专利名称：一种小菜蛾葛佬素基因及编码的蛋白、相应的表达系统和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及一种小菜蛾葛佬素基因及编码的蛋白、 相应的表达系统和应用。
背景技术：
抗生素的发现与应用对保护人类和动物的健康作出了巨大的贡献。但是近年来， 随着抗生素的大量应用，导致了耐药菌株的产生，如金黄色葡萄球菌$taphylOCOCCUS aureus Rosenbach)禾口参录月农木干菌(fseudomonas aeruginosa Migula) /L乎对所有抗生素者β 有抗性，已成为临床上一个严重的问题。当前，细菌性感染和细菌性疾病呈上升趋势，细菌 耐药性的形成是一个重要的原因，如何克服细菌的耐药性是当前的研究重点和热点。具有 广谱抗菌且有独特的抗菌机制的抗微生物肽(antimicrobial pep tides, AMPs)显然在 克服细菌耐药性方面具明显优势。自从Janeway和Medzhitov在1998年提出病原体相关 分子模式(pathogen—associated molecular patterns, PAMPs)禾口模式i只另Ij受体(pattern recognition receptors, PRRsl这两个概念以来，对于抗微生物菌肽作用机制及其基因表 达调控机制的认识已经不断深化。抗微生物肽(antimicrobial peptides, AMPs)就是与宿主免疫防御相关的一 个重要的进化保守型生物大分子，在保护宿主防止外源微生物的侵染过程中起着关键的作 用。生物机体在刚刚遭受感染时，就会受到来自内源性和外源性等多种炎症介质的刺激而 使得抗菌肽的表达量大大增加。迄今为止，已有70多种抗菌多肽的结构被测定，抗菌肽的 概念得到了极大的扩展。根据抗菌肽的结构，可将其分为5类①单链无半胱氨酸残基的 螺旋或由无规卷曲连接的两段螺旋组成的肽；②富含某些氨基酸残基但不含半胱氨酸残基 的抗菌肽；③含1个二硫键的抗菌多肽；④有2个或2个以上二硫键、具有β折叠结构的抗 菌肽；⑤由其他已知功能的较大的多肽衍生而来的具有抗菌活性的肽。抗微生物肽对侵染 宿主的病原微生物具有高效、广谱的抑制作用，而对宿主无任何毒副作用，因此抗微生物 肽作为新型安全的肽类抗生素和生物防治制剂有望应用于医疗和农业中。但抗菌肽在生物 组织中含量少，分离获得大量天然产物困难很大，人工合成则成本高。基因工程是一个较 为理想的选择，但是由于抗菌肽分子小，容易被蛋白酶降解，同时由于其表达产物对原核 宿主菌有害，因此不能在原核系统中直接表达，一般采用融合表达或在真核系统中表达。Gloverins是一类新发现的昆虫抗细菌肽，最初是由Axen等在惜古比天蚕 iHyalophorcecropia. cecropia )蛹中发现，由130个氨基酸组成，富含碱性甘氨酸 (Gly)，对革兰氏阴性菌有极强的杀灭作用，在浓度为1 3ymol/L时就能抑制大肠杆 菌的生长。其后在鳞翅目的其他几种昆虫如棉铃虫(Wico^rpa armigera)、粉纹夜 蛾、Trichoplusia ni)、烟草天蛾(Manduca sexta)、象香(Bombyx mori)和大蜡螟 {Galleria mellonella)中也发现了相似性很高的Gloverins抗细菌肽因子。另外，由于 天蚕Gloverin对革兰氏阴性菌有极强的杀灭作用，国内学者仅对天蚕和家蚕的Gloverin做了原核表达，但至今还没有关于重大害虫小菜蛾Gloverin的文献报道。
发明内容
本发明的目的在于根据现有技术的不足，提供一种小菜蛾葛佬素基因。本发明另一目的在于提供上述小菜蛾葛佬素基因编码的蛋白。本发明另一目的在于提供上述小菜蛾葛佬素基因的克隆方法。本发明另一目的在于提供上述小菜蛾葛佬素的制备方法。本发明还有一个目的在于提供上述小菜蛾葛佬素的应用。本发明上述目的通过以下技术方案予以实现
一种对革兰氏阴性菌有抑制作用的小菜蛾葛佬素(gloverin)基因，具有如下信息
