式注入培养基8:使培养 基8注入到使第二表面12的开口部连接到第一表面11的开口部的斜面(壁面13)的途中。将 在稍后说明的图14示意性地示出了使培养基8注入到斜面的途中以培养细胞的状态。
[0088] 稍后将参照【附图说明】诸如用于装置的材料的材质、用于细胞培养的培养基的性 质、等效直径等的关于球状体制造装置的设计的细节。
[0089] 注意，在图3中，确切地说，壁面13为相对于第二表面12维持角度0i的面。此外，可 以将第一表面11与壁面13之间的斜面称为上表面。可选地，在广义的第一表面11中，第一表 面11可以包括不与第二表面12平行的面(上表面）。在这些术语与本发明的示例性实施方式 的本质性无关的情况下，将不对这些术语进行明确的区分。
[0090] 图4示出了使用根据一示例性实施方式的球状体制造装置的细胞培养容器的一示 例。细胞培养容器9为细胞培养容器的基本结构的一示例。在细胞培养容器9中，球状体制造 装置1被安装到加样孔容器91。皮氏培养皿(Petri-dish)92配置在加样孔容器91的外侧。
[0091]球状体制造装置1和加样孔容器91可以由相同的材料或彼此不同的材料制成。由 于加样孔容器91提供了供培养基8注入的空间，因此加样孔容器91可以由任意材料制成，只 要该材料对细胞没有毒性即可。另一方面，皮氏培养皿92可以具有不会与球状体制造装置1 的第二表面12和液滴81接触的形状。
[0092]供球状体制造装置1安装的容器不限于图4中示出的结构。当通过球状体制造装置 1培养细胞时，球状体制造装置1可以安装到多加样孔板(multi-well plate)或皮氏培养 皿，然后进行使用。可以以任意方式使用球状体制造装置1，只要第二表面12(底面)和液滴 18不会与多加样孔板或皮氏培养皿接触即可。
[0093] 以下，将详细地说明球状体制造装置的设计。优选地，当设计球状体制造装置1的 材质和表面、第二表面12的开口部的内接圆的等效直径Din、或第二表面12的开口部的外接 圆的等效直径Dout时考虑以下的物理现象。特别地，还优选考虑壁面13的材质与培养基8之 间的接触角9c。进行如上考虑的原因在于球状体制造装置1的接触角0c会受到用于装置的 材料的材质、培养基的性质等的影响。在以下的说明中，首先，将调查考虑与接触角9c相关 的物理现象对球状体制造装置1的设计。此后，将说明其它要素。
[0094] 图6为用于说明呈现于壁面13上的材料的材质与培养基8之间的接触角0c的示意 图。接触角9c为液体的相对于固体的接触角。由固体和液体的性质确定该接触角9c。此外， Y s为固体的表面张力[g/cm]，y sl为固液表面张力[g/cm]，y l为液体的表面张力[g/cm]。
[0095] 由固体和液体的性质确定接触角0c。更具体地，由用于球状体制造装置1的材料的 材质(呈现于壁面13上的材料的材质)和培养基8的性质来确定接触角9c。
[0096]〈对接触角0c的调查〉
[0097] (1)接触角0c在-1〈C〇S0C彡0的范围的情况
[0098]在这种情况下，液滴的大小不受接触角的影响。容许范围为角度00 = 90度。
[0099] 在接触角0c在-l〈C〇S0c<O的范围的情况下，一般地认为球状体制造装置1由疏水 性的材料制成。在这方面，第二表面12的开口部的内接圆的直径Din小于第一表面11的开口 的内接圆的直径。另外，外接圆的等效直径Dout的大小将变得重要。
[0100] 图5为用于说明施加于液滴81的力的图。在图5中，以液滴81的形状为半球形为前 提。第二表面被水平地配置。实际上，液滴81为与培养基8之间没有边界地与培养基8连续的 液体。在图5中，为了易于说明，使用与培养基8不同的斜线限定作为液滴81的范围。
[0101] F0至F2作为施加于液滴81的力和与重力平行地作用的力。
[0102] F0为施加于液滴81的重力的力且由下式进行计算。
[0103] F0 =体积X比重
[0104] =V ? a
[0105] F1为施加于液滴81的从液体(培养基8)的水压得到的力且由下式进行计算。
[0106] Fl=水压 X 面积=pS
[0107] 在大气压的情况下，
[0108] F1 =从上液面到液滴的深度X液体的密度X面积
[0109] =HpS
[0110] F2为从在液面的边缘产生的液体的表面张力得到的力且由下式进行计算。
[0111] F2 =外周X液体表面张力X角度
[0112] =L y Lsin9〇
[0113] 能够通过诸如吊片法(Wilhelmy method)等的各种方法来测量液体的表面张力 Y l。可选地，能够从分销商(distributor)得到信息。能够通过测量使用液滴法和气液法测 量待使用的液体(培养基和缓冲液)和材料来测量接触角9 c。
