包含丝氨酸蛋白酶变体的组合物和方法

包含丝氨酸蛋白酶变体的组合物和方法
【专利摘要】本发明提供丝氨酸蛋白酶变体，更具体而言为由其产生的枯草杆菌蛋白酶变体。具体而言，本发明提供与参考丝氨酸蛋白酶相比具有一个或多个置换的丝氨酸蛋白酶变体，更具体而言为枯草杆菌蛋白酶变体。另外，本发明提供包含这些丝氨酸蛋白酶变体，更具体而言枯草杆菌蛋白酶变体的组合物。在一些实施例中，本发明提供包含这些丝氨酸蛋白酶变体、更具体而言枯草杆菌蛋白酶变体中的至少一者的清洁组合物。
【专利说明】包含丝氨酸蛋白酶变体的组合物和方法
【技术领域】
[0001]本发明提供丝氨酸蛋白酶变体。具体而言，本发明提供与参考丝氨酸蛋白酶相比具有一个或多个置换的丝氨酸蛋白酶变体。此外，本发明提供包含这些丝氨酸蛋白酶变体的组合物。在一些实施例中，本发明提供包含这些丝氨酸蛋白酶变体(更具体而言是枯草杆菌蛋白酶变体)中的至少一者的清洁组合物。
[0002]发明背景
[0003]尽管丝氨酸蛋白酶在工业酶领域中已久为人所知，但对于适于特定条件和用途的工程蛋白酶仍存在需要。

【发明内容】

[0004]在一些实施例中，本发明包括分离的枯草杆菌蛋白酶变体，其中所述枯草杆菌蛋白酶变体为具有蛋白水解活性的成熟形式并且具有包含氨基酸置换的组合的氨基酸序列，所述氨基酸置换处于选自列表1-19的位置，并且其中所述枯草杆菌蛋白酶变体的氨基酸位置是根据SEQ ID NO:1中所示解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)枯草杆菌蛋白酶BPN’的氨基酸序列中的对应氨基酸位置的编号方式进行编号。
[0005]在一些实施例中，本发明包括迟缓芽孢杆菌(Bacillus lentus)枯草杆菌蛋白酶GG36蛋白酶的分离的枯草杆菌蛋白酶变体，其中所述迟缓芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶GG36蛋白酶具有SEQ ID NO: 2中所示的氨基酸序列，并且其中所述枯草杆菌蛋白酶变体与SEQID NO:2具有至少80%的氨基酸序列同一性且具有蛋白水解活性并且具有包含氨基酸置换的组合的氨基酸序列，所述氨基酸置换选自列表1-19，并且其中所述枯草杆菌蛋白酶变体的氨基酸位置是根据SEQ ID NO:1中所示解淀粉芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶BPN’的氨基酸序列中的对应氨基酸位置的编号方式进行编号。
[0006]在一些实施例中，本发明包括编码分离的枯草杆菌蛋白酶变体的核酸，其中所述枯草杆菌蛋白酶变体为具有蛋白水解活性的成熟形式并且具有包含氨基酸置换的组合的氨基酸序列，所述氨基酸置换处于选自列表1-19的位置，并且其中所述枯草杆菌蛋白酶变体的氨基酸位置是根据SEQ ID NO:1中所示解淀粉芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶BPN’的氨基酸序列中的对应氨基酸位置的编号方式进行编号。在一些实施例中，本发明为用于产生上述变体任一者的表达载体、宿主细胞或方法。
[0007]在一些实施例中，本发明包括编码迟缓芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶GG36蛋白酶的分离的枯草杆菌蛋白酶变体的核酸，其中所述迟缓芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶GG36蛋白酶具有SEQ ID NO:2中所示的氨基酸序列，并且其中所述枯草杆菌蛋白酶变体与SEQ ID NO:2具有至少80%的氨基酸序列同一性且具有蛋白水解活性并且具有包含氨基酸置换的组合的氨基酸序列，所述氨基酸置换选自列表1-19，并且其中所述枯草杆菌蛋白酶变体的氨基酸位置是根据SEQ ID NO:1中所示解淀粉芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶BPN’的氨基酸序列中的对应氨基酸位置的编号方式进行编号。在一些实施例中，本发明为用于产生上述变体任一者的表达载体、宿主细胞或方法。[0008]在上文所列的每个实施例中，与具有SEQ ID NO:2中所示氨基酸序列的GG36蛋白酶相比，所述变体可具有改善的清洁性。
[0009]在一些实施例中，本发明包括上述变体或编码所述变体的核酸中的任一者，其中所述变体的总净电荷相对于迟缓芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶GG36蛋白酶的总净电荷为O、+1、+2、+3、+4、+5、-1、-2、-3、-4 或-5。
[0010]在一些实施例中，本发明包括具有上文所列变体中的至少一者的组合物，其中所述组合物不是织物和家庭护理产品。在一些实施例中，本发明为使用上述组合物的清洁方法。
【专利附图】

【附图说明】
[0011]图1提供了包括BPN’ (SEQ ID NO:1)和GG36 (SEQ ID NO:2)在内的成熟参考蛋白酶的比对。每种蛋白酶变体(更具体而言,本文所述的枯草杆菌蛋白酶变体,包括每种冷水蛋白酶变体)的每个氨基酸位置均根据如图1中所显示的解淀粉芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶BPN’ (SEQ ID NO:1)的氨基酸序列中的对应氨基酸位置的编号方式进行编号，如通过将所述蛋白酶变体氨基酸序列与解淀粉芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶BPN’的氨基酸序列进行比对所确定的。因而，除非本文另外指明，否则置换位置是以与BPN’的关系给出。
【具体实施方式】
[0012]本发明提供丝氨酸蛋白酶变体，更具体而言枯草杆菌蛋白酶变体。具体而言，本发明提供与参考丝氨酸蛋白酶 相比具有一个或多个置换的丝氨酸蛋白酶变体，更具体而言枯草杆菌蛋白酶变体。另外，本发明提供包含这些丝氨酸蛋白酶变体(更具体而言，枯草杆菌蛋白酶变体)的组合物。在一些实施例中，本发明提供包含这些丝氨酸蛋白酶变体(更具体而言是枯草杆菌蛋白酶变体)中的至少一者的清洁组合物。
[0013]定义
[0014]除非另外指明，否则本发明的实施涉及处于本领域技术范围内的常用于分子生物学、蛋白质工程改造、微生物学和重组DNA的常规技术。这类技术是本领域技术人员已知的并描述于本领域技术人员众所周知的许多文章和参考著作中。将本文提及的所有专利、专利申请、文章和出版物，包括上文中和下文中的，都特此明确地以引用的方式并入本文。
[0015]除非另外定义，否则本文所用的所有技术和科学术语均具有与本发明所属领域普通技术人员所一般理解的含义相同的含义。许多技术词典是本领域技术人员已知的。尽管与本文描述的方法和材料相似或等同的任何方法和材料均可用于本发明的实施，但还是在本文中描述了一些合适的方法和材料。相应地，通过整体参考本说明书来更完整地描述接下来定义的术语。另外，如本文所用，除非上下文明确指明，否则单数术语“一”、“一个”和“所述”包括复数含义。数值范围包括限定该范围的数值。除非另外指明，否则分别地，核酸从左至右以5'至3'取向写出；氨基酸序列从左至右以氨基至羧基取向写出。应当理解，本发明不限于所描述的具体方法学、方案和试剂，因为这些方面可根据本领域技术人员使用它们的背景而有所变化。
[0016]除非另外指明，否则本发明的实施可采用蛋白质纯化、分子生物学、微生物学、重组DNA技术以及蛋白质测序的常规技术，所有这些均在本领域技术人员的技能之内。[0017]此外，本文提供的标题并是对本发明的各个方面或实施例的限制，这些方面或实施例都可以通过整体参考说明书而获取。因此，通过整体参考本说明书可更完全地限定下文定义的术语。尽管如此，为了便于理解本发明，将多个术语定义如下。
[0018]如本文所用，术语“蛋白酶”和“朊酶”是指具有分解其他蛋白质的能力的酶蛋白。蛋白酶具有进行“蛋白水解”的能力，其通过水解在形成该蛋白质的肽或多肽链中将氨基酸连接在一起的肽键而开始蛋白质分解代谢。蛋白酶作为蛋白质消化酶的这种活性称为“蛋白水解活性”。存在许多众所周知的用于测量蛋白水解活性的方法(参见例如，Kalisz, “Microbial Proteinases (微生物蛋白酶)”，载于:Fiechter (编辑)，Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology (《生物化学工程 / 生物技术进展》)(1988))。例如，蛋白水解活性可通过可分析各蛋白酶水解商业底物的能力的比较测定法来确定。可用于蛋白酶或蛋白水解活性的分析的示例性底物包括但不限于:二甲基酪蛋白(Sigma C-9801)、牛胶原(Sigma C-9879)、牛弹性蛋白(Sigma E-1625)和牛角蛋白(ICN BiomediCal902111)。利用这些底物的比色测定法为本领域所熟知的(参见例如W099/34011和美国专利N0.6，376，450，将这二者以引用的方式并入本文)。pNA测定法(参见例如Del Mar等人，Anal.Biochem.(《分析生物化学》)99:316-320 [1979])也可以用于测定在梯度洗脱期间收集的级分的活性酶浓度。该测定法测量当该酶水解可溶性的合成底物即琥珀酰-丙氨酸-丙氨酸-脯氨酸-苯丙氨酸-对硝基苯胺(suc-AAPF-pNA)时对硝基苯胺释放的速率。用分光光度计在410nm处测量从该水解反应产生黄色的速率，其与活性酶浓度成比例。此外，280纳米(nm)处的吸光度测量值可用于测定总蛋白质浓度。活性酶/总蛋白质比率给出了酶纯度。
[0019]如本文中所用，术语“枯草杆菌蛋白酶”是指如在MEROPS-肽酶数据库(MEROPS-The Peptidase Data base)中所述的S8丝氨酸蛋白酶家族的任何成员(参见Rawlings 等人，MEROPS:the peptidase database (MER0PS:妝酶数据库)，Nucl AcidsRes(《核酸研究》)，34Database issue (数据库期)，D270-272 [2006])。如其中所述，肽酶家族S8含有丝氨酸内肽酶枯草杆菌蛋白酶及其同源物(Rawlings和Barrett, BiochemJ.(《(生物化学杂志》)，290:205-218, [1993])。S8家族也称为枯草杆菌酶(subtilase)家族，是丝氨酸肽酶的第二大家族。现在已经测定了 S8家族若干成员的三级结构。典型的S8蛋白质结构由三个层组成，其中一个七股β片层夹在两层螺旋之间。枯草杆菌蛋白酶(S08.001)是异种集团(clan)SB(SB)的典型结构。尽管结构不同，但枯草杆菌蛋白酶和胰凝乳蛋白酶(S01.001)的活性位点可叠合，这表明该相似性是趋同进化而不是趋异进化的结果。