(a)序列特征 * 长度650 bp *类型核酸
*链型双链 *拓扑结构线性；
(b)分子类型DNA;
(c)假设否;
(d)反义否;
(e)最初来源小菜蛾幼虫(Plutellaxylost el la L.)；
(f)序列描述:SEQID NO: I0上述小菜蛾葛佬素基因编码的蛋白，具有如下信息
(a)序列特征
*长度175氨基酸 *类型氨基酸 *链型单链 *拓扑结构线性
(b)分子类型肽
(c)序列描述=SEQID NO:2。上述小菜蛾葛佬素基因的克隆方法如下 小菜蛾由本实验室饲养，供试菌种为大肠杆菌。(1)用OD值为0. 8^1. 0的大肠杆菌刺激小菜蛾4龄幼虫，进行抗菌肽的诱导；
(2)总RNA的提取取经M小时诱导后的小菜蛾0.5-1克，液氮中研磨，用异硫氰酸胍 法提取总RNA ；
(3)cDNA第一链的合成按照CL0NTECH公司RACE试剂盒说明书进行，10微克总RNA， 加反应液20微升42°C反应90min。72°C 10 min终止反应。反应液组成50毫摩尔氯化 钾，3毫摩尔氯化镁，10毫摩尔Tris-HCL PH8. 3，1毫摩尔DTT，5微摩尔d NTP, 25单位RNA 酶抑制剂，8单位AMV逆转录酶；
(4)聚合酶链式反应试剂和条件。首先在PCR管中加入下列试剂
410 X TaqDNA 聚合酶 buffer5ul模板cDNAIul特异引物(1.25ug/ul)Iul通用引物(1.25ug/ul)Iul脱氧核苷酸混合物(d NTP4ulTaq DNA聚合酶0.25ul(MH2O37. 75ul总体积50ul上述克隆方法中所述的引物序列如SEQ ID N0:3、所示。上述聚合酶链式反应的具体步骤如下
将上述混合液94°C变性anin，然后进入下列循环94°C 30s, 65°C 30s, 72°C 30s，共 进行35个循环，最后94°C延伸10 min,结果扩增到两条400bp特异性带；
(5)扩增产物纯化利用OMEGA纯化试剂盒纯化PCR扩增片段；
(6)抗菌肽基因的克隆取3ul纯化产物克隆到ρMD18-T载体(TAKARA公司产品)，转 化DH5 α细胞，在含有氨苄青霉素(100微克/毫升)和5_嗅_4_氯_3_吲哚-β -D-半乳 糖苷(X-gal 0. 2微克/毫升)的LB平板上过夜培养；
(7)质粒的纯化挑取白斑，接种于LB液体培养基，37°C摇床过夜培养后收取菌液，按 OMEGA试剂盒提取质粒；
(8)序列测定与同源检索经测试结果分析，推导得到具有175个氨基酸序列，将此序 列与已发表的抗菌肽的序列比较，结果与鳞翅目昆虫粉纹夜蛾WricM^mia ni)的抗菌 肽glovrin的氨基酸序列具有相似性，因此可以确定该基因为一种新的抗菌肽基因。本发明上述小菜蛾葛佬素的制备方法，包括以下步骤
(1)根据小菜蛾葛佬素成熟肽的编码，设计引物GIoExF和GloExR，序列如SEQID NO:5^6 所示；
(2)进行常规聚合酶链式反应扩增小菜蛾葛佬素成熟肽的cDNA；
(3)在适于表达的载体中克隆小菜蛾葛佬素成熟肽的cDNA；
(4)表达质粒pET-3h-PX-gl0在原核细胞中的高效表达；
(5)在适于表达该cDNA片段的条件下培养宿主细胞，并从中回收所需的产物。(6)在适于纯化的条件下纯化重组蛋白。作为一种优选方案，步骤(2)中所述聚合酶链式反应具体为
将混合液在94°C预变性5min，然后进入下列循环94°C、40秒，55°C、40秒，72°C、50 秒，共进行35个循环，最后72°C延伸7分钟，扩增完毕后置4°C终止反应。所述混合液组成如下
含20 mM Mg2+的10XPCR缓冲液5 μ 1各为2. 5 mM的dNTP混合物4μ 1浓度为10 μ M的引物GloExF4μ 1浓度为10 μ M的引物GloExR4μ 1浓度为5U/ μ 1的高保真DNA聚合酶0. 5μ 1灭菌水32. 5 μ 1。
作为一种优选方案，步骤(3)中所述的载体为pET_32a。更进一步地，步骤(3)具体包括