[0114] 在图8中，YSL还与水面在壁面上停留的条件有关。另一方面，YSL与如图9的保持 液滴的条件无关。此时，认为tsl在第二表面的方向上起作用。
[0115] 在上述各式中，体积V为液滴81的体积[cm3]，比重a为培养基8的比重。高度H为与 从培养基8的上表面至液滴81的下端的深度[cm]相等的高度，密度P为培养基8的密度[g/ cm] 〇
[0116] 面积S为产生液滴81的位置(孔中的液滴形成的位置)处的开口部的面积的大小。 在本示例中，面积S为与第二表面12接触的边界的面积[cm 2]且与第二表面12的开口部的面 积相同。
[0117] 水压p为第二表面12的开口部处的水压[g/cm2]。外周的长度L为液滴与第二表面 12接触的边界的长度[cm]。长度L等于第二表面的开口部的周围的长度。固液表面张力ysl 为壁面13和培养基8之间的表面张力(界面张力）[g/cm]。角度0〇为液滴81的表面与水平面 或水平地配置的第二表面12所成的角度。在液滴81为图5中的半球形的情况下，角度0〇 = sin90°=l。角度0〇为液滴81所接触的边缘部处的接触面与水平面所成的角度。可选地，角 度为该接触面相对于水平配置的第二表面12所成的角。图7为用于说明角度0〇的图。
[0118] 当满足以下的式1时，液滴81被保持于球状体制造装置1。
[0119] F0+F1〈F2 …式 1
[0120] 在如图8所示地液滴停留在壁面13上的情况下，F2能够通过来自上述计算式的下 式表不。
[0121] F2 = L y sLsin9i+L y Lsin9〇
[0122] (其中0:为壁面的倾斜角）
[0123] 因而，能够通过以下的式2来表示式1(F0+F1〈F2)。
[0124] Va+pS〈L y sLsin9i+L y Lsin9〇…式2
[0125] 此外，在如图9所示的液滴与第二表面12连续的情况下，能够通过下式表示F2。
[0126] F2 = L y Lsin9〇
[0127] 因此，能够通过下式3表示式1 (F0+F1〈F2)。
[0128] Va+pS〈LyLsin9()…式 2-2
[0129] 认为使用具有接触角0c的材料将培养基8注入直到高度H。当液滴开始变窄时，液 滴81开始从第二表面12向外侧突出。此时，满足F0+F1=F2。角度0〇为90度(sin90 = l)。
[0130]能够通过下式表示F0,其中V为液滴81的体积，Rout为第二表面12的开口部的外接 圆的等效半径，a为比重。
[0131] F0 = ((4/3)JiRout3 + 2) Xa=(2/3)JiR3 ? a
[0132] 然而，当液滴81为半球形时，通过[(球的体积）+2]来计算体积V。
[0133] 此外，当通过等效半径R表示开口部的面积S和开口部的外周的长度L时，满足下 式。
[0134] S = 3rRout2,L = 23iRout
[0135] 基于式3
[0136] (2/3)JiRout3 ? a+pjiRout2
[0137] =23iRoutL y Lsin90
[0138] 在该式中，sin90 = l。
[0139] 因此，
[0140] (2/3)aR〇ut2+pRout = 2 y l…式3
[0141]也就是，在式3中外接圆的等效半径Rout优选地为第二表面12的开口部的最大等 效半径。第二表面12的开口部的直径优选地为2Rout以下。更优选地，考虑来自细胞块的重 力施加的力(Fc)来设计装置。
[0142] 如上所述，在接触角0c在-l〈C〇S0c〈O(接触角为90度以上，且0〇不超过0c)的情况 下，优选地，第二表面12的开口部的外接圆的等效直径Dout为通过式3计算的外接圆的等效 半径的两倍以下。利用该示例性实施方式，能够在球状体制造装置1中维持液滴。
[0143] (2)接触角0 c在0〈C〇s 0 c〈 1的范围的情况
[0144] 在接触角0c在O〈C〇S0c〈l的范围的情况下，一般认为球状体制造装置1由亲水性材 料制成。在设计使用这种材料的情况下的第二表面的开口部12的大小时使用内接圆的等效 直径。
