小菜蛾蛋白酶体亚基α6基因在溴氰菊酯抗性治理中的应用
【专利摘要】本发明属于害虫抗药性机理与防治领域，具体涉及小菜蛾蛋白酶体亚基α6基因在溴氰菊酯抗性治理中的应用。本发明用prosalpha6基因RNAi后幼虫的抗药性水平明显下降，用同样剂量的溴氰菊酯处理后，干扰组幼虫的存活率下降了2.5倍，与对照组之间有显著差异。本发明通过个体和细胞水平分别证明该基因与溴氰菊酯的抗性密切相关，对进一步阐明溴氰菊酯的抗性机理以及在抗性的防治应用中均具有重要的意义。
【专利说明】
小菜蛾蛋白酶体亚基α6基因在溴氰菊酯抗性治理中的应用
技术领域
[0001]本发明属于害虫抗药性机理与防治领域，具体涉及小菜蛾泛蛋白酶体α6亚基基因 pro sa 1 pha6及一种治理小菜蛾的溴氰菊酯抗性的方法。
【背景技术】
[0002] 连续、大量、单一使用一种或一类药剂是导致昆虫产生抗药性的主要原因。在连年 大量使用某一药剂以后，对该药耐药力弱的昆虫经自然选择后被淘汰，而耐药性强的个体 得以存活下来并得到迅速繁殖，从而相关的抗药性基因也通过遗传保留了下来，并且随着 化学药剂用量的增加，这些抗药性基因又经过杀虫剂作用和选择，如此逐代的选择作用，抗 药性积累加强，昆虫的抗药能力也逐渐增强，这就产生抗药性品系的昆虫。但是有关这些基 因与抗药性关系的分析主要是在基因表达水平的差异比较，没有进行相关基因的敲减和增 强表达之后对杀虫剂抗性水平影响的细胞和活体研究，缺乏直接的实验证据，因此难以进 行开发和应用。
[0003] 小菜蛾prosalpha6基因是20S蛋白酶体的一个结构亚基，尚未有该基因与溴氰菊 酯抗性相关的报道。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的是提供小菜蛾对溴氰菊酯的抗性相关基因及其应用。
[0005] 本发明首先以果绳Kc细胞作为模式系统，分析prosalpha6基因与溴氰菊酯抗性的 关系。根据GenBank中已有的果绳prosalpha6基因序列，设计引物克隆出果绳prosalpha6基 因的开放阅读框序列，经过实验证明果蝇prosalpha6基因是溴氰菊酯抗性相关基因。
[0000]发明人进一步实验发现小菜蛾的Prosalpha6蛋白基因在溴氰菊酯抗性品系中的 表达水平明显高于敏感品系。
[0007]本发明公开了小菜蛾prosalpha6基因在治理小菜蛾的溴氰菊酯抗性中的应用。 [0008] 小菜蛾蛋白酶体α6亚基基因 prosalpha6的dsRNA在制备小菜蛾对溴氰菊酯增敏剂 中的应用。
[0009] 一种利用蛋白酶体α6亚基基因 prosalpha6治理小菜蛾溴氰菊酯抗性的方法，其步 骤是：
[0010] (1)用prosalpha6的SEQ ID N0.1 和SEQ ID N0.2引物，按照MEGAscriptRNAi Kit 说明书进行操作，合成小菜蛾蛋白酶体α6亚基基因 prosalpha6的dsRNA;
[0011] (2)核酸酶消化以去除DNA和ssRNA;
[0012] (3)纯化 dsRNA;
[0013] (4)将prosalpha6的dsRNA喷洒到田间小菜蛾的卵、幼虫和饲料上，通过渗透和取 食，dsRNA进入小菜蛾细胞，沉默prosalpha6基因；
[0014] (5)48小时后施溴氰菊酯类杀虫剂。
[0015] 经研究表明：prosalpha6基因 RNAi后幼虫的抗药性水平明显下降，用同样剂量的 溴氰菊酯处理后，干扰组幼虫的存活率下降了 2.5倍，与对照组之间有显著差异。
[0016]我们通过个体和细胞水平分别证明该基因与溴氰菊酯的抗性密切相关，因此本发 明对进一步阐明溴氰菊酯的抗性机理以及在抗性的防治应用中均具有重要的意义。
【附图说明】
[0017] 图1果绳Kc细胞中prosalpha6的mRNA表达水平（*代表ρ〈0·05)。
[0018]图2 prosalpha6的RNAi对不同浓度溴氰菊酯胁迫下细胞存活率的影响。*代表ρ〈 0.05〇
[0019] 图3小菜蛾成活率检测。*代表ρ〈0 · 05。
【具体实施方式】
[0020] 实施例一
[0021] 1、实验材料
[0022] 小菜蛾源自贵州省贵阳市花溪区中曹乡的甘蓝地，室内繁殖一代后测四龄幼虫的 LD5q值，与武汉市蔬菜研究所的小菜蛾敏感品系四龄幼虫LD5Q值比较，发现小菜蛾田间种群 为敏感种群。将其作为敏感品系同步隔离培养。小菜蛾溴氰菊酯抗性品系由点滴法处理小 菜蛾四龄幼虫敏感品系经多代繁育选育而成。
[0023] 2、prosalpha6 的功能研究
[0024 ] (1)不同浓度溴氰菊酯对pr 〇 sa 1 pha6的诱导作用