(a)杀菌活性肽的获得。为了在杀菌活性肽I^x-glo氨基端不引入其它氨基酸序列，在 设计GIoEXF和GIOEXR引物时，在上游引入了 Afco I酶切位点，下游引入损ο I酶切位点，这 样得到的成熟肽cDNA片段与载体连接保证了正确的插入方向。且表达的融合蛋白经肠激 酶切割后释放出具有天然N端的葛佬素。(b)将杀菌活性肽的cDNA进行Nco I和)(h0 I双酶切，胶纯化回收后，与经同样酶 切回收的质粒pET-3h体外连接，构建表达质粒pET-3h-Px-glo。作为一种优选方案，步骤(4)具体包括将宿主细菌BL21(DE!3)按1 50体积比 接种于新鲜的LB加富培养基(含100yg/ml Amp+)中，37 °C剧烈振荡放大培养至0D_ =0.8 时，加入终浓度为0.4 mM IPTG，同时加入终浓度为0. 的葡萄糖，降低本底的表达。在 25°C诱导表达9h，4 °C >12, OOOg离心anin，收集菌体备用。作为一种优选方案，步骤(5)具体包括将收集的菌体，经超声波细胞粉碎机，以 300W的功率，冰浴下超声4-5个循环(超声如，间歇如，重复90次为一个循环)破碎细菌 细胞，4°C、12，OOOg离心30min后取上清液。经Ni2+金属亲和层析His1Trap HP纯化融合 蛋白，纯化的融合蛋白经肠激酶(EK)酶切，酶切产物先用HisTrap HP (5 ml)进行纯化，收 集流出液，流出液再进行第二次HisTrap HP (5 ml)柱纯化，收集流出液，进一步用截留分 子量为20.0 kDa的超率装置(Amicon)对重组蛋白进行纯化，除去20.0 kDa以上的大蛋 白，进一步用截留分子量为10.0 kDa的超率装置(Amicon)对重组蛋白进行纯化，除去10.0 kDa以下的小蛋白，除去滤过液，冷冻干燥处理，-80°C保存备用。本发明的关键是诱导出抗菌肽基因和获得高质量的RNA，以采用异硫氰酸胍法为佳。与现有技术相比，本发明具有如下有益效果
本发明首次得到小菜蛾葛佬素(gloverin)抗菌肽基因并得到了重组蛋白。并设计了 合适的特异引物，采用异硫氰酸胍法提取总RNA得到了较好的结果，成功地完成了小菜蛾 葛佬素(gloverin)抗菌肽基因的克隆和原核表达。本发明的重组和纯化的小菜蛾葛佬素 (gloverin)抗菌肽可以抑制革兰氏阴性菌的生长，并且分子量小，对人体无免疫毒性，有很 大的药用、食品保鲜等开发前景。
具体实施例方式以下结合实施例来进一步解释本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。实施例1小菜蛾抗菌肽Gloverin基因的克隆方法 小菜蛾G0AzteBa xylosteIla L.)，田间采集，进行室内饲养。1.总RNA的提取用OD值为0. 8-1. 0的大肠杆菌刺激小菜蛾4龄幼虫，进行抗 菌肽的诱导。取经M小时诱导后的小菜蛾0. 5-1克，液氮中研磨，用异硫氰酸胍法提取总 RNA。2. c DNA第一链的合成按照CL0NTECH公司RACE试剂盒说明书进行，10微克总 RNA，加反应液20微升42V反应90分钟。72°C 10分钟终止反应。反应液组成50毫摩尔氯化钾，3毫摩尔氯化镁，10毫摩尔Tris-HCL PH8. 3，1毫摩尔DTT，5微摩尔d NTP, 25单 位RNA酶抑制剂，8单位AMV逆转录酶。3.聚合酶链式反应试剂和条件。首先在PCR管中加入下列试剂
将上述混合液94°C变性2分钟，然后进入下列循环94°C 30秒，65°C 30秒，72°C 30 秒，共进行35个循环，最后94°C延伸10分钟，结果扩增到两条400bp特异性带。4.抗菌肽基因的克隆利用OMEGA纯化试剂盒纯化PCR扩增片段，取3ul纯化产 物克隆到P MD18-T载体(TAKARA公司产品)，转化DH5a细胞，在含有氨苄青霉素(100微 克/毫升)和5-嗅-4-氯-3-吲哚- β -D-半乳糖苷(X-gal 0. 2微克/毫升)的LB平板上 过夜培养。5.质粒的纯化挑取白斑，接种于LB液体培养基，37°C摇床过夜培养后收取菌 液，按OMEGA试剂盒提取质粒。6.序列测定与同源检索经测试结果分析，推导得到具有175个氨基酸序列，将 此序列与已发表的抗菌肽的序列比较，结果与鳞翅目昆虫粉纹夜蛾(TWcM^mia ni)的 抗菌肽glovrin的氨基酸序列具有相似性，因此可以确定该基因为一种新的抗菌肽基因。实施例2制备有杀菌功能的小菜蛾葛佬素的方法 扩增小菜蛾葛佬素成熟肽编码的引物