[0145] 将参照图8和图9来说明液面和水压之间的关系。当使用图8中的水压pi作为基准 时，图9示出了水压p2大于图8的水压pi的情况(pl〈p2)。图10示出了水压大于图8和图9的水 压的情况(Pl〈p2〈p3)。图8示出了水压pi的大小与液面达到平衡且液体没有落下而停止的 状态。图9示出了因为水压p2大于水压pi使得与图8的状态相比液面更接近第二表面12的状 态。在图9中，水压p2的大小与液面达到平衡。图5中的高度H越大(培养基8的量越多），则水 压越大。结果，当超过接触角9c时，如图10所示地，液体、装置和空气彼此接触的三重线移 动了。因而，液面到达第二表面12的开口部周围并且附着于第二表面12。在图10所示的状态 中，从球状体制造装置1的上方持续地供给液体。结果，液滴增大且滴下，由此使得难以在各 孔中稳定地保持1个液滴。也就是，图8和图9中示出的状态是优选的。
[0146] 因此，优选地，以使得满足以下条件的方式设计球状体制造装置1。图12为用于说 明当液面与水压达到平衡时的第二表面12的开口部的表面张力的图。图11示出了当调整表 面张力以实现图9的状态的情况。
[0147] 避免图10的状态的条件为固体的表面张力ys不超过固液界面张力Ysl和液面的 表面张力（TLCOS9Q)之和。也就是
[0148] y y SL+y LCOS0。…式5
[0149] 比较式5与Young的式（y s= y sl+y lcosL)，当满足时，稳定地维持了液滴。
[0150] 图6是用于说明壁面13的材质与培养基8之间的接触角0c的示意图。接触角0c为液 体相对于固体的接触角并且通过固体和液体的性质进行确定。在关系式中，Y s为固体的表 面张力[g/cm]，y sl为固液表面张力[g/cm]，y l为液体的表面张力[g/cm] 〇
[0151] 通过固体和液体的性质确定接触角0c，更具体地，通过球状体制造装置1的材质 (第二表面12和壁面13的材质)和培养基8的性质确定接触角0 c。
[0152] 优选地，在因特网（http : / /www .surface-tension.de/solid-surface- energy . htm)上或从分销商等得到固体的表面张力y sl。可选地，可以通过使用奇斯曼法 (Zisman method)计算固体的表面张力y l。能够通过诸如吊片法等的各种方法来测量液体 的表面张力Yl。可选地，能够从分销商得到信息。能够通过使用液滴法和气液法测量待使 用的液体(培养基和缓冲液)和材料来测量接触角9c。因而，能够通过将y l和y s的值代入式 丫 SL= 丫 LCOS0C- y S中导出 丫 SL〇
[0153] 因此，式5为
[0154] y y lcosQc- y s+ y lcosQc
[0155] y lcosQc-y s^O…式6
[0156] 如图12所示，对于液滴81的向下的液面，符合杨-拉普拉斯的关系式的液滴周围的 空气与液体之间的压力差AP(P-Pair)能够被表示为：
[0157] A P = p= y L( l/rl+l/r2)…式7
[0158] 在大气压的情况下，通过下式进行表示。
[0159] AP = Hp= y L(l/rl+l/r2)…式7-2
[0160]液滴具有曲面且向下凸。在该式中，y l为液体的表面张力[g/cm]，rl [cm]和r2 [cm]为在表面的1点彼此正交的曲率半径。
[0161 ]在液滴81的表面为球面的情况下，满足rl =r2。因而，
[0162] p= y LX (2/r)…式8
[0163] 在大气压的情况下，通过下式进行表示。
[0164] Hp= yLX(2/r)…式 8-2
[0165] 如上所述，当液滴流过第二表面12的瞬间，难以保持该液滴。有鉴于此，在接触角0 c在O〈C〇S0c〈l的范围的情况下，将参照图12检查当0 Q = 0c的诸条件与第二表面12的开口部 的内接圆的等效直径Din之间的关系。
[0166] 在大气压的条件下使用具有y s的性质的材料将具有p和y L的性质的培养基注入 到高度H[cm]的情况下，选择满足从式6导出的cos0c> y s/ y l的材料。
[0167] 从基于曲率半径估计的圆的中心向下绘制垂直的辅助线，满足下式。
[0168] Din = 2r ? sin9〇
[0169] 基于式8-2,由于r = 2Hp y L，其能够由下式表示。
[0170] Din = 4 ? y L ? sin9〇/Hp…式9
[0171] 在液滴能够流过第二表面12的极限，将0〇 = 0。带入上式，由下式表示能够保持液滴 的内接圆的最大直径Din(max) 〇
[0172] Din(max) =4 ? y L ? sin9c/Hp…式9-2
[0173]也就是，优选地以使得内接圆的直径将小于由上式计算的值的方式设计装置。