[0020]本文所用的术语“蛋白酶变体”、“变体蛋白酶”、“变体丝氨酸蛋白酶”、“丝氨酸蛋白酶变体”、“枯草杆菌蛋白酶变体”、“突变蛋白酶”用于指与参考蛋白酶(可以为野生型枯草杆菌蛋白酶)相似的蛋白酶(尤其是在其功能上)，但在其氨基酸序列中有使得它们在序列上与衍生该变体蛋白酶的野生型蛋白酶或任何起始参考蛋白酶(即“亲本”蛋白酶)不同的突变。在一些实施例中，本发明提供了 “GG36变体”(或“GG36枯草杆菌蛋白酶变体”)，其中在SEQ ID NO:2所示的成熟GG36序列中存在突变。然而，并不旨在使参考蛋白酶局限于任何特定的氨基酸序列。此外，该术语旨在涵盖亲本蛋白酶的变体，其中所述亲本蛋白酶的序列与SEQ ID NO:2的氨基酸序列具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%的同一性。
[0021]如本文所以，术语“冷水蛋白酶变体”意指亲本蛋白酶的蛋白酶变体(更具体而言，枯草杆菌蛋白酶变体)，其中所述迟缓芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶GG36蛋白酶具有SEQID NO:2的氨基酸序列，其中所述蛋白酶变体(更具体而言，枯草杆菌蛋白酶变体)具有如下特性中的一者或多者:a)至少1.1、至少1.2、至少1.3、至少1.4、至少1.5、至少1.6、至少1.7、至少1.8、至少1.9、至少2、1.1至约10、1.1至约8或甚至1.1至约5的测试方法2性能指数；b)至少1.1、至少1.2、至少1.3、至少1.4、至少1.5、至少1.6、至少1.7、至少1.8、至少1.9、至少2、1.1至约10、1.1至约8或甚至1.1至约5的测试方法3性能指数；c)至少1.0、至少1.1、至少1.2、至少1.3、至少1.4、至少1.5、至少1.6、至少1.7、至少1.8、至少1.9、至少2、1.0至约10、1.0至约8或甚至1.0至约5的测试方法4性能指数；和/或d)至少1.1、至少1.2、至少1.3、至少1.4、至少1.5、至少1.6、至少1.7、至少1.8、至少1.9、至少2、1.0至约10、1.0至约8或甚至1.0至约5的测试方法6性能指数；和/或e)至少1.1、至少1.2、至少1.3、至少1.4、至少1.5、至少1.6、至少1.7、至少1.8、至少1.9、至少2、1.1至约15、1.1至约10或甚至1.1至约7的测试方法7性能指数。在下文实例I中标题为“测试方法”的部分中明确描述了测试方法2、测试方法3、测试方法4、测试方法6和测试方法7。此外，该术语旨在涵盖亲本蛋白酶的变体，其中所述亲本蛋白酶的序列与SEQ IDNO: 2的氨基酸序列具有至少80 %、至少85 %、至少90 %、至少95 %、至少96 %、至少97 %、至少98%、至少99%或100%的同一性。
[0022]在本发明的一些实施例中，所述亲本蛋白酶(即“参考”或“起始”蛋白酶)为可商购获得的蛋白酶，包括但不限于:以如下商标名销售的蛋白酶:SAVINASE?、POLARZYME?、KANNASE?、LIQUINASE?、
LIQUINASE ULTRA?、SAVINASE ULTRA?、OVOZYME? (诺维信公司(Novozymes A/S)销售)；MAXACAL?、PROPERASE?、PURAFECT? >FN3?、FN4?和 PURAFECT 0XP?、PURAFAST?、PURAFECT? PR頂E、PURAMAX? (由
美国丹尼斯克杰能科分公司(Danisco US, Genencor Division)销售的蛋白酶；以及可得自汉高/凯米拉公司(Henkel/Kemira)的那些，即BLAP (US5，352，604的图29中所示的氨基酸序列，具有如下突变S99D+S101R+S103A+V104I+G159S，下文中称为BLAP)和BLAP X(具有S3T+V4I+V205I 的 BLAP)。
[0023]本文所用的术语“变体多肽”是指包含与亲本或参考多肽(包括但不限于野生型多肽)的氨基酸序列相差至少一个氨基酸残基的氨基酸序列的多肽。
[0024]如本文中所用，芽孢杆菌属(Bacillus)包括本领域技术人员已知的芽孢杆菌属内的所有种，包括但不限于枯草芽孢杆菌(B.subtilis)、地衣芽孢杆菌(B.1icheniformis)、迟缓芽孢杆菌、短芽孢杆菌(B.brevis)、嗜热脂肪芽孢杆菌(B.stearothermophiIus)、嗜碱芽孢杆菌(B.alkalophilus)、解淀粉芽孢杆菌、克劳氏芽孢杆菌(B.clausii)、耐盐芽孢杆菌(B.halodurans)、巨大芽孢杆菌(B.megaterium)、凝结芽孢杆菌(B.coagulans) 、环状芽孢杆菌(B.circulans)、灿烂芽孢杆菌(B.1autus)和苏云金芽孢杆菌(B.thuringiensis)。已经认识到，芽孢杆菌属还在继续进行分类学整理。因此，该属旨在包括已经重新分类的种，包括(但不限于)诸如现在命名为“嗜热脂肪地芽孢杆菌(Geobacillus stearothermophilus) ”的嗜热脂肪芽孢杆菌之类的生物体。在存在氧气的情况下产生抗性内生孢子被视为芽孢杆菌属的定义性特征，但该特性还适用于最近命名的脂环酸芽孢杆菌属(Alicyclobacillus)、双芽孢杆菌属(Amphibacillus)、解硫胺素芽孢杆菌属(Aneurinibacillus)、厌氧芽孢杆菌属(Anoxybacillus)、短芽孢杆菌属(Brevibacillus)、线芽抱杆菌属(Filobacillus)、薄壁芽抱杆菌属(Gracilibacillus)、嗜盐芽孢杆菌属(Halobacillus)、类芽孢杆菌属(Paenibacillus)、盐芽孢杆菌属(Salibacillus)、热芽抱杆菌属(Thermobacillus)、服芽抱杆菌属(Ureibacillus)和枝芽抱杆菌属(Virgibacillus)。
[0025]术语“多核苷酸”和“核酸”在本文中可互换使用，指在链中共价键合的核苷酸单体的任何长度的聚合物。DNA (脱氧核糖核酸)(包含脱氧核糖核苷酸的多核苷酸)和RNA (核糖核酸)(核糖核苷酸的聚合物)是具有独特生物学功能的多核苷酸或核酸的例子。多核苷酸或核酸包括(但不限于):单链、双链或三链DNA、基因组DNA、cDNA、RNA、DNA-RNA杂交体，或包含嘌呤和嘧啶碱基的聚合物，或其他天然的、经化学修饰的、经生物化学修饰的、非天然的或衍生化的核苷酸碱基。如下是多核苷酸的非限制性例子:基因、基因片段、染色体片段、表达序列标签(EST)、外显子、内含子、信使RNA(mRNA)、转运RNA(tRNA)、核糖体RNA(rRNA)、核酶、互补DNA(cDNA)、重组多核苷酸、分支多核苷酸、质粒、载体、任何序列的分离的DNA、任何序列的分离的RNA、核酸探针和引物。在一些实施例中，多核苷酸包括经修饰的核苷酸，如甲基化的核苷酸和核苷酸类似物、尿嘧啶基(uracyl)、其他糖和连接基如氟代核糖和硫代酸酯(thioate)，以及核苷酸支链。在具体实施例中，核苷酸的序列夹杂有非核苷酸组分。
[0026]本文所用的术语“突变”是指在起始氨基酸或核酸序列中作出的变化。该术语旨在涵盖置换、插入和缺失。
[0027]如本文所用，术语“载体”指用于将核酸或多核苷酸引入或转移进靶细胞或组织中的核酸构建体或多核苷酸构建体。载体通常用于将外来DNA引入另一细胞或组织中。载体通常包含作为转基因的DNA序列和充当该载体“骨架”的较大的多核苷酸序列。载体通常起到转移遗传信息(如插入的转基因)至靶细胞或组织的作用，以便在该靶细胞或组织中分离、增殖或表达该插入物。载体包括质粒、克隆载体、噬菌体、病毒(如病毒载体)、粘粒、表达载体、穿梭载体、盒(cassette)等等。载体通常包含复制起点、多克隆位点和选择性标记。将载体插入靶细胞的过程通常称为转染。使用病毒载体进行的细胞转染通常称为转导。在一些实施例中，本发明包括载体，该载体包含编码变体蛋白酶(如前体或成熟变体蛋白酶)的DNA序列，该DNA序列与能够实现其在合适宿主中表达的合适前序列(如分泌序列、信号肽序列等)有效连接。
[0028]本文所用的术语“表达盒”、“表达质粒”或“表达载体”是指以重组方式或以合成方式产生的、用于所关注的核酸(如外来核酸或转基因)在靶细胞中表达的核酸构建体或载体。所关注的核酸通常表达所关注的蛋白质。表达载体或表达盒通常包含驱动或促进外来核酸的表达的启动子核苷酸序列。表达载体或表达盒还通常包含允许特定核酸在祀细胞中的转录的任何其他规定的核酸元件。重组表达盒可掺入质粒、染色体、线粒体DNA、质体DNA、病毒或核酸片段中。某些表达载体具有使异源DNA片段插入宿主细胞中以及使其在宿主细胞中表达的能力。许多原核和真核表达载体是可商购获得的。适宜的表达载体的选择在本领域技术人员的知识范围内。用于从掺入表达载体中的核酸序列表达蛋白质的适当表达载体的选择在本领域技术人员的知识范围内。
[0029]DNA构建体是可被引入靶细胞或组织中的人工构建的核酸区段。DNA构建体通常包含已被亚克隆进载体中的DNA插入物，该DNA插入物包含编码所关注的蛋白质的核苷酸序列。载体可含有用于在细菌中生长的细菌抗性基因和用于所关注的蛋白质在生物体中的表达的启动子。DNA可通过PCR或本领域技术人员已知的任何其他合适的技术体外产生。在一些实施例中，DNA构建体包含所关注的核酸序列。在一些实施例中，该序列与另外的元件例如控制元件(如启动子等)有效连接。DNA构建体可还包含选择性标记并且可还包含侧接有同源盒(homology box)的输入序列(incoming sequence)。构建体可包含添加至末端的其他非同源序列(如填充序列(stuffer sequence)或旁侧序列(flank))。在一些实施例中，序列的末端是闭合的，使得DNA构建体形成闭环。用本领域熟知的技术掺入DNA构建体中的所关注的核酸序列可以是野生型的、突变型的或经修饰的核酸。在一些实施例中，DNA构建体包含一条或多条与宿主细胞染色体同源的核酸序列。在其他实施例中，DNA构建体包含一条或多条非同源核苷酸序列。一旦体外装配了 DNA构建体，则可将其用于例如:1)将异源序列插入宿主细胞的所需靶序列中；和/或2)诱变宿主细胞染色体的区域(即用异源序列置换内源序列)；3)使靶基因缺失；和/或4)将复制型质粒引入宿主中。在本文中“DNA构建体”可与“表达盒”互换使用。
[0030]如本文所用，“质粒”指染色体外DNA分子，其能够独立于染色体DNA进行复制。质粒是双链的(ds)并且可以是环状的，通常用作克隆载体。
[0031]如本文在将核酸序列引入细胞的语境中所用，术语“引入”指任何适于将核酸序列转移进细胞中的方法。这类引入方法包括但不限于:原生质体融合、转染、转化、电穿孔、接合和转导(参见例 如Ferrari等人“Genetics” ( “遗传学”)，载于Hardwood等人(编
) Bacillus (《芽孢杆菌》)，普莱南出版公司(Plenum Publishing Corp.),第57-72页[1989])。