[0025] 用不同浓度的溴氰菊酯处理果蝇Kc细胞，采用荧光定量PCR技术，检测不同浓度处 理细胞中prosalpha6基因的表达水平。结果显示，prosalpha6的表达量随着药物浓度的升 高而不断被上调，呈现出一定的线性关系（图1);
[0026] (2)prosalpha6基因 RNAi对细胞存活率的影响
[0027] RNA干扰48h后，用不同浓度的溴氰菊酯处理干扰组(dsRNA)和对照组(control)细 胞24h，台盼蓝试剂检测细胞存活率，结果表明：在一系列浓度的溴氰菊酯胁迫下，干扰组细 胞的存活率明显低于对照组细胞的存活率(图2)。
[0028] (3)小菜蛾prosalpha6基因 RNAi对溴氰菊酯抗性水平的影响
[0029] ①小菜蛾prosalpha6基因 RNAi的合成
[0030]根据prosalpha6基因的保守序列利用pp5软件设计下列引物，合成出小菜蛾 prosalpha6 基因的dsRNA。
[0031] 上游引物：
[0032] S^TAATACGACTCACTATAGGGATGTTTCGCAACCAGTACGA-S7 (SEQ ID N0.1)
[0033] 下游引物：
[0034] S^TAATACGACTCACTATAGGGCTATGGACGCTGCTCGGT-S7 (SEQ ID NO.2)
[0035] ②构建表达载体
[0036] 核酸酶消化以去除DNA和ssRNA。
[0037] ①冰上加样消化液如下
[0039] ②置于37Γ孵育lh;
[0040] 纯化 dsRNA。
[0041 ]①组装反应液
[0043] ②轻轻吹打混匀组装反应液，室温13000rpm条件下离心2min，弃滤液；
[0044] ③吸取500yL Wash Solution加入到制备管中，室温下13000rpm离心2min，弃滤 液；
[0045] ④重复步骤③一次；
[0046] ⑤再空管离心30sec以尽可能的去除多余的液体；
[0047]⑥将制备管放入一个新的收集管中，向其中加入50yL预先加热至大于95°C的 Elution Solution，最大转速离心2min，收集滤液；
[0048]⑦重复步骤⑥一次；
[0049]⑧分光光度计测定产物的A26Q以检测dsRNA的浓度将扩增的prosalpha6基因的 dsRNA插入pET_2P (购自promega公司）构建双链RNA表达载体pET-2P_pros。
[0050] ③双链RNA在大肠杆菌中的表达
[0051 ] 取5yL pET-2P-pros质粒加入到50yL解冻后的HT115感受态细胞中，加入IPTG使终 浓度为〇. ImM，37°C条件下连续培养5h，对照组不加 IPTG诱导，相同条件下培养5h。
[0052]④小菜蛾抗溴氰菊酯品系幼虫喂食dsRNA
[0053]将菌液和超纯水以1:10的比例混合至菌体沉淀完全溶解，将大小相同的新鲜甘蓝 叶片置于菌液中浸泡l〇s，晾干后放于直径9cm，高1.5cm的玻璃培养皿中，每个培养皿放置 15头幼虫。未经IPTG诱导组和只用超纯水处理组作为对照组，同样每个培养皿15头幼虫。各 设3个重复，每个重复60头幼虫，连续喂食dsRNA浸渍的新鲜叶片3天。
[0054]④毒力测定
[0055] 将溴氰菊酯以丙酮作为溶剂配成浓度2500ppm，分别对prosalpha6基因干扰组、未 经IPTG诱导组和只用超纯水处理组的小菜蛾幼虫进行毒力测定。适宜条件下培养48小时， 统计不同处理组的幼虫死亡数。用镊子触动虫体，不活动者计为死亡，统计死亡率。结果表 明，干扰了 prosalpha6基因的小菜蛾的成活率均明显低于对照组，并且有统计学差异。水处 理对照组设为1(图3)。
【主权项】
1. 蛋白酶体α6亚基基因 prosalpha6在治理溴氰菊酯抗性中的应用。2. -种利用蛋白酶体α6亚基基因 prosalpha6治理小菜蛾溴氰菊酯抗性的方法，其步骤 是： (1) 用prosalpha6的SEQ ID N0.1 和SEQ ID N0.2引物，按照MEGAscriptRNAi Kit说明 书进行操作，合成小菜蛾蛋白酶体妨亚基基因 prosalpha6的dsRNA; (2) 核酸酶消化以去除DNA和ssRNA; (3) 纯化 dsRNA; (4) 将prosalpha6的dsRNA喷洒到田间小菜蛾的卵、幼虫和饲料上，通过渗透和取食， dsRNA进入小菜蛾细胞，沉默prosalpha6基因； (5) 48小时后施溴氰菊酯类杀虫剂。3. 小菜蛾蛋白酶体α6亚基基因 prosalpha6的dsRNA在制备小菜蛾对溴氰菊酯增敏剂中 的应用。
【文档编号】C12N15/90GK105969808SQ201610304811
【公开日】2016年9月28日
【申请日】2016年5月10日
【发明人】程罗根, 胡俊丽, 程晨, 焦东旭, 李风良
【申请人】南京师范大学