[0174] 当在这种条件下设计装置时，不管接触角0。（8卩，不管装置的材料属于疏水性或亲 水性），优选地，当设计装置时考虑培养基中的蛋白质被材料的吸收。因而，优选地，第二表 面12的开口部的大小为在所计算的等效半径R的最大值的20%_80%的范围的值。此外，优 选地，以使得从培养基8的高度H得到的水压在所导出的最大水压p的50 % -80 %的范围的方 式调整培养基8的高度H，以便调整培养基的量。
[0175] 如上所述，可以制造通过根据接触角0。设计内接圆的等效直径Din和外接圆的等 效直径Dout来适当地形成液滴的球状体制造装置1。换句话说，可以根据用于球状体制造装 置1的材质和用于细胞培养的培养基8的性质来设计和制造球状体制造装置1。由于能够通 过球状体制造装置1形成适用于细胞培养的液滴，因此期望能够使用球状体制造装置1有效 率地制造大量的球状体。另外，期望通过使用球状体制造装置1形成适当的液滴来制造均一 的球状体。
[0176]注意，在上述（1)至（3)中，已经提出了用于根据接触角0。的值所在的范围来设计 球状体制造装置1的计算式。这是由于，优选地根据球状体制造装置1的材质或培养基8的性 质对多个设计方法进行了试验。此外，这是由于，使用了优选的计算式来适当地设计和制造 球状体制造装置1。
[0177] 〈上表面的宽度〉
[0178] 分隔空间的壁的上表面的宽度W优选地为5_以下。更优选地，宽度W为2_以下，使 得细胞将不会停留于或静置于上表面(第一表面11和第一表面11的附近）。优选地，与上表 面的宽度W-起，考虑上表面的形状(从第一表面11起到上表面的宽度的上部的形状）。稍后 这将参照图17至图22进行详细地说明。
[0179] 〈球状体制造装置的材质〉
[0180]优选地，球状体制造装置1为由丙烯酸系树脂、聚乳酸、聚乙醇酸、苯乙烯系树脂、 丙烯酸酯-苯乙烯共聚物系树脂、聚碳酸酯系树脂、聚酯系树脂、聚乙烯醇系树脂、乙烯-乙 烯醇共聚物系树脂、热塑性弹性体氯乙烯系树脂、硅酮树脂和硅树脂中的一种或组合制成 的树脂成型品。这是由于，使用能够成型的树脂以便以低成本且大量地制造装置。
[0181] 此外，在球状体制造装置1是上述树脂成型品的情况下，优选地通过表面改质处理 而至少在壁面13上形成官能团，该表面改质处理为等离子处理、电晕放电和UV臭氧处理中 的一种或组合。可以在整个球状体制造装置1上形成官能团。这是由于，在该装置疏水性过 高或开口部过小的情况下，使该装置具有亲水性能够使培养基顺利地流入开口部。
[0182] 此外，在球状体制造装置1为上述树脂成型品的情况下，优选地，至少壁面13被由 无机物、金属、合成聚合物、二聚物、三聚物、四聚物和生物基聚合物(biobased polymer)中 的一种或组合制成的物质涂覆。可选地，可以利用这些物质涂覆整个球状体制造装置1。这 是由于与上述的原因相同的原因。另外，极其有效的是，利用以上材料涂覆表面并由此形成 疏水性的表面。这是由于，假设两个装置具有相同的等效直径的孔，在使用具有低表面张力 的培养基的情况下，该装置的疏水性表面比该装置的亲水性表面更有效。
[0183] 此外，优选地，球状体制造装置1为由诸如金属和玻璃等的无机物中的一种或组合 制成的成型品。在球状体制造装置1为上述成型品的情况下，优选地，通过表面改质处理对 至少壁面13进行改质，该表面改质处理包括等离子处理、电晕放电和UV臭氧处理中的一种 或组合。可以对球状体制造装置1的整个表面进行改质。这是由于与上述原因相同的原因。 另外，通过利用上述材料涂覆表面极其有效地制成了疏水性更好的表面。这是由于，假设两 个装置具有相同的等效直径的孔，在使用具有低表面张力的培养基的情况下，装置的疏水 性表面比装置的亲水性表面更有效。
[0184] 可选地，在球状体制造装置1为上述树脂成型品的情况下，至少壁面13被由无机 物、金属、聚合物、二聚物、三聚物和四聚物中的一种或组合制成的物质涂覆。可以利用这些 物质涂覆整个球状体制造装置1。这是由于与上述的原因相同的原因。另外，极其有效的是， 通过利用上述材料涂覆表面制成了疏水性更好的表面。这是由于，假设两个装置具有相同 的等效直径的孔，在使用具有低表面张力的培养基的情况下，该装置的疏水性表面比该装 置的亲水性表面更有效。
[0185] 除了上述加工，至少壁面13的表面或整个球状体制造装置1优选地包括纳米级别 的微小结构。该微小结构例如为表面被加工成具有凹凸表面的结构。材料表面的性质不受 到装置的材料指定，而是由材料表面的性质所指定的。由于材料的表面的亲水性和疏水性 能够在后处理中进行控制，因此可以使用任意的材料作为该装置的材料。
[0186] 〈球状体的回收方法〉
[0187] 以下将说明使用上述球状体制造装置1制造球状体的方法的概述和所制造的球状 体的回收方法。