[0032]转化是指因遗传物质(如DNA)的吸收、基因组掺入和表达所致的细胞的遗传变更。
[0033]如本文所用，当核酸被置于与另一核酸序列的功能性关系中时，该核酸与另一核酸序列“有效连接”。例如，如果启动子影响核苷酸编码序列的转录，则该启动子或增强子与该编码序列有效连接。如果核糖体结合位点被设置成使得有利于编码序列的翻译，则该核糖体位点可与该编码序列有效连接。通常，“有效连接的”DNA序列是连续的。然而，增强子不必是连续的。连接是通过在便利的限制位点处的连接来实现。如果这类位点不存在，则可根据常规操作使用合成的寡核苷酸接头或连接物。
[0034]如本文所用，术语“基因”是指多核苷酸(例如，DNA片段)，其编码多肽并且包括编码区之前和之后的区域以及各个编码片段(外显子)之间的插入序列(内含子)。
[0035]如本文所用，在用于指细胞时“重组的”通常指该细胞已通过引入异源核酸序列而进行了修饰或指该细胞衍自经过如此修饰的细胞。例如，重组细胞可包含这样的基因，其不以相同的形式存在于天然(非重组)形式的该细胞内，或者重组细胞可包含(存在于天然形式的细胞中的)天然基因，但该基因已经过修饰并被再次引入该细胞中。重组细胞可包含对该细胞而言是内源性的核酸，该核酸在未将其从该细胞移除的情况下进行了修饰；这种修饰包括通过基因置换、定点突变以及本领域一般技术人员已知的相关技术获得的那些修饰。重组DNA技术包括用于在体外产生重组DNA和将重组DNA转移进细胞的技术，重组DNA在细胞中可以表达或增殖，从而产生重组的多肽。多核苷酸或核酸的“重组”和“重组的”一般是指两条或更多条核酸或多核苷酸链或片段的组装或组合，以产生新的多核苷酸或核酸。重组多核苷酸或核酸有时称为嵌合体。当核酸或多肽为人工的或工程化改造的，或衍生自人工的或工程化改造的蛋白质或核酸时，该核酸或多肽是“重组的”。
[0036]如本文所用，术语核酸或基因“扩增”是指这样的一种过程，通过该过程特定DNA序列以不成比例的方式复制，使得被扩增的核酸或基因以高于基因组中最初存在的拷贝数的拷贝数存在。在一些实施例中，通过在药物(例如，可抑制的酶的抑制剂)的存在下培养而进行的细胞的选择，导致编码在所述药物的存在下生长所需的基因产物的内源性基因的扩增，或编码该核酸或基因产物的外源(即，输入)序列的扩增或二者皆有。
[0037]“扩增”是涉及模板特异性的核酸复制的特定情形。与其形成对照的是非特异性模板复制(即，复制是模板依赖的，但不依赖于特异性模板)。模板特异性在这里区别于复制的保真性(即，正确的多核苷酸序列的合成)和(核糖或脱氧核糖)核苷酸特异性。模板特异性在很多情况下以“靶”特异性描述。靶序列是此种意义的“靶”，也就是可设法将它们从其他核酸挑选出来。已经设计出主要用于该挑选的扩增技术。
[0038]如本文所用，术语“引物”是指寡核苷酸(核苷酸残基的聚合物)，无论是天然产生的(如在纯化的限制性消化产物中)还是合成产生的，其能够在被置于与核酸链互补的引物延伸产物的合成在其中被诱发的条件下时(即，在核苷酸和诱发剂如DNA聚合酶的存在下并且在适合的温度和PH下)，作为合成起始的点起作用。为了使扩增效率最高，引物优选为单链的，但作为另一种选择其也可以是双链的。如果是双链，则首先对引物进行处理以分离其链，然后再用于制备延伸产物。在一些实施例中，引物为寡脱氧核糖核苷酸。引物必须足够长以在诱导剂的存在下引发延伸产物的合成。引物的确切长度取决于多种因素，包括温度、引物来源以及使用的方法。
[0039]如本文所用，术语“探针”指这样的寡核苷酸，无论是如在纯化的限制酶切消化物中的天然存在的还是以合成 方式、重组方式或通过PCR扩增产生的，其通常能够与所关注的另一寡核苷酸杂交。探针可以是单链的或双链的。探针可用于特定基因序列的检测、鉴别和分离。设想到，本发明中所用的任何探针将用任何“报告分子”进行标记，从而其可在任何检测系统中检测，所述检测系统包括但不限于酶系统(如ELISA，以及基于酶的组织化学测定法)、荧光系统、放射性系统和发光系统。无意于将本发明局限于任何具体的检测系统或标记。
[0040]如本文所用，当用于讨论聚合酶链反应时，术语“靶”是指用于聚合酶链反应的引物结合的核酸区域。因此，可设法将“靶”从其他核酸序列中挑选出来。核苷酸“片段”是在靶核酸序列内的核酸区域。
[0041]如本文所用，术语“聚合酶链反应”(PCR)是指美国专利N0.4，683，195、N0.4，683，202和N0.4，965，188的方法(特此将该专利以引用方式并入)，其包括在不进行克隆或纯化的情况下增加靶序列的某个片段在基因组DNA的混合物中的浓度的方法。扩增靶序列的这种方法是本领域众所周知的。
[0042]如本文所用，术语“扩增试剂”指扩增所需的除引物、核酸模板以及扩增酶以外的那些试剂(如脱氧核糖核苷三磷酸、缓冲剂等)。通常，将扩增试剂连同其他反应组分放置于和装于反应容器(试管、微孔等)中。
[0043]如本文所用，术语“限制性内切酶”或“限制酶”指能够在称为限制位点的特定核苷酸序列处或附近切开双链或单链DNA的酶(如细菌酶)。包含限制位点的核苷酸序列为给定的限制性内切酶或限制酶所识别和切割并且常常是插入DNA片段的位点。可将限制位点工程引入进表达载体或DNA构建体中。
[0044]“同源重组”是指两个DNA分子或成对染色体之间的DNA片段在相同或几乎相同的核苷酸序列位点处的交换。在一些实施例中，染色体整合是同源重组。
[0045]如果核酸或多核苷酸在天然状态下或通过本领域的技术人员已知的方法操纵时，可转录和/或翻译产生多肽或其片段，则称该核酸或多核苷酸“编码”多肽。也称此类核酸的反义链编码该序列。
[0046]如本领域已知的，DNA序列可被RNA聚合酶转录而产生RNA序列，但RNA序列可被逆转录酶逆转录而产生DNA序列。
[0047]“宿主菌株”或“宿主细胞”指适合于包含所关注的DNA序列的表达载体的宿主。所关注的DNA序列可在宿主菌株或宿主细胞中表达所关注的蛋白质。
[0048]“蛋白质”或“多肽”包含氨基酸残基的多聚序列。在本文中，术语“蛋白质”与“多肽”可互换使用。遵照国际 纯化学及应用化学联合会-国际生物化学联合会的生物化学命名委员会(IUPAC-1UB Joint Commission on Biochemical Nomenclature, JCBN)所定义的氨基酸的单字母和三字母代码在整个本公开中使用。单字母X指二十种氨基酸中的任一种。还应理解，由于遗传密码的简并性，多肽可由不止一种核苷酸序列编码。突变按以下方式命名:亲本氨基酸的单字母代码，后跟三位数或两位数的位置编号，然后是变体氨基酸的单字母代码。例如，使位置87的甘氨酸(G)突变为丝氨酸(S)表示为“G087S”或“G87S”。多重突变通过在各突变之间插入表示。在位置87和90的突变表示为“G087S-A090Y”或“G87S-A90Y”或“G87S+A90Y”或“G087S+A090Y”。对于缺失，使用单字母代码“Z”。对于相对于亲本序列的插入，单字母代码“Z”位于该位置号码的左侧。对于缺失，单字母代码“Z”位于该位置号码的右侧。对于插入，位置号码是在插入的氨基酸的前面的位置号码，每个氨基酸加0.01。例如，在位置87和88之间插入三个氨基酸即丙氨酸(A)、丝氨酸(S)和酪氨酸(Y)显示为“Z087.01A-Z087.02S-Z087.03Y”。因而，将上面所有的突变加上位置100处的缺失组合在一起为:“G087S-Z087.01A-Z087.02S-Z087.03Y-A090Y-A100Z”。
[0049]“前序列”或“前肽序列”是指蛋白酶分泌所必要的处于信号肽序列和成熟蛋白酶序列之间的氨基酸序列。前序列或前肽序列的切除会得到成熟的活性蛋白酶。
[0050]术语“信号序列”或“信号肽”指可参与成熟或前体形式的蛋白质的分泌或直接转运的氨基酸残基序列。信号序列通常位于前体或成熟蛋白质序列的N端。信号序列可以是内源性的或外源性的。一种示例性的外源性信号序列包含来自枯草芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶的信号序列的前七个氨基酸残基和与之融合的来自迟缓芽孢杆菌(ATCC 21536)枯草杆菌蛋白酶的信号序列的其余部分。通常成熟蛋白质缺少信号序列。在转运蛋白质后通常由信号肽酶从该蛋白质切除信号序列。
[0051]术语“杂合信号序列”指与待表达的基因的信号序列融合的信号序列，其中该序列的一部分从表达宿主获得。在一些实施例中，利用合成序列。[0052]术语蛋白质、多肽或肽的“成熟”形式指无信号肽序列和前肽序列的该蛋白质、多肽或肽功能形式。
[0053]术语蛋白质或肽的“前体”形式指具有与该蛋白质的氨基或羰基末端有效连接的前序列的该蛋白质成熟形式。前体还可具有与前序列的氨基末端有效连接的“信号”序列。前体还可以具有涉及翻译后活性的另外的多核苷酸(例如，从前体切除会留下蛋白质或肽的成熟形式的多核苷酸)。
[0054]关于氨基酸序列或核酸序列的术语“野生型”指所述氨基酸序列或核酸序列是天然的或天然存在的序列。本文所用的术语“天然存在的”指自然界中存在的(即还未借助重组方法进行过操纵的)任何东西(如蛋白质、氨基酸或核酸序列)。
[0055]本文所用的术语“非天然存在的”是指自然界中不存在的任何东西(如实验室中产生的重组核酸)。
[0056]如本文所用，对于氨基酸残基位置，“与相对应”或“对应于”或“对应”是指在蛋白质或肽的列举位置处的氨基酸残基，或与蛋白质或肽中列举的残基类似、同源或等同的氨基酸残基。如本文所用，“对应区域”一般是指沿相关蛋白质或参考蛋白质的类似位置。
[0057]术语“衍生自”和“得自”不仅指通过所考虑的生物菌株产生或可产生的蛋白酶，还指从此类菌株分离的DNA序列编码的以及在包含此类DNA序列的宿主生物中产生的蛋白酶。另外，该术语指由合成的和/或cDNA起源的DNA序列编码的，并且具有所考虑的蛋白酶的鉴别特性的蛋白酶。例如，“衍生自芽孢杆菌属的蛋白酶”是指那些由芽孢杆菌天然产生的具有蛋白水解活性的酶，以及指与由芽孢杆菌来源产生的那些蛋白酶类似的丝氨酸蛋白酶，但这些丝氨酸蛋白酶是通过使用基因工程技术由转化有编码丝氨酸蛋白酶的核酸的非芽孢杆菌生物体产生的。
[0058]在两条核酸或多肽序列的语境中，术语“相同”是指当比对以达到最大匹配程度时两条序列中相同的残基，如使用如下序列比较或分析算法中的一种所测定的。
[0059]如本文所用，“同源基因”是指来自不同但通常相关的物种的一对基因，这对基因彼此对应并且彼此相同或非常类似。该术语涵盖了因物种形成(即新物种的发展)而分化的基因(如直向同源基因)，以及因基因复制而分化的基因(如平行同源基因)。