根据小菜蛾葛佬素成熟肽编码设计引物，GloExF和GloExR。小菜蛾葛佬素成熟肽编码的PCR扩增
以小菜蛾4龄幼虫的cDNA为模板，反应条件如下 所述混合液组成如下
含 20 mM Mg2+ 的 10XPCR 缓冲液5 μ 1
dATP、dTTP、dCTP、dGTP 的浓度
各为2. 5 mM的dNTP混合物4 μ 1
浓度为10 μ M的引物GloExR4μ 1
浓度为10 μ M的引物GloExF4μ 1
浓度为5U/ μ 1的高保真DNA聚合酶0. 5 μ 1
灭菌水32. 5 μ 1
将混合液在94°C预变性5min，然后进入下列循环94°C、40秒，55°C、40秒，72°C、50 秒，共进行35个循环，最后72°C延伸7分钟，扩增完毕后置4°C终止反应。
10 X TaqDNA 聚合酶 buffer 模板c DNA 特异引物(1.25ug/ul) 通用引物(1.25ug/ul) 脱氧核苷酸混合物(d NTP Taq DNA聚合酶 (MH2O 总体积
0.25ul 37. 75ul 50ul
5ul Iul Iul Iul 4ul小菜蛾葛佬素成熟肽在原核细胞中的表达
将PCR扩增得到的小菜蛾葛佬素的cDNA进行Nco I和)(h0 I双酶切，胶纯化回收后，与 经同样酶切回收的质粒ρΕΤ-3^ι体外连接，构建表达质粒pET-3h-PX-gl0 ；将测序鉴定正 确的重组质粒pET-32a-PX-glo转化表达宿主菌BL21，构建工程菌株。挑取工程菌株单菌落 接种于LB液体加富培养基(含100 μ g/ml Amp+)中，37°C剧烈振荡培养16小时，作为种子 菌。取种子菌按1 50体积比接种于新鲜的LB加富培养基(含100yg/ml Amp+)中，37°C 剧烈振荡放大培养至0D_ =0.8时，加入终浓度为0.4 mM IPTG，同时加入终浓度为0.观的 葡萄糖，降低本底的表达。在25°C诱导表达9小时，4 0C ,12, OOOg离心^iiin，收集菌体备 用。并预留Iml菌液用于SDS-PAGE分析。用预冷的TE缓冲液(pH 8.0)洗涤菌体后，再 用预冷的溶液I (300 mM KCl (pH8. 0)，50 mM KH2PO4，5 mM咪唑)重悬菌体。采用JY92-II 型超声波细胞粉碎机(宁波新芝科器研究所研制)以300W的功率，冰浴下超声4-5个循环 (超声4s，间歇如，重复90次为一个循环)破碎细菌细胞，4°C、12，OOOg离心30min后取上 清液进行SDS-PAGE分析检测重组蛋白质的表达情况。重组小菜蛾抗菌肽葛佬素的纯化
将破碎菌体离心后收集的上清液，经Ni2+金属亲和层析HisTrap HP纯化融合蛋白，纯 化的融合蛋白经肠激酶(EK)酶切，酶切产物先用HisTrap HP (5 ml)进行纯化，收集流出 液，流出液再进行第二次HisTrap HP (5 ml)柱纯化，收集流出液，进一步用截留分子量为 20.0 kDa的超率装置(Amicon)对重组蛋白进行纯化，除去20.0 kDa以上的大蛋白，进一 步用截留分子量为10.0 kDa的超率装置(Amicon)对重组蛋白进行纯化，除去10.0 kDa以 下的小蛋白，除去滤过液，冷冻干燥处理，_80°C保存备用。上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的 限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化， 均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