[0188] 图13是用于说明使用图4中示出的细胞培养容器9制造球状体的步骤的图。将包含 细胞的培养基8从第一表面11所在侧注入球状体制造装置1的各孔中。如果如上所述地适当 地设计了球状体制造装置1，则培养基8从球状体制造装置1的底(第二表面的开口部)突出， 由此形成了培养基的液滴。在培养基8中包含的细胞凝集于液滴部分并形成了球状体7。在 细胞培养过程中，例如，取出培养基8的上清液，通过补充新的培养基而利用该新的培养基 替换培养基8。
[0189] 图14为使用图4中示出的细胞培养容器9制造球状体的步骤的另一示例的图。图14 为示出了液滴未到达第二表面12的开口部而停在到达开口部的途中的状态的图。该现象发 生在当培养基被添加到如上所述地被适当设计的球状体制造装置1中的比设计时的高度H 低的高度的情况下。即使在这种情况下，在培养基8中包含的细胞凝集在液滴部分以形成球 状体7。在细胞培养过程中，例如，取出培养基8的上清液，通过补充新的培养基而利用该新 的培养基替换培养基8。为了回收球状体，从第一表面11所在侧添加培养基，以增大H或增大 第一表面所在侧的压力，使得实现图14中所示的状态，然后能够通过图15或图16中示出的 方法回收球状体。
[0190]通过例如图15和图16中示出的方法回收制成的球状体7。能够通过下述方法回收 球状体7而不会损伤该球状体7。
[0191] 图15示出了通过将回收溶液置于皮氏培养皿92中并且使回收溶液与第二表面接 触来回收球状体7的方法。回收溶液可以选自例如培养基8、水和缓冲溶液中的任意一种。通 过该方法取出通过使用球状体制造装置1培养细胞所制造的球状体7。该方法的优选的示例 性实施方式为通过使液滴移动到回收溶液所在侧来收集球状体。特别优选地，当移动液滴 时使在第二表面12所在侧形成的液滴进入回收溶液。
[0192] 图16示出了通过在细胞培养容器9被盖93封闭时从第一表面11所在侧施加压力来 回收球状体7的方法。当从第一表面11所在侧施加压力时，破坏了液滴。结果，培养基8流出 皮氏培养皿92，由此使得能够回收球状体7。优选地，当取出使用球状体制造装置1培养的球 状体时采用上述方式破坏液滴。可以使用任意方法以从第一表面11所在侧施加压力以便破 坏液滴。例如，可以添加培养基8直至液滴被破坏。可选地，第一表面11所在侧被密封且供给 气体以便施加压力。
[0193] 如上所述，利用根据本示例性实施方式的球状体制造装置1，可以在多个孔中产生 液滴并且制造球状体。因而，可以有效率地制造大量的球状体。当多个孔的大小形成为相同 时，能够制造均一的球状体。另外，能够从第一表面11所在侧(上侧)将培养基注入球状体制 造装置1。此外，能够从第一表面11所在侧更换培养基。因此，球状体制造装置1的操作容易。 此外，能够通过基于物理现象设计球状体制造装置1使得球状体制造装置1的结构简单。因 而，与专利文献2中公开的悬浊板相比能够容易地制造球状体制造装置1本身。因此，可以大 幅地降低用于制造球状体的成本和作业时间。
[0194] 第二示例性实施方式
[0195] 在第一示例性实施方式中，尽管已经说明了具有图1和图2中示出的孔的形状的球 状体制造装置1，但是孔的形状不限于此。例如，可以采用分别具有图17至图22中示出的截 面的球状体制造装置la至If来代替图2中示出的截面。采用与图2中示出的装置同样的方 式，球状体制造装置la至lc是壁面13形成为从与第二表面12的边界起具有角度为0i的斜面 的示例。另一方面，图20中示出的球状体制造装置Id是有角度的斜面从壁面13的途中开始 的示例。
[0196] 如图2和图17至图22的示例所示地，上表面的形状可以是球的一部分（图2和图20 至图22)或者是平坦的（图19)。可选地，上表面的形状可以是圆锥或具有顶点的多角锥（图 17和图18)。在球状体制造装置的一示例性实施方式中，更优选地，上表面的形状是球形或 圆锥或具有顶点的多角锥，以便防止细胞停留于或静置于上表面。另外，上表面的形状可以 是从第一表面11的开口部向孔的入口垂直的且仅在第二表面12的开口部的附近具有倾斜 部，这在图中未示出。
[0197] 以下将说明图20至图22中示出的球状体制造装置Id。等效直径D和角度0i分别是 在装置的第二表面12的开口部处该装置与培养基接触的位置的等效直径和角度。该装置的 形状可以是图20、图21和图22中示出的形状。图20是示出了壁面13从水平高度（level )2至 水平高度3具有角度的情况的图。在图20中，在水平高度3处的开口部的内接圆的等效直径 与在水平高度4处的内接圆的等效直径相同。在这种情况下，在水平高度4处的位置为内接 圆的等效直径Din和角度0i的基准。图21是示出了壁面13从水平高度3至水平高度4具有角 度的示例的图。在图21中，在水平高度3处的开口部的内接圆的等效直径大于在水平高度4 处的内接圆的等效直径D。在这种情况下，在水平高度4处的位置为内接圆的等效直径Din和 角度的基准。此时，壁面13从水平高度3至水平高度4的斜度、即角度0i优选地小于壁面13 从水平高度2至水平高度3的斜度。