[0060]如本文所用，“同源性”是指序列相似性或同一性，其中同一性是优选的。同源性可用本领域已知的标准技术确定(参见例如Smith和Waterman, Adv.App1.Math.(《应用数学进展》)，2:482[1981] ;Needleman和Wunsch，J.Mol.Biol.(《分子生物学杂志》)，48:443 [1970] ;Pearson 和 Lipman，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA(《美国科学院院刊》)，85:2444[1988];软件程序，如威斯康辛遗传软件包(Wisconsin Genetics Software Package)(遗传计算小组公司(Genetics Computer Group),威斯康辛州麦迪逊(Madison, WI))中的 GAP、BESTFIT、FASTA 和 TFASTA ;以及 Devereux 等人，Nucl.Acid Res.(《核酸研究》)，12:387-395 [1984])。可用的算法的一个例子是PILEUP。PILEUP利用渐进性双序列比对从一组相关序列产生多序列比对。其还可以画出树状图，该图示出用于产生该比对的聚类关系。PILEUP使用Feng和Doolittle的渐进比对方法(参见Feng和Doolittle, J.Mol.Evol.(《分子进化杂志》)，35:351-360[1987])的简化方法。该方法与Higgins和Sharp描述的方法(参见 Higgins 和 Sharp，CAB10S5: 151-153 [1989])类似。可用的 PILEUP 参数包括:默认空位权重=3.00，默认空位长度权重=0.10，以及加权的末端空位。可用的算法的另一个例子是BLAST算法,该算法由Altschul等人进行了描述(参见Altschul等人，J.Mol.Biol.(《分子生物学杂志》)，215:403-410[1990];以及 Karlin 和 Altschul，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA(《美国科学院院刊》)，90:5873-5787[1993])。尤其可用的BLAST程序是WU-BLAST-2程序(参见Altschul等人,Meth.Enzymol.(《酶学方法》)，266:460-480 [1996])。WU-BLAST-2使用数种搜索参数，大部分参数设定为默认值。可调参数设定为如下值:重叠跨度(overlap span) = I,重叠分数(overlap fraction) = 0.125,字串阈值(word threshold) (T) = 11。HSP S和HSP S2参数是动态值，由程序自身根据特定序列的组成和被用来搜索所关注的序列的特定数据库的组成来确定。然而，可以调整所述值来增加灵敏度。
[0061]参考序列和所关注的测试序列之间的序列同一性百分数可由本领域技术人员容易地测定。多核苷酸或多肽序列共有的同一性百分数通过分子之间序列信息的直接比较测定，所述比较通过序列比对并使用本领域已知的方法确定同一性来进行。适用于确定序列相似性的算法的例子是BLAST算法(参见Altschul等人，J.Mol.Biol.(《分子生物学杂志》)，215:403-410[1990])。用于进行BLAST分析的软件可通过国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information)公开获得。该算法涉及首先通过在查询序列中确定长度为W的短字串来确定高打分序列对(high scoring sequence pair,HSP)，该短字串当与数据库序列中相同长度的字串比对时匹配或满足某取正值的阈值分数T0这些最初的邻近命中字串充当起点来寻找含有它们的更长的HSP。使命中字串沿进行比较的两条序列的每一条朝两个方向扩展至累积比对分数不能增加为止。命中字串的延伸在如下情况会停止:累积比对分数从最大获得值下降达数量X ;累积分数达到零或零以下；或者到达任一序列的末端。BLAST算法参数W、T和X决定该算法的灵敏度和速度。BLAST程序使用如下默认值:字串长度(W)为11、BL0SUM62打分矩阵(参见Henikoff和Henikoff，Proc.Natl.Acad.Sc1. USA(《美国科学院院刊》)，89:10915 [1992])，比对数(B)为 50，期望值(E)为10，M’ 5，N’ -4，以及两条链的比较。
[0062]BLAST算法然后对两条序列之间的相似性进行统计分析(例如参见Karlin和Altschul,出处同上)。BLAST算法提供的一种相似性量度是最小合计概率(smallest sumprobability, P (N))，其指示两条核苷酸或氨基酸序列之间的匹配会偶然发生的概率。例如，如果在测试核酸与丝氨酸蛋白酶核酸的比较中最小合计概率低于约0.1，更优选低于约0.01，最优选低于0.001，则该核酸可视为与本发明的丝氨酸蛋白酶核酸相似。在测试核酸编码丝氨酸蛋白酶多肽的情况中，如果比较得到低于约0.5，更优选低于约0.2的最小合计概率，则其视为与指定的丝氨酸蛋白酶核酸相似。
[0063]在两条或更多条核酸或多肽序列的语境中，“相同”或“同一性”百分数是指，当比较和比对以达到最大相似性时，两条或更多条序列是相同的或分别具有指定百分比的相同核酸残基或氨基酸残基，如使用序列比较算法或通过目测所确定的。主题氨基酸序列与参考(即查询)氨基酸序列的“序列同一性百分数”或“同一性或“序列同一性或“氨基酸序列同一性％ ”意指当将序列进行最佳比对时，在比较长度上主题氨基酸序列与查询氨基酸序列相同(即以氨基酸比氨基酸计)达指定的百分数。因此，就两条氨基酸序列而言，80%氨基酸序列同一性或80%同一性意指两条最佳比对的氨基酸序列中80%氨基酸残基是相同的。[0064]主题核酸序列与参考(即查询)核酸序列的“序列同一性百分数”或“同一性
或“序列同一性％ ”或“核苷酸序列同一性％ ”意指当将序列进行最佳比对时，在比较长度上主题核酸序列与查询序列相同(即以多核苷酸序列的核苷酸比核苷酸计)达指定的百分数。因此，就两条核酸序列而言，80%核苷酸序列同一性或80%同一性意指两条最佳比对的核酸序列中80 %核苷酸残基是相同的。
[0065]在一些实施例中，主题序列与查询序列的“序列同一性百分数”或“序列同一性
或“同一性％ ”可通过将两条序列进行最佳比对并在比较长度上比较两条最佳比对的序列来计算。确定在最佳比对中相同的残基出现在两条序列中的位置数目，从而提供匹配位置的数目，然后将匹配位置的数目除以比较长度(除非另外指明，否则其为查询序列的长度)的位置总数。所得的数目乘以100而得到主题序列与查询序列的序列同一性百分数。
[0066]“最佳比对”或“最佳比对的”指两条(或更多条)序列的给出最高同一性百分比分数的比对。例如，可通过将两条蛋白质序列进行手动比对使得每条序列中最大数目的相同氨基酸残基被一起比对，或通过使用本文描述的或本领域已知的软件程序或方法，来实现所述序列的最佳比对。可通过将两条核酸序列进行手动比对使得每条序列中最大数目的相同核苷酸残基被一起比对，或通过使用本文描述的或本领域已知的软件程序或方法，来实现所述序列的最佳比对。
[0067]在一些实施例中，当用限定的参数，例如限定的氨基酸置换矩阵、空位存在罚分(也称为空位开放罚分)和空位延伸罚分来比对两条多肽序列，以实现该对序列可能的最高相似性分数时，这两条多肽序列被认为是“最佳比对的”。在多肽序列比对算法(如BLASTP)中，BL0SUM62打分矩阵(参见Henikoff和Henikoff，出处同上)通常用作默认的打分置换矩阵。施加空位存在罚分以在被比对的序列之一者中引入单个氨基酸空位，并为该空位中的每一个残基位置施加空位延伸罚分。所采用的示例性比对参数是:BL0SUM62打分矩阵，空位存在罚分=11，空位延伸罚分=I。比对分数由每条序列的该对比开始和结束的氨基酸位置(如比对窗口)，以及任选由一条或两条序列中一个空位或多个空位的插入来限定，以实现可能的最高相似性分数。
[0068]两条或更多条序列之间的最佳比对可通过目测手动来确定，或通过使用计算机，例如但不限于如BLASTP程序(用于氨基酸序列)和BLASTN程序(用于核酸序列)(参见例如 Altschul 等人,Nucleic Acids Res.(《核酸研究》)，25 (17):3389-3402 (1997);还可参见美国国家生物技术信息中心(NCBI)网站)来确定。
[0069]如果所关注的多肽包含与参考多肽的氨基酸序列具有至少约70%、至少约75%、至少约80 %、至少约85 %、至少约90%、至少约91 %、至少约92%、至少约93%、至少约94%、至少约95 %、至少约96 %、至少约97 %、至少约98 %、至少约99 %或至少约99.5 %的序列同一性的氨基酸序列，则可称所关注的多肽与参考多肽“实质上相同”。两条这类多肽之间的同一性百分数可通过观察两条经最佳比对的多肽序列来手动确定，或通过使用软件程序或算法(如BLAST、ALIGN、CLUSTAL)采用标准参数来确定。两个多肽实质上相同的一个指示是第一多肽与第二多肽是免疫交叉反应性的。通常，差别在于保守氨基酸置换的多肽是免疫交叉反应性的。因而，例如在某条多肽与第二多肽仅因保守氨基酸置换或一个或多个保守氨基酸置换而不同的情况中，这两条多肽是实质上相同的。
[0070]如果所关注的核酸包含与参考核酸的核苷酸序列具有至少约70%、至少约75%、至少约80 %、至少约85 %、至少约90%、至少约91 %、至少约92%、至少约93%、至少约94%、至少约95 %、至少约96 %、至少约97 %、至少约98 %、至少约99 %或至少约99.5 %的序列同一性的核苷酸序列，则可称所关注的核酸与参考核酸“实质上相同”。两条这类核酸之间的同一性百分数可通过观察两条经最佳比对的核酸序列来手动确定，或通过使用软件程序或算法(如BLAST、ALIGN、CLUSTAL)采用标准参数来确定。两条核酸序列实质上相同的一个指示是这两条核酸分子在严格条件(例如，在中等严格性至高严格性的范围内)下彼此杂交。
[0071]当核酸或多核苷酸从其他组分(包括但不限于例如其他蛋白质、核酸、细胞等)部分地或完全地分离时，该核酸或多核苷酸是“分离的”。相似地，当多肽、蛋白质或肽从其他组分(包括但不限于例如其他蛋白质、核酸、细胞等)部分地或完全地分离时，该多肽、蛋白质或肽是“分离的”。以摩尔浓度计，在组合物中，分离的物质的丰度比其他物质更高。例如，分离的物质可以占所有存在的大分子物质的至少约50%、约70%、约80%、约85%、约90 %、约 91 %、约 92 %、约 93 %、约 94 %、约 95 %、约 96 %、约 97 %、约 98 %、约 99 % 或约100% (以摩尔浓度计)。优选地，所关注的物质纯化为基本上均质的(即通过常规检测方法在组合物中检测不到污染物)。纯度和均一性可以使用本领域熟知的多种技术测定，例如对蛋白质或核酸样品进行琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳，然后在染色后进行目测观察。如果需要，可采用高分辨率技术，如高效液相色谱法(HPLC)或类似的方法来纯化材料。