权利要求
1.一种小菜蛾葛佬素基因，其特征在于该基因是长度650bp的双链DNA，其核苷酸序列 如 SEQ ID NO :1 所示。
2.权利要求1所述小菜蛾葛佬素基因编码的蛋白，其特征在于有175个氨基酸，其氨基 酸序列如SEQ ID NO:2所示。
3.权利要求1所述小菜蛾葛佬素基因的克隆方法，其特征在于包括如下步骤(1)将大肠杆菌注入小菜蛾幼虫体内进行诱导，诱导24h后提取总RNA，再将总RNA反 转录合成cDNA ；(2)根据小菜蛾葛佬素的表达序列标签序列EST设计5’和3’末端快速扩增反应的特 异引物，引物序列如SEQ ID NO: 3 4所示；(3)进行cDNA末端快速扩增反应，得到的DNA片段再克隆到pMDIS-T载体上，得到小菜蛾葛佬素基因。
4.权利要求2所述小菜蛾葛佬素基因编码的蛋白的制备方法，其特征在于包括如下步骤(1)根据小菜蛾葛佬素的氨基酸序列，设计引物，引物序列如SEQID N0:5飞所示；(2)PCR扩增小菜蛾葛佬素的cDNA ；(3)在载体中克隆小菜蛾葛佬素的cDNA；(4)将表达质粒在宿主细胞中表达；(5)培养宿主细胞，回收小菜蛾葛佬素。
5.根据权利要求4所述小菜蛾葛佬素基因编码的蛋白的制备方法，其特征在于步骤 (4)中所述宿主细胞为大肠杆菌BL21 (DE3)。
6.根据权利要求4所述小菜蛾葛佬素基因编码的蛋白的制备方法，其特征在于步 骤(5)中所述回收方法是将宿主细菌按1 50体积比接种于新鲜的LB加富培养基 (含100yg/ml Amp+)中，37°C剧烈振荡放大培养至OD6tltl =0.8时，加入终浓度为0.4 mM IPTG，同时加入百分比浓度为0. 2%的葡萄糖，降低本底的表达，在25°C诱导表达9h，4 °C、 12，OOOg离心2min，收集菌体，将菌体冰浴下经超声波细胞粉碎机破碎细胞，离心取上清， 经层析纯化、酶切、过滤，经冷冻干燥处理，得到小菜蛾葛佬素。
7.根据权利要求6所述小菜蛾葛佬素基因编码的蛋白的制备方法，其特征在于所述超 声破碎细胞是以300W的功率，超声4 5个循环，每个循环是超声如，间歇如，重复90次。
8.根据权利要求6所述小菜蛾葛佬素基因编码的蛋白的制备方法，其特征在于所述离 心是 40C、12，OOOg 离心 30min。
9.根据权利要求6所述小菜蛾葛佬素基因编码的蛋白的制备方法，其特征在于所述层 析纯化、酶切、过滤包括如下步骤经Ni2+金属亲和层析HisTrap HP纯化融合蛋白，纯化的 融合蛋白经肠激酶酶切，酶切产物先用5 ml HisTrap HP进行纯化，收集流出液，流出液 再进行第二次5 ml HisTrap HP柱纯化，收集流出液，进一步用截留分子量为20. 0 kDa的 超率装置对重组蛋白进行纯化，除去20.0 kDa以上的大蛋白，进一步用截留分子量为10.0 kDa的超率装置对重组蛋白进行纯化，除去10.0 kDa以下的小蛋白，除去滤过液。
10.权利要求2所述小菜蛾葛佬素在食品保鲜或饲料防腐中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种小菜蛾葛佬素基因及编码的蛋白、相应的表达系统和应用。本发明小菜蛾葛佬素基因是长度650bp的双链DNA，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。该基因编码的蛋白有175个氨基酸，其序列如SEQ ID NO:2所示。本发明通过基因重组技术在大肠杆菌中表达小菜蛾葛佬素，从而获得具有抗革兰氏阴性菌功能的小菜蛾葛佬素，在医药、食品保鲜或饲料防腐添加中具有广阔的应用前景。
文档编号C07K14/435GK102094023SQ20101058891
公开日2011年6月15日 申请日期2010年12月15日 优先权日2010年12月15日
发明者任顺祥, 许小霞, 金丰良 申请人:华南农业大学