[0198] 可选地，如图22所示，壁面13从水平高度2至水平高度3可以具有角度。在这种情况 下，在水平高度4处的开口部的内接圆的等效直径大于在水平高度3处的开口部的内接圆的 等效直径。此时，壁面13与培养基接触的最低水平高度为水平高度3。因此，从水平高度2至 水平高度3的斜度具有角度0i，在水平高度3处的位置为内接圆的等效直径Din。在图20至图 22中，角度0i为第二表面(下表面)或第二表面所在侧的开口部的、与液面接触的部分的角 度。
[0199] 在第一示例性实施方式中，已经说明了图1和图2中示出的第一表面11和第二表面 12中形成的开口部为圆形的情况。然而，开口部的形状不限于此。例如，可以采用分别具有 图23至图26中示出的形状的开口部的球状体制造装置lg至lj。如已经参照图1和图2说明 地，球状体制造装置1优选地包括第一表面11(上表面）、第一表面11的开口部和第二表面12 (下表面）的开口部作为与培养基接触的部分。此外，第一表面11的开口部的内接圆的等效 直径优选地大于第二表面12的开口部的内接圆的等效直径Din。因而，如球状体制造装置lg 至lj所表示地，孔的形状可以是圆形或诸如矩形或八边形等的多边形。此外，第一表面11的 开口部的形状可以与第二表面12的开口部的形状不同。在图23至图26中，由实线表示第一 表面11的开口部(或在上表面的宽度W的位置处的开口部的形状）。通过虚线表示第二表面 的开口部。当从第一表面11所在侧观察球状体制造装置lg至lj时这些开口部被示出四个 孔。
[0200]另外，在球状体制造装置的一示例性实施方式中，例如，可以通过对薄板状的膜进 行冲孔制成孔或者制成供树脂流入的模具，然后可以将树脂成型为装置。在这方面，使得上 表面的开口部的内接圆的等效直径大于下表面的开口部的内接圆的等效直径Din。此外，可 以包括用于增强膜或树脂的支撑件，以便支撑培养基的重量。在膜或树脂的厚度增大的情 况下，可以使装置中空以便减小装置的重量。
[0201]实施例
[0202]实施制造球状体的试验。首先，设计和制造具有图27和图28示出的形状的球状体 制造装置lx。接着，将球状体制造装置lx安装于图29和图30中示出的加样孔容器91x。将包 括球状体制造装置lx的图29和图30中示出的加样孔容器91x安装于6加样孔板(未示出）。此 时，确认液滴81和第二表面12未与加样孔板的底接触。
[0203]图27为示出了从第一表面观察的装置的图。图28为沿着图27的线XXVIII-XXVIII 截取的截面图。图29为从第一表面观察的装置的图。图30为沿着图29的线XXX-XXX截取的截 面图。
[0204] 制造具有如下大小的球状体制造装置lx，其中
[0205] 一个节距 PI为1.00mm
[0206] 第二表面12x的等效直径D :0.25mm [0207]角度 0i:67.5度
[0208] 厚度 T :0.74mm
[0209] 上表面的宽度W:0.184mm
[0210]以下示出了加样孔容器91x的大小。
[0211]加样孔容器的内周的直径L1:31臟
[0212] 加样孔容器的高度L3:1.5cm
[0213] 1.培养容器
[0214][实施例1]
[0215] 使用接触角0c在-l〈C〇S0c〈O的范围的材料。使用硅酮(制造者:KCC，等级：SL7260) 作为用于球状体制造装置的材质。作为培养基，使用添加有DMEM/F12的10%FBS。此后，培养 基将被称作培养基A。
[0216] 〈球状体制造装置的设计>
[0217] 使用上述式3(以下再次提及）。
[0218] (2/3)aR2+pR=2yL …式 3
[0219] 在本实施例中，在使用纯水的条件下进行设计。
[0220]-纯水的密度和比重：1.00(文献值）
[0221 ]-液体的表面张力 y l: 7 X 10-2[g/cm]
[0222]能够通过诸如吊片法等的各种方法来测量培养基A的液体的表面张力yL。可选 地，能够从分销商(distributor)得到信息。使用液滴法测量的纯水相对于装置的材料的接 触角0c为91度(cos91度= -0.017)。注意，在本实施例中使用的培养基和纯水显示了与上述 值接近的接触角9 c的值。