[0072]应用于核酸或多肽的术语“纯化的” 一般表示核酸或多肽基本上不合其他组分，如通过本领域熟知的分析技术所测定的(如，纯化的多肽或多核苷酸在电泳凝胶、色谱洗脱物和/或经密度梯度离心的 介质中形成离散的条带)。例如，在电泳凝胶中产生基本上一个条带的核酸或多肽是“纯化的”。纯化的核酸或多肽的纯度为至少约50%，通常纯度为至少约 75%、约 80%、约 85%、约 90%、约 91%、约 92%、约 93%、约 94%、约 95%、约 96%、约97%、约98%、约99%、约99.5%、约99.6%、约99.7%、约99.8%或更大(例如以摩尔浓度计的重量％ )。在相关的意义上，本发明提供对组合物富集一种或多种本发明的分子，例如一种或多种本发明的多肽或多核苷酸的方法。在应用纯化或富集技术后某分子的浓度有实质性增加时，则对组合物富集了该分子。实质上纯的本发明的多肽或多核苷酸(如，分别为实质上纯的本发明变体蛋白酶或编码本发明变体蛋白酶的多核苷酸)通常将占特定组合物中的所有大分子物质重量(以摩尔浓度计)的至少约55%、约60%、约70%、约80%、约85%、约 90%、约 91%、约 92%、约 93%、约 94%、约 95%、约 96%、约 97%、约 98、约 99%、约99.5%或更高。
[0073]在相关的意义上，本发明提供针对一种或多种本发明的分子，例如一种或多种本发明的多肽(如一种或多种本发明的变体蛋白酶)或一种或多种本发明的核酸(如编码一种或多种本发明变体蛋白酶的一种或多种核酸)对组合物进行富集的方法。在应用纯化或富集技术后某分子的浓度有实质性增加时，则对组合物富集了该分子。基本上纯的多肽或多核苷酸通常将占特定组合物中的所有大分子物质重量(以摩尔浓度计)的至少约55%、约 60%、约 70%、约 80%、约 85%、约 90%、约 91%、约 92%、约 93%、约 94%、约 95%、约96%、约97%、约98、约99%、约99.5%或更高。
[0074]本文所用的术语“组合诱变”或“组合”是指产生参考核酸序列的核酸变体的文库的方法。在这些文库中，变体含有选自一组预定突变的一个或数个突变。这类方法还提供了引入随机突变的手段，这些随机突变不是该预定突变组的成员。一些此类方法包括在美国专利N0.6，582，914中示出的那些方法，特此将该专利以引用的方式。一些此类组合诱变方法包括和/或涵盖在市售试剂盒(例如QUIKCHANGE?多定点诱变试剂盒(Stratagene公司)，PCR融合/延伸PCR)中体现的方法。
[0075]如本文所用，结合变体蛋白酶使用的“具有改善的特性’’是指相对于对应的参考蛋白酶(如野生型或天然存在的蛋白酶)，变体蛋白酶具有改善的或增强的洗涤或清洁性能，和/或改善的或增强的稳定性，任选保持了洗涤或清洁性能。变体蛋白酶的改善特性可以包括改善的洗涤或清洁性能和/或改善的稳定性。在一些实施例中，本发明提供表现出如下特性中的一者或多者的本发明变体蛋白酶:相对于参考蛋白酶(如，野生型蛋白酶，例如野生型枯草杆菌蛋白酶)的改善的手动洗涤性能、改善的手动或手工盛具洗涤性能、改善的自动盛具洗涤性能、改善的衣物洗涤性能和/或改善的稳定性。
[0076]如本文所用，术语“功能测定法”指提供蛋白质活性的指示的测定法。在一些实施例中，该术语是指其中针对蛋白质以其惯常的本领发挥作用的能力对该蛋白质进行分析的测定系统。例如，就酶而言，功能测定法涉及测定该酶催化反应的效力。
[0077]如本文所用，术语“靶性质”是指待变更的起始基因的性质。无意于将本发明局限于任何特定的靶性质。然而，在一些实施例中，靶性质是基因产物的稳定性(如，对变性、蛋白水解或其他降解因素的耐受性)，而在其他实施例中，生产宿主的生产水平发生改变。
[0078]如本文所用，在核酸的语境中，术语“性质”或其语法等同形式是指可选择或检测的核酸的任何特性或属性。这些性质包括但不限于影响与多肽的结合的性质、赋予包含特定核酸的细胞的性质、影响基因转录的性质(如，启动子强度、启动子识别、启动子调控、增强子功能)、影响RNA加工的性质(如，RNA剪接、RNA稳定性、RNA构象和转录后修饰)、影响翻译的性质(如mRNA的水平 、调控、与核糖体蛋白的结合、翻译后修饰)。例如，可以改变核酸的转录因子、聚合酶、调节因子等的结合位点以产生所需的特性或鉴别不期望的特性。
[0079]如本文所用，在多肽(包括蛋白质)的语境中，术语“性质”或其语法等同形式是指可选择或检测的多肽的任何特性或属性。这些性质包括但不限于氧化稳定性、底物特异性、催化活性、酶活性、热稳定性、碱稳定性、pH活性分布、对蛋白降解的耐受性、KM、kcat> kcat/kM比率、蛋白质折叠、诱导免疫应答、与配体结合的能力、与受体结合的能力、被分泌的能力、在细胞表面上展示的能力、低聚化的能力、信号传导的能力、刺激细胞增殖的能力、抑制细胞增殖的能力、诱导细胞凋亡的能力、被磷酸化或糖基化作用修饰的能力和/或治疗疾病的能力等。
[0080]如本文所用，术语“筛选”在本领域中具有其通常含义。在一个示例性筛选方法中，提供了突变体核酸或由其编码的变体多肽，并且分别评估或测定突变体核酸或变体多肽的性质。突变体核酸或变体多肽的测定性质可以分别与对应的前体(亲本)核酸的性质或与对应的亲本多肽的性质比较。
[0081]对技术人员而言将显而易见的是，获得具有改变的性质的核酸或蛋白质的筛选方法取决于原料性质，突变体核酸的产生旨在促进原料性质的变更。因此，技术人员将认识到，本发明不限于要筛选的任何具体性质，并且如下性质描述仅列出了示例性的例子。筛选任何特定性质的方法通常在本领域中有所描述。例如，可在突变之前和之后测量结合性、pH、特异性等，其中变化表明发生了变更。优选地，筛选以高通量方式进行，包括同时筛选多个样品，包括但不限于利用芯片、噬菌体展示和多底物和/或指示剂的测定法。
[0082]如本文所用，在一些实施例中，筛选方法包括一个或多个选择步骤，在这些步骤中将所关注的变体从一群变体中富集。这些实施例的例子包括对赋予宿主生物生长优势的变体的选择，以及噬菌体展示或任何其他展示方法，其中可根据变体的结合或催化性质从一群变体捕集该变体。在一些实施例中，将变体文库暴露于胁迫(如热、变性等)，随后对仍然完整的变体在筛选中进行鉴定或通过选择进行富集。该术语旨在涵盖任何合适的选择方式。实际上，无意于将本发明局限于任何特定的筛选方法。
[0083]术语“经修饰的核酸序列”和“经修饰的基因”在本文中可互换使用，是指天然存在的(即野生型)核酸序列的包含缺失、插入或中断的核酸序列。在一些实施例中，经修饰的核酸序列的表达产物是截短的蛋白质(例如，如果修饰为序列的缺失或中断的话)。在一些实施例中，截短的蛋白质保留生物活性。在备选的实施例中，经修饰的核酸序列的表达产物是延长的蛋白质(例如，修饰包括核酸序列中的插入)。在一些实施例中，核苷酸插入核酸序列会导致截短的蛋白质(例如，当插入导致形成终止密码子时)。因此，插入可以导致截短的蛋白质或延长的蛋白质表达产物。
[0084]“突变体”核酸序列通常指这样的核酸序列，其在宿主细胞的野生型序列中存在的至少一个密码子中具有变更，使得该突变型核酸序列的表达产物是相对于野生型蛋白质而言具有变更的氨基酸序列的蛋白质。表达产物可具有变更的功能能力(例如增强的酶活性)。
[0085]如本文所用，短语“底物特异性的变更”是指酶的底物特异性的变化。在一些实施例中，底物特异性的变化定义为由于酶的突变或反应条件的改变而导致的特定底物的kMt和/或Km的变化。通过比较酶表现出的对不同底物的催化效率，来确定酶的底物特异性。这些测定尤其可用于评估突变酶的效率，因为通常期望产生的变体酶对所关注的底物表现出更大kMt/Km比率。然而，无意于将本发明局限于任何特定的底物组合物或底物特异性。
[0086]如本文所用，“表 面性质”用于指静电荷，以及蛋白质表面所展现的诸如疏水性和亲水性之类的性质。
[0087]本文所用的术语“净电荷”定义为分子中存在的所有电荷的总和。可对亲本蛋白质分子作出“净电荷改变”，以提供具有与该亲本分子的净电荷不同的净电荷的变体(即该变体具有的净电荷与亲本分子的净电荷不相同)。例如，用带负电的氨基酸置换中性氨基酸或用中性氨基酸置换带正电的氨基酸，会导致相对于亲本分子而言净电荷为-1。用带负电的氨基酸置换带正电的氨基酸，会导致相对于亲本而言净电荷为_2。用带正电的氨基酸置换中性氨基酸或用中性氨基酸置换带负电的氨基酸，会导致相对于亲本而言净电荷为+1。用带正电的氨基酸置换带负电的氨基酸，会导致相对于亲本而言净电荷为+2。亲本蛋白质的净电荷还可通过缺失和/或插入带电的氨基酸来变更。
[0088]术语“热稳定的”和“热稳定”和“热稳定性”是指蛋白酶在本发明的蛋白水解、水解、清洁或其他处理期间的主要条件下(同时暴露于改变的温度)，暴露于指定的温度达给定时间段后仍保持指定量的酶活性。“改变的温度”涵盖增加的或降低的温度。在一些实施例中，蛋白酶在暴露于改变的温度指定时间段(例如至少约60分钟、约120分钟、约180分钟、约240分钟、约300分钟等)后保持至少约50 %、约60 %、约70 %、约75 %、约80 %、约85%、约90%、约92%、约95%、约96%、约97%、约98%或约99%的蛋白水解活性。[0089]在氧化、螯合剂、热和/或pH稳定蛋白酶的语境中，术语“增强的稳定性”是指与其他蛋白酶(例如枯草杆菌蛋白酶)和/或野生型酶相比，随时间推移保留较高的蛋白水解活性。
[0090]在氧化、螯合剂、热和/或pH稳定蛋白酶的语境中，术语“降低的稳定性”是指与其他蛋白酶(例如枯草杆菌蛋白酶)和/或野生型酶相比，随时间推移保留较低的蛋白水解活性。
[0091]术语“清洁活性”是指在本发明的蛋白水解、水解、清洁或其他过程期间的主要条件下，变体蛋白酶或参考蛋白酶实现的清洁性能。在一些实施例中，变体蛋白酶或参考蛋白酶的清洁性能可以使用用于清洁物品或表面上的一种或多种不同的酶敏感性污溃(例如来自食物、草、血、墨、奶、油和/或卵蛋白的污溃)的各种测定法来测定。变体或参考蛋白酶的清洁性能可通过使物品或表面上的污溃经受标准洗涤条件，并且使用各种色谱方法、分光光度方法或其他定量方法评估污溃被移除的程度来测定。示例性的清洁测定法和方法是本领域已知的，包括但不限于W099/34011和美国专利6，605, 458 (这二个专利均以引用方式并入本文)中描述的那些方法以及下文提供的实例中包括的那些清洁测定法和方法。
[0092]术语变体蛋白酶或参考蛋白酶的“清洁有效量”是指在特定清洁组合物中实现所需水平的酶活性的蛋白酶的量。这种有效量可由本领域一般技术人员容易地确定并且基于多种因素，如所用的特定蛋白酶、清洁应用、清洁组合物的具体组成，以及是需要液体组合物还是干燥(例如颗粒状、片状、条棒状)组合物等等。
[0093]术语“清洁辅助材料”是指清洁组合物中包含的除本发明变体蛋白酶之外的任何液体、固体或气体材料。在一些实施例中，本发明的清洁组合物包括一种或多种清洁辅助材料。每种清洁辅助材 料通常根据清洁组合物的具体类型和形式(例如液体、颗粒、粉末、条棒、糊、喷雾、片剂、凝胶、泡沫或其他组合物)来选择。优选地，每种清洁辅助材料与组合物中所用的蛋白酶相容。
[0094]在清洁活性的语境中术语“增强的性能”是指酶对某些酶敏感性污溃如蛋、奶、草、墨、油和/或血的增加的或更高的清洁活性，这种活性是在标准的洗涤循环和/或多个洗涤循环后通过常用的评价法来测定的。
[0095]在清洁活性的语境中术语“减低的性能”是指酶对某些酶敏感性污溃如蛋、奶、草或血的降低的或较小的清洁活性，这种活性是在标准的洗涤循环后通过常用的评价法来测定的。
[0096]在本发明变体蛋白酶的清洁活性语境中，术语“相当的性能”是指至少约60%、至少约70 %、至少约75 %、至少约80%、至少约85%、至少约90%、至少约91 %、至少约92 %、至少约93 %、至少约94%、至少约95 %、至少约96 %、至少约97 %、至少约98%、至少约99%、至少约99.5%的比较或参考蛋白酶(如市售蛋白酶)的清洁活性，所述比较或参考蛋白酶包括但不限于0PTIMASE?蛋白酶(杰能科公司)、I3URAFECTtm蛋白酶产品(杰能科公司)、SAVINASE?蛋白酶(诺维信公司)、BPN’ -变体(参见例如美国专利 N0.Re34, 606)、RELASE?、DURAZYME?、EVERLASE?、KANNASE? 蛋白酶(诺维信公司)、MAXACAL?、MAXAPEM?、PROPERASE?蛋白酶(杰能科公司；还可参见美国专利N0.Re34, 606和美国专利 N0.5，700，676、N0.5，955，340、N0.6，312，936 以及 N0.6，482，628)和迟缓芽孢杆菌变体蛋白酶产品(例如W092/21760、W095/23221和/或W097/07770中描述的那些)。可如下测定清洁性能:在涉及酶敏感性污溃(例如草、血、墨、油和/或奶)的各种清洁测定法中，将本发明变体蛋白酶与参考枯草杆菌蛋白酶进行比较，如在标准洗涤循环条件后通过常用的分光光度测定或分析法来测定。
[0097]本文所用的术语“消费品”意指织物和家庭护理产品。如本文所以，术语“织物和家庭护理产品”或“织物和家居护理产品”包括通常旨在以它们所销售的形式使用或消费的且用以处理织物、硬质表面和任何其他表面的产品；和用于无生命表面的护理和清洁的清洁系统整体；以及织物调理剂产品和特定设计用于织物的护理和维护的其他产品；和空气护理产品，包括:空气护理(包括空气清新剂和香味递送系统)；汽车护理产品、宠物护理产品、家畜护理产品、个人护理产品、珠宝护理产品；盛具洗涤产品、织物调理产品(包括软化和/或鲜化)、衣物洗涤产品、洗衣和漂洗添加剂和/或护理产品、预处理清洁组合物、硬质表面清洁和/或处理产品(包括地板和抽水马桶清洁剂、玻璃清洁剂和/或处理剂、瓷砖清洁剂和/或处理剂、陶瓷清洁剂和/或处理剂)以及用于消费者或公共场所使用的其他清洁产品。在一些实施例中，织物和家庭护理产品适用于伤口和/或皮肤。“织物和家庭护理产品”包括消费者和公共场所用产品。
[0098]本文所用的术语“非织物和家庭护理产品”是指这样的组合物，其被添加至其他组合物中以产生可以为织物和家庭护理产品的最终产品。
[0099]如本文所用，术语“公共场所用清洁组合物”是指适用于公共场所(包括但不限于学校、医院、工厂、商场、公司、建筑物、餐馆、办公楼和商厦、加工和/或制造车间、兽医院、工厂化农场、工厂化牧场等)的产品。
[0100]本文所用的术语“清洁和/或处理组合物”是指织物和家庭护理产品的这样的子集，除非另外指明，该子 集包括适用于清洁和/或处理物品的组合物。这类产品包括(但不限于)用于处理织物、硬质表面及织物和家庭护理领域中的任何其他表面的产品，包括:空气护理产品(包括空气清新剂和香味递送系统)；汽车护理产品、盛具洗涤产品；织物调理产品(包括软化和/或鲜化)；衣物洗涤产品、洗衣和漂洗添加剂和/或护理产品、硬质表面清洁和/或处理产品(包括地板和抽水马桶清洁剂)；颗粒或粉末形式的多功能型或“重垢型”洗涤剂，尤其是清洁洗涤剂；液体、凝胶或糊形式的多功能型洗涤剂，尤其是所谓的重垢液体型；液体精细织物洗涤剂；手动盛具洗涤剂或轻垢型盛具洗涤剂，尤其是高泡类型的那些；机洗用盛具洗涤剂，包括家居和公共场所使用的各种片剂型、颗粒型、液体型和漂洗助剂型:汽车或地毯清洗剂、浴室清洁剂(包括抽水马桶清洁剂)；以及清洁辅剂，例如漂白添加剂和“去污棒”或预处理类型、底物装载型产品(substrate-laden)如加干燥剂的片材。
[0101 ] 实际上，如本文所用，本发明的“清洁组合物”或“清洁制剂”是指可用于从待清洁的物体、物品或表面移除或除去化合物(如不需要的化合物)的任何本发明组合物，所述待清洁的物体、物品或表面包括但不限于，例如织物、织物物品、盛具物品、餐具物品、玻璃器具物品、接触镜、其他固体基材、毛发(洗发剂)(包括人或动物毛发)、皮肤(肥皂或/和霜剂)、牙齿(漱口水、牙膏)、物品或物体的表面(如硬质表面，例如桌子、桌面、墙壁、家具物品、地板、天花板、非盘碟物品、非盛具物品等的硬质表面)、过滤器、膜(如过滤膜，包括但不限于超滤膜)等。该术语涵盖为所需清洁组合物的特定类型和产品的形式(如液体、凝胶、颗粒、喷雾或其他组合物)选择的任何材料和/或添加的化合物，只要该组合物与用于组合物的蛋白酶和其他酶相容即可。易于通过考虑待清洁的表面、物体、物品或织物以及针对在使用期间清洁条件所需的组合物形式来具体选择清洁组合物材料。
[0102]清洁组合物和清洁制剂包括适于对任何物体、物品和/或表面进行清洁、漂白、消毒和/或灭菌的任何组合物。这种组合物和制剂包括但不限于例如:液体和/或固体组合物，包括清洁或洗涤剂组合物(例如液体、片状、凝胶、条棒状、颗粒和/或固体衣物清洁组合物或洗涤剂组合物以及精细织物洗涤剂组合物；硬质表面清洁组合物和制剂，如用于玻璃、木材、陶瓷和金属台面和窗；地毯清洁剂；烘箱清洁剂；织物清新剂；织物软化剂；以及纺织物、衣物助洗剂清洁组合物或洗涤剂组合物、洗衣添加剂清洁组合物和衣物预洗剂清洁组合物；盛具洗涤组合物，包括手动或手工盛具洗涤组合物(如“手动”或“手工”盛具洗涤剂)和自动盛具洗涤用组合物(如“自动盛具洗涤用洗涤剂”)。
[0103]除非另外指明，否则如本文所用，清洁组合物或清洁制剂包括颗粒状或粉末形式的多功能型洗涤剂或重垢型洗涤剂，尤其是清洁洗涤剂；液体、颗粒、凝胶、固体、片或糊形式的多功能型洗涤剂，尤其是所谓的重垢液体(HDL)洗涤剂或重垢粉末洗涤剂(HDD)类型；液体精细织物洗涤剂；手动或手工盛具洗涤剂，包括高泡类型的那些；手动或手工盛具洗涤剂、自动盛具洗涤用洗涤剂或盛具或餐具洗涤剂，包括家居和公共场所使用的各种片、粉末、固体、颗粒、液体、凝胶和漂洗助剂类型；液体清洁和消毒剂，包括抗菌手洗类型、清洁条棒、漱口水、假牙清洁剂、汽车清洗剂、地毯清洗剂、浴室清洁剂；人和其他动物的洗发剂和/或毛发清洗剂；沐浴凝胶和泡沫浴和金属洗涤剂；以及清洁辅剂，例如漂白添加剂和“去污棒”或预处理类型。在一些实施例中，颗粒状组合物为“紧凑”形式；在一些实施例中，液体组合物为“浓缩”形式。
[0104]如本文所用，“织物清洁组合物”包括手洗和机洗衣物洗涤剂组合物，包括洗衣添加剂组合物和适用于染污织物(如衣物、亚麻布和其他纺织材料)的浸洗和/或预处理的组合物在内。
[0105]如本文所用，“非织物清洁组合物”包括非纺织物(即非织物)表面清洁组合物，包括但不限于例如手动或人工或自动盛具洗涤剂组合物、口腔清洁组合物、假牙清洁组合物和个人清洁组合物。
[0106]如本文所以，术语“织物和/或硬质表面清洁和/或处理组合物”是清洁和处理组合物的这样的子集，除非另外指明，该子集包括颗粒或粉末形式的多用途型或“重垢型”洗涤剂，尤其是清洁洗涤剂；液体、凝胶或糊形式的多功能型洗涤剂，尤其是所谓的重垢液体型；液体精细织物洗涤剂；手动盛具洗涤剂或轻垢型盛具洗涤剂，尤其是高泡类型的那些；机洗用盛具洗涤剂，包括家居和公共场所使用的各种片剂型、颗粒型、液体型和漂洗助剂型；液体清洁和消毒剂，汽车或地毯清洗剂、浴室清洁剂(包括抽水马桶清洁剂)；织物调理产品，包括可以液体、固体和/或干衣纸形式使用的软化产品和/或鲜化产品；以及清洁辅剂，例如漂白添加剂和“去污棒”或预处理类型、底物装载型产品如加干燥剂的片材。所有此类适用的产品可以是标准、浓缩或甚至高浓缩形式，甚至浓缩到使此类产品在某些方面为非水性的程度。 [0107]如本文所用，术语“洗涤剂组合物”或“洗涤剂制剂”用于指旨在用于洗涤介质中用来清洁染污的或脏的物体(包括特定的织物和/或非织物物体或物品)的组合物。本发明的这类组合物不限于任何特定的洗涤剂组合物或制剂。实际上，在一些实施例中，本发明的洗涤剂包含至少一种本发明的变体蛋白酶，此外还包含一种或多种表面活性剂、转移酶、水解酶、氧化还原酶、助洗剂(例如助洗剂盐)、漂白剂、漂白活化剂、上蓝剂、荧光染料、结块抑制剂、掩蔽剂、酶激活剂、抗氧化剂和/或增溶剂。在某些情况下，助洗剂盐为硅酸盐和磷酸盐的混合物，优选硅酸盐(如偏硅酸钠)比磷酸盐(如三聚磷酸钠)多。一些本发明的组合物(例如但不限于清洁组合物或洗涤剂组合物)不含有任何磷酸盐(如磷酸盐或磷酸盐助洗剂)。
[0108]如本文所用，术语“漂白”是指以足够的时长和/或在合适的pH和/或温度条件下处理材料(如织物、衣物、纸浆等)或表面以实现该材料的增亮(增白)和/或清洁。适用于漂白的化学品的例子包括但不限于例如C102、H202、过酸、NO2等。
[0109]如本文所用，蛋白酶(如本发明的变体蛋白酶)的“洗涤性能”是指变体蛋白酶对洗涤的贡献，与未向组合物中添加该变体蛋白酶的洗涤剂相比其为洗涤剂提供额外的清洁性能。洗涤性能是在相关的洗涤条件下进行比较。在一些测试系统中，其他相关因素(如洗涤剂组成、泡沫浓度、水硬度、洗涤力学、时间、PH和/或温度)可以以使得某些细分市场中的家居应用(手动或手用盛具洗涤、自动盛具洗涤、盛具清洁、餐具清洁、织物清洁等)的典型条件得以模拟的方式进行控制。
[0110]术语“相关洗涤条件”在本文中用于指在手动盛具洗涤、自动盛具洗涤或衣物洗涤剂细分市场中在家庭中实际上使用的条件，特别是洗涤温度、时间、洗涤力学、泡沫浓度、洗涤剂类型和水硬度。
[0111]术语“改善的洗涤性能”用于指在相关洗涤条件下在去污方面获得更好的最终结果，或以重量计，相对于相应的野生型或起始亲本蛋白酶，需要较少的变体蛋白酶来获得相同的最终结果。
[0112]如本文所用，术语“消毒”是指从表面除去污染物，以及抑制或杀死物品表面上的微生物。无意于将本发明受限于任何特定表面、物品或待移除的污染物或微生物。
[0113]本文的清洁组合物的“紧凑”形式最好由密度反映，就组成来说，由无机填料盐的量反映。无机填料盐是呈粉末形式的洗涤剂组合物的常规成分。在常规洗涤剂组合物中，填料盐是大量存在，通常占总组合物的约17重量％至约35重量％。相比之下，在紧凑型组合物中，填料盐以不超过总组合物的约15 %的量存在。在一些实施例中，填料盐以不超过所述组合物的约10重量％，或更优选不超过约5重量％的量存在。在一些实施例中，无机填料盐选自碱金属和碱土金属硫酸盐和氯化物。在一些实施例中，填料盐为硫酸钠。