[0223]-以使得培养基的高度H在lcm以内的方式设计培养基的高度H。
[0224]当使用培养基A时，将上述值代入式3中以便计算外接圆的等效半径Rout。
[0225] (2/3) X 1 ? 00 XR2+l X 1 ? 00 XR= 2 X 7 X 10-2
[0226] R = 〇.123,-1.629
[0227] 由于外接圆的等效半径Rout为正值，因此限定了如下的值。
[0228] R = 0.123cm =1230ym
[0229]外接圆的等效直径Dout为285wii，其为所算出的值的23%。此时，考虑由于蛋白质 的吸收导致的疏水性的降低、来自球状体的重力的力、和由于培养基的更换或搬运时的振 动导致液滴不能被保持的可能性。角度为67.5度。此外，采用开口部的尺寸为1mm的方式 设计开口部。如图14所示，采用通过使液滴停止在装置的侧面的途中而使装置确保保持液 滴的方式进行设计。以使得图30中的91x的直径为31mm的方式进行设计。
[0230] [比较例1]
[0231] 使用通过在直径为5cm的玻璃的皮氏培养皿的底上贴附由信越化学社制造的硅酮 树脂(KE-1603(A/B)得到的低粘着性容器。
[0232] 2 ?培养方法
[0233] (1)在图30中示出的加样孔中添加已经调整为在10mL培养基中包含250万个小鼠 ES细胞的细胞悬液。将这些细胞培养两天。在实施例和比较例两者中使用这种细胞悬液。注 意，当使用这种细胞悬液时，能够被注入一个开口部的细胞的数量为每个开口部1250个。在 其它实施方式中，使用已经采用注入一个开口部的细胞的数量分别为1500个、1000个和500 个的方式调整的细胞悬液。在这些实施例中，采用与上述实施例同样的方式将这些细胞培 养两天。
[0234] (2)在实施例中，使第二表面12与培养基接触，回收球状体，然后进行观察。在比较 例中，将细胞悬液转移到另一容器，在培养的容器中观察球状体。
[0235] (3)通过倒立显微镜来观察球状体，使用得到的图像来测量球状体的直径。
[0236] 3.结果
[0237]图31和图32是在实施例1中回收球状体之前的装置和细胞的显微镜照片。图32是 图31的放大图。在实施例1中，在各开口部内形成球状体。
[0238]图33为根据实施例1和比较例1的回收的球状体的显微镜照片。
[0239]图34为在实施例1中回收球状体之后的装置的表面的照片。回收了图31中示出的 几乎所有的剩余的球状体。然而，仍然有一些球状体残留在端缘处。回收率为95%以上。通 过式(细胞无残留的开口部的数量/开口部的总数）X 100来计算回收率。
[0240]图35为比较例1中的球状体的照片。
[0241]图36为示出了根据实施例1和比较例1的颗粒直径分布的图表。为了建立图36的图 表，使用图33(左侧的实施例1的图片和右侧的比较例1的图片）的x75透镜成像球状体，并且 拍摄球状体的图像。下表1中示出的数据段的数量选自所拍摄的图像，并且测量各个球状体 的直径。
[0242] 在表1中示出了细胞块的直径的平均值（ym)、样本标准偏差（SD)和变异 (var iati on，通过使SD除以直径的平均值进行定义）。如从SD/平均直径的值所看到的，实施 例1中的变异为比较例1中的变异的1 /3以下。
[0243] [表1]
[0245] 图37示出了实施例1的细胞数变化的情况下的颗粒直径分布。
[0246] 进行如下调查：即使在细胞数变化的情况下是否能够形成具有均一直径的细胞 块。表2示出了调查的结果。在这回设计的等效直径D的情况下，在每个开口部为1500个和 1000个细胞的情况下，变异比比较例低10%的程度。在每个开口部为500个细胞的情况下， 变异与比较例的变异同等。
[0247] [表 2]
[0249] ~注意，本发明不限于上述示例性实施方式，可以在不背离本发明的范围的情况下 适当地进行变更。
[0250] 本申请基于且要求2014年2月25日提交的日本专利申请特愿2014-034577的优先 权的权益，其全部内容通过引用合并于此。
[0251] 附图标记说明
[0252] 1、la至lh、lx球状体制造装置
[0253] 7球状体
[0254] 8培养基
[0255] 9细胞培养容器
[0256] ll、llx 第一表面
[0257] 12、12x 第二表面
[0258] 13、13x 壁面
[0259] 9细胞培养容器
[0260] 91、91x加样孔容器
[0261] 92皮氏培养皿
[0262] 93 盖
【主权项】