[0114]在本文中，给定氨基酸序列中的氨基酸残基的位置通常利用SEQ ID NO:1中所示解淀粉芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶BPN’氨基酸序列的对应氨基酸残基的位置的编号方式进行编号。SEQ ID NO:1的解淀粉芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶BPN’氨基酸序列因而充当参考序列。可利用本文所述的比对算法将给定氨基酸序列(例如本文描述的变体蛋白酶氨基酸序列)与BPN’序列(SEQ ID NO: I)比对，该给定氨基酸序列中与BPN’序列中的氨基酸残基比对(优选最佳比对)的氨基酸残基可通过参考该枯草杆菌蛋白酶BPN’序列中的对应氨基酸残基便利地进行编号。或者，如果枯草杆菌蛋白酶变体蛋白酶序列的氨基酸残基位置利用GG36氨基酸序列(SEQ ID NO:2)中的氨基酸残基位置的实际编号方式进行编号，并且在比对时不参考BPN’序列中的对应氨基酸位置，则枯草杆菌蛋白酶变体蛋白酶可描述为SEQ ID N0:2所示的GG36蛋白酶的变体蛋白酶。[0115]—般来讲，本文所用的命名以及下文描述的细胞培养、分子遗传学、分子生物学、核酸化学和蛋白质化学中的实验室方法中的许多方法是众所周知的，并常常为本领域一般技术人员所采用。重组核酸的产生和操纵的方法、核酸合成的方法、细胞培养方法以及转基因掺入(如转染、电穿孔)是本领域技术人员已知的并在许多标准文献中有描述。寡核苷酸合成和纯化步骤通常根据说明书来进行。技术和程序通常根据本领域众所周知的常规方法以及本文通篇中提供的各种一般文献来进行。本文的程序据信是本领域普通技术人员所熟知的，并为了阅读者的便利而提供。
[0116]本发明的多肽
[0117]本发明提供新型多肽，它们可统称为“本发明的多肽”。本发明的多肽包括分离的、重组的、实质上纯的或非天然存在的变体蛋白酶多肽，包括例如具有酶活性(如蛋白水解活性)的枯草杆菌蛋白酶变体多肽。在一些实施例中，本发明的多肽(例如枯草杆菌蛋白酶变体或具有SEQ ID NO:2的序列的GG36的变体)，与亲本如具有SEQ ID NO:2的序列的GG36蛋白酶相比，具有改善的清洁性能。在一些实施例中，本发明的多肽可用于清洁应用，并且可掺入可在清洁需要进行清洁的物品或表面(如物品的表面)的方法中使用的清洁组合物中。
[0118]在一些实施例中，本发明的变体蛋白酶包括“变体枯草杆菌蛋白酶”。在一些实施例中，本发明提供“芽孢杆菌变体蛋白酶”。在一些实施例中，本发明提供“芽孢杆菌变体枯草杆菌蛋白酶”。在一些实施例中，本发明提供分离的枯草杆菌蛋白酶变体。在一些实施例中，本发明提供迟缓芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶GG36蛋白酶的分离的枯草杆菌蛋白酶变体，其中所述迟缓芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶GG36蛋白酶包含SEQ ID NO:2中所示的氨基酸序列。
[0119]在上述实施例任一者中，本发明包括分离的、重组的、基本上纯的或非天然存在的具有蛋白水解活性的变体蛋白酶，该多肽包含的多肽序列与编码本文提供的变体蛋白酶的氨基酸序列具有至少约80%、至少约85%、至少约86%、至少约87%、至少约88%、至少约89%、至少约90%、至少约91 %、至少约92%、至少约93%、至少约94%、至少约95%、至少约96%、至少约97%、至少约98%、至少约99%、至少约99.5%或100%的序列同一性。
[0120]如上所述，本发明的变体蛋白酶多肽具有酶活性(如蛋白水解活性)并因而可用于清洁应用，包括但不限于用于清洁盘碟物品、餐具物品、织物和具有硬质表面的物品(如桌子、桌面、墙壁、家具物品、地板、天花板等的硬质表面)的方法。包含一种或多种本发明的变体蛋白酶多肽的示例性清洁组合物在下文中进行描述。本发明的变体蛋白酶多肽的酶活性(如蛋白酶活性)可使用本领域普通技术人员熟知的程序容易地测定。下文提供的实例描述了用于评价酶活性、清洁性能和/或洗涤性能的方法。本发明的变体蛋白酶在移除污溃(例如蛋白质性污溃)、清洁硬质表面或清洁衣物、盛具或餐具物品方面的性能可用本领域所熟知的程序和/或通过使用实例部分中示出的程序容易地测定。
[0121]可对本发明的多肽进行多种改变，如一个或多个氨基酸的插入、缺失和/或置换(保守的或非保守的置换)，包括其中这类改变不会实质上改变该多肽的酶活性的情况。类似地，也可对本发明的核酸进行多种改变，如在一个或多个密码子中对一个或多个核酸进行一个或多个置换使得特定的密码子编码相同或不同的氨基酸，从而导致沉默变异(如，核苷酸序列中的突变可导致氨基酸序列中的沉默突变，例如当所编码的氨基酸未因该核酸突变而变更时)或非沉默变异；序列中一个或多个核酸(或密码子)的一种或多种缺失；序列中一个或多个核酸(密码子)的一种或多种添加或插入；和/或序列中一个或多个核酸(密码子)的切除或序列中一个或多个核酸(密码子)的一种或多种截短。与初始核酸序列编码的变体蛋白酶相比，核酸序列中的许多此类改变可能不会实质上改变所得的编码的变体蛋白酶的酶活性。还可对本发明的核酸进行修饰以包括一个或多个使得能在表达系统(如细菌表达系统)中进行最优表达的密码子，同时如果需要，所述一个或多个密码子仍编码相同氨基酸。
[0122]在一些实施例中，本发明提供这样一类多肽，其包括具有所需酶活性(如蛋白酶活性或清洁性能活性)的变体蛋白酶多肽，所述变体蛋白酶多肽包含具有本文所述的氨基酸置换的序列并且还包含一个或多个另外的氨基酸置换，例如保守和非保守置换，其中多肽表现出、维持或大致维持所需的酶活性(如蛋白酶活性或枯草杆菌蛋白酶活性，如该变体蛋白酶的清洁活性或性能所反映的)。根据本发明的氨基酸置换可包括但不限于一个或多个非保守置换和/或一个或多个保守氨基酸置换。保守氨基酸残基置换通常涉及将一功能类别的氨基酸残基中的成员替换为属于同一功能类别的残基(在计算功能同源性百分数时相同氨基酸残基被视为在功能上是同源的或保守的)。保守氨基酸置换通常涉及用功能相似的氨基酸置换氨基酸序列中的氨基酸。例如，丙氨酸、甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸是功能相似的，因而可充当彼此的保守氨基酸置换。天冬氨酸和谷氨酸可充当彼此的保守置换。天冬酰胺和谷氨酰胺可充当彼此的保守置换。精氨酸、赖氨酸和组氨酸可充当彼此的保守置换。异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸和缬氨酸可充当彼此的保守置换。苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸可充当彼此的保守置换。
[0123]可以设想其他的保守氨基酸置换组。例如，可通过相似的功能或化学结构或组成对氨基酸进行分组(如酸性、碱性、脂族、芳族、含硫)。例如，脂族组可包括:甘氨酸(G)、丙氨酸(A)、缬氨酸(V)、亮氨酸(L)、异亮氨酸(I)。含有可视为彼此保守置换的氨基酸的其他组包括:芳族组:苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W);含硫组:甲硫氨酸(M)、半胱氨酸(C);碱性组:精氨酸(R)、赖氨酸(K)、组氨酸(H);酸性组:天冬氨酸(D)、谷氨酸(E);非极性不带电荷的残基的组:半胱氨酸(C)、甲硫氨酸(M)和脯氨酸(P);亲水性不带电荷的残基的组:丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、天冬酰胺(N)和谷氨酰胺(Q)。另外的氨基酸分组是本领域技术人员所熟知的并在各种标准教科书中有描述。本文的多肽序列的列表，结合上文的置换组，提供了所有经保守置换的多肽序列的明确列表。
[0124]在上文描述的氨基酸残基类别中存在更保守的置换，其也可以是合适的或者其作为另一种选择可以是合适的。用于更保守的置换的保守组包括:缬氨酸-亮氨酸-异亮氨酸、苯丙氨酸-酪氨酸、赖氨酸-精氨酸、丙氨酸-缬氨酸以及天冬酰胺-谷氨酰胺。因此，例如在一些实施例中，本发明提供具有蛋白水解活性的分离或重组的变体蛋白酶多肽(如变体枯草杆菌蛋白酶)，所述变体蛋白酶多肽包含与SEQ ID NO:2的氨基酸序列具有至少约90 %、约95 %、约96 %、约97 %、约98 %、约99 %或约99.5 %序列同一性的氨基酸序列。本发明的变体蛋白酶中一个氨基酸保守置换另一个氨基酸预计不会显著改变该变体蛋白酶的酶活性或清洁性能活性。所得的蛋白酶的酶活性或清洁性能活性可容易地用标准测定法和本文所述的测定法进行测定。
[0125]本发明的多肽序列 (例如本发明的变体蛋白酶)的保守置换变异包括用同一保守置换组的保守选择的氨基酸来置换该多肽序列的少部分的，有时低于约25%、约20%、约15%、约14%、约13%、约12%、约11%、约10%、约9%、约8%、约7%或约6%的氨基酸，或该多肽序列的低于约5%、约4%、约3%、约2%或约I %的氨基酸。
[0126]如本文其他地方更详细描述的以及本文提供的实例中描述的，本发明的多肽可具有可与已知蛋白酶(包括已知枯草杆菌蛋白酶)相当的清洁能力。示例性的已知枯草杆菌蛋白酶包括但不限于例如迟缓芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶GG36、解淀粉芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶BPN’、解淀粉芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶BPN’ -Y217L和克劳氏芽孢杆菌PB92。成熟迟缓芽抱杆菌枯草杆菌蛋白酶GG36蛋白的氣基酸序列为:
[0127]AQSVPffGISRVQAPAAHNRGLTGSGVKVAVLDTGISTHPDLNIRGGASFVPGEPSTQDGNGHGTHVAGTIAALNNSIGVLGVAPSAELYAVKVLGASGSGSVS SIAQGLEWAGNNGMHVANLSLGSPSPSATLEQAVNSATSRGVLVVAASGNSGAGSISYPARYANAMAVGATDQNNNRASFSQYGAGLDIVAPGVNVQSTYPGSTYASLNGTSMATPHVAGAAALVKQKNPSWSNVQIRNHLKNTATSLGSTNLYGSGLVNAEAATR(SEQ ID NO:2)
[0128]成熟解淀粉芽抱杆菌枯草杆菌蛋白酶BPN’蛋白的氣基酸序列为:
[0129]AQSVPYGVSQIKAPALHSQGYTGSNVKVAVIDSGIDSSHPDLKVAGGASMVPSETNPFQDNNSHGTHVAGTVAALNNSIGVLGVAPSASLYAVKVLGADGSGQYSWIINGIEWAIANNMDVINMSLGGPSGSAALKAAVDKAVASGVVVVAAAGNEGTSGSSSTVGYPGKYPSVIAVGAVDSSNQRASFSSVGPELDVMAPGVSIQSTLPGNKYGAYNGTSMASPHVAGAAALILSKHPNWTNTQVRSSLENTTTKLGDSFYYGKGLINVQAAAQ(SEQ ID NO:1)