1. 一种球状体制造装置，其包括： 第一表面； 第二表面，所述第二表面为所述第一表面的背面；以及 多个壁面，所述多个壁面被构造成形成贯通所述第一表面和所述第二表面的多个孔， 其中所述第一表面的开口部的内接圆的等效直径大于所述第二表面的开口部的内接圆的 等效直径。2. 根据权利要求1所述的球状体制造装置，其特征在于，所述第二表面的开口部的内接 圆的等效直径在200微米至1厘米的范围。3. 根据权利要求1或2所述的球状体制造装置，其特征在于，各所述壁面的至少一部分 以相对于所述第二表面成大于1度且小于90度的角度倾斜。4. 根据权利要求1至3中任一项所述的球状体制造装置，其特征在于， 从所述第一表面将培养基注入各所述孔， 当形成各所述壁面的材料的表面与所述培养基之间的接触角0c在-l〈cos0c<〇的范围 时，作为所述第二表面的开口部的外接圆的等效直径的一半的外接圆的等效半径Rout小于 或等于由计算式(2/3)aX2+ pX = 2yL限定的变量X的值， 其中，Ρ为所述第二表面的开口部的水压，α为所述培养基的比重，丫^为液体的表面张 力，Rout的单位为cm，p的单位为g/cm2, γ l的单位为g/cm〇5. 根据权利要求1至3中任一项所述的球状体制造装置，其特征在于， 从所述第一表面将培养基注入各所述孔， 当形成各所述壁面的材料的表面与所述培养基之间的接触角Θ c在0〈 co s Θ c〈 1的范围 时，内接圆的等效直径被设计成使得满足下式： y lcosQc- y s>0 和 Ρ= γ LX (2/r) 其中，P为所述第二表面的开口部的水压，YL为液体的表面张力，r为曲率半径，液 体的表面张力，Ρ的单位为g/cm2，γ l的单位为g/cm，r的单位为cm。6. 根据权利要求3所述的球状体制造装置，其特征在于，形成一个所述孔的壁面与形成 另一相邻的所述孔的壁面之间的宽度为5毫米以下，其中该宽度为相对于所述第二表面以 所述角度倾斜的该两个壁面之间的靠近所述第一表面的端部的宽度。7. 根据权利要求1至6中任一项所述的球状体制造装置，其特征在于，所述球状体制造 装置为由丙烯酸系树脂、聚乳酸、聚乙醇酸、苯乙烯系树脂、丙烯酸酯-苯乙烯共聚物系树 月旨、聚碳酸酯系树脂、聚酯系树脂、聚乙烯醇系树脂、乙烯-乙烯醇共聚物系树脂、热塑性弹 性体氯乙烯系树脂、硅酮树脂和硅树脂中的一种或组合制成的树脂成型品。8. 根据权利要求7所述的球状体制造装置，其特征在于，通过表面改质处理而在所述多 个壁面上形成官能团，该表面改质处理包括等离子处理、电晕放电和UV臭氧处理中的一种 或组合。9. 根据权利要求7所述的球状体制造装置，其特征在于，所述多个壁面被由无机物、金 属、合成聚合物、二聚物、三聚物、四聚物和生物基聚合物中的一种或组合制成的物质涂覆。10. 根据权利要求8或9所述的球状体制造装置，其特征在于，所述多个壁面的表面包括 纳米级的微小结构。11. 根据权利要求1至6中任一项所述的球状体制造装置，其特征在于，所述球状体制造 装置为由如金属和玻璃等的无机物中的一种或组合制成的成型品。12. 根据权利要求11所述的球状体制造装置，其特征在于，通过表面改质处理对所述多 个壁面进行了改质，该表面改质处理包括等离子处理、电晕放电和UV臭氧处理中的一种或 组合。13. 根据权利要求11或12所述的球状体制造装置，其特征在于，所述多个壁面被由无机 物、金属、聚合物、二聚物、三聚物和四聚物中的一种或组合制成的物质涂覆。14. 根据权利要求11至13中任一项所述的球状体制造装置，其特征在于，所述多个壁面 的表面包括纳米级微小结构。15. -种球状体的回收方法，所述回收方法包括使根据权利要求1至14中任一项所述的 球状体制造装置的所述第二表面与选自水、培养基和缓冲溶液的溶液接触以回收球状体。16. -种球状体的回收方法，所述回收方法包括对根据权利要求1至14中任一项所述的 球状体制造装置的所述第一表面施加压力以使球状体从所述第二表面的开口部流出。17. -种使用权利要求1至14中任一项所述的球状体制造装置的球状体的制造方法，所 述方法包括： 从所述第一表面将包含细胞的培养基注入各所述孔； 在各所述孔中形成液滴；以及 在所述液滴中培养所述细胞以制造球状体。18. 根据权利要求17所述的方法，其特征在于，所述方法还包括使所述第二表面与选自 水、培养基和缓冲溶液的溶液接触以回收球状体。19. 根据权利要求17所述的方法，其特征在于，所述方法还包括对所述第一表面施加压 力以破坏所述液滴并且使球状体从所述第二表面的开口部流出。
【文档编号】C12M1/00GK106029862SQ201580010448
【公开日】2016年10月12日
【申请日】2015年2月25日
【发明人】角昭郎, 角昭一郎
【申请人】株式会社可乐丽, 国立大学法人京都大学