[0130]本发明提供分离 的枯草杆菌蛋白酶变体，其中所述枯草杆菌蛋白酶变体为具有蛋白水解活性的成熟形式并且具有包含氨基酸置换的组合的氨基酸序列，所述氨基酸置换处于选自如下的位置:T022R+V104I+Q245R、G020R+S024R+S101A、T022R+S103A+V1041、T022R+V104I+A232V, T022R+S103A+Q245R、T022R+A232V+Q245R、T022R+S103A+A232V,T022R+S103A+V104I+A232V、T022R+V104I+A232V+Q245R, T022R+S103A+V104I+Q245R,T022R+S103A+A232V+Q245R、T022R+S103A+V104I+A232V+Q245R、T022A+N076D+S103A+V104I+A232V+Q245R、T022A+N076D+S103A+V104I+A232V, T022A+N076D+V104I+A232V+Q245R,T0 2 2A + N0 7 6D + S10 3A + A2 3 2V + Q245R、TO 22Α + Ν076D + SI O 3A + VI O4 I+ Q245R、T022A+N076D+V104I+Q245R, T022A+N076D+A232V+Q245R, T022A+N076D+V104I+A232V,T022A+N076D+S103A+Q245R, T022A+N076D+S103A+A232V, T022A+N076D+S103A+V1041、T022A+N076D+S103A、T022A+N076D+V104I, T022A+N076D+A232V, T022A+N076D+Q245R,G020R+S101A+T213A、G020R+R045T+S101A、G020R+S101A+G21 IQ、S024R+S101A+T213A、G020R+T022W+S101A、S024R+S101A+G21 IQ、N043R+S101A+T213A、N043R+R045T+S101A、S024R+N043R+S101A、S024R+R045T+S101A、S101A+G211Q+T213A、G020R+N043R+S101A、R045T+S101A+T213A、T022W+S024R+S101A、T022R+S101G+V1041、T022W+S101A+T213A、T022R + S101G + Q245R、T0 2 2W + S101A + G2I IQ, GO 2 O R + S O 24R + Q245R,T022R + S101G + V104I+Q245R、TO22R + SI O IG + A232V、TO22R + SI O IG + SI O 3A、T022R+S101G+S103A+V1041、T022R+S101G+S103A+Q245R、T022R+S101G+A232V+Q245R、T022R+S101G+V104I+A232V、G020R+S024R+S101A+T213A, G020R+S024R+T213AS101N+V104I+A232V、 S101N+S103A+V1041、 S101N+S103A+A232V、 S101N+S103A+V104I+A232V,G020R + S103A + A232V、GO2OR + VI O4 I+A232V、GO2OR + SI O3A + VI O4 I+A232V、G020R+S103A+V1041、N018R+N076D+N116A、N018R+N076D+T213A、N018R+N076D+S101A、N018R+N076D+A215F或N018R+N076D+G211Q(列表1)，并且其中所述枯草杆菌蛋白酶变体的氨基酸位置是根据SEQ ID NO:1中所示解淀粉芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶BPN’的氨基酸序列中的对应氨基酸位置的编号方式进行编号。
[0131]本发明还提供分离的枯草杆菌蛋白酶变体，其中所述枯草杆菌蛋白酶变体为具有蛋白水解活性的成熟形式并且具有包含氨基酸置换的组合的氨基酸序列，所述氨基酸置换处于位置T022A+N076D+S103A+V104I+A232V+Q245R(列表2)，并且其中所述枯草杆菌蛋白酶变体的氨基酸位置是根据SEQ ID NO:1中所示解淀粉芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶BPN’的氨基酸序列中的对应氨基酸位置的编号方式进行编号。
[0132]本发明还提供分离的枯草杆菌蛋白酶变体，其中所述枯草杆菌蛋白酶变体为具有蛋白水解活性的成熟形式并且具有包含氨基酸置换的组合的氨基酸序列，所述氨基酸置换处于选自如下的位置:T022R+S103A+V104I+A232V+Q245R、T022A + N076D + S103A + V104I+A232V、TO22Α + Ν076D + VI O4 I+A232V + Q245R、T022A+N076D+S103A+A232V+Q245R 或 T022A+N076D+S103A+V104I+Q245R(列表 3)，并且其中所述枯草杆菌蛋白酶变体的氨基酸位置是根据SEQ ID NO:1中所示解淀粉芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶BPN’的氨基酸序列中的对应氨基酸位置的编号方式进行编号。
[0133]本发明还提供分离的枯草杆菌蛋白酶变体，其中所述枯草杆菌蛋白酶变体为具有蛋白水解活性的成熟形式并且具有包含氨基酸置换的组合的氨基酸序列，所述氨基酸置换处于选自如下的位置:T022R+S103A+V104I+A232V、T022R+V104I+A232V+Q245R、T022R+S103A+V104I+Q245R、T022R+S103A+A232V+Q245R、T022A+N076D+V104I+Q245R,T022A+N076D+A232V+Q245R、T022A+N076D+V104I+A232V, T022A+N076D+S103A+Q245R,T022A+N076D+S103A+A232V、 T022A+N076D+S103A+V1041、 T022R+S101G+V104I+Q245R、T022R+S101G+S103 A+V1041、T022R+S101G+S103A+Q245R、T022R+S101G+A232V+Q245R、T022R+S101G+V104I+A232V、G020R+S024R+S101A+T213A、S101N+S103A+V104I+A232V 或G020R+S103A+V104I+A232V(列表4)，并且其中所述枯草杆菌蛋白酶变体的氨基酸位置是根据SEQ ID NO:1中所示解淀粉芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶BPN’的氨基酸序列中的对应氨基酸位置的编号方式进行编号。
[0134]本发明还提供分离的枯草杆菌蛋白酶变体，其中所述枯草杆菌蛋白酶变体为具有蛋白水解活性的成熟形式并且具有包含氨基酸置换的组合的氨基酸序列，所述氨基酸置换处于选自如下的位置:T022R+V104I+Q245R、G020R+S024R+S101A、T022R+S103A+V1041、T022R+V104I+A232V, T022R+S103A+Q245R、T022R+A232V+Q245R、T022R+S103A+A232V,T022A+N076D+S103A、T022A+N076D+V104I, T022A+N076D+A232V, T022A+N076D+Q245R,G020R+S101A+T213A、G020R+R045T+S101A、G020R+S101A+G21 IQ、S024R+S101A+T213A、G020R+T022W+S101A、S024R+S101A+G21 IQ、N043R+S101A+T213A、N043R+R045T+S101A、S024R+N043R+S101A、S024R+R045T+S101A、S101A+G211Q+T213A、G020R+N043R+S101A、R045T+S101A+T213A、T022W+S024R+S101A、T022R+S101G+V1041、T022W+S101A+T213A、T022R+S101G+Q245R、T022W+S101A+G21 IQ、G020R+S024R+Q245R、T022R+S101G+A232V、T022R+S101G+S103A、 G020R+S024R+T213A、 S101N+V104I+A232V、 S101N+S103A+V1041、S101N+S103A+A232V、G020R+S103A+A232V、G020R+V104I+A232V、G020R+S103A+V1041、N018R+N076D+N116A、N018R+N076D+T213A、N018R+N076D+S101A、N018R+N076D+A215F 或N018R+N076D+G211Q(列表5)，并且其中所述枯草杆菌蛋白酶变体的氨基酸位置是根据SEQID NO:1中所示解淀粉芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶BPN’的氨基酸序列中的对应氨基酸位置的编号方式进行编号。
[0135]本发明还提供分离的枯草杆菌蛋白酶变体，其中所述枯草杆菌蛋白酶变体为具有蛋白水解活性的成熟形式并且具有包含氨基酸置换的组合的氨基酸序列，所述氨基酸置换处于选自如下的位置:S101N+V104I+A232V、S101N+S103A+V1041、S101N+S103A+A232V 或S101N+S103A+V104I+A232V (列表6)，并且其中所述枯草杆菌蛋白酶变体的氨基酸位置是根据SEQ ID NO:1中所示解淀粉芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶BPN’的氨基酸序列中的对应氨基酸位置的编号方式进行编号。
[0136]本发明还提供分离的枯草杆菌蛋白酶变体，其中所述枯草杆菌蛋白酶变体为具有蛋白水解活性的成熟形式并且具有包含氨基酸置换的组合的氨基酸序列，所述氨基酸置换处于位置S101N+S103A+V104I+A232V(列表7)，并且其中所述枯草杆菌蛋白酶变体的氨基酸位置是根据SEQ ID N0:1中所示解淀粉芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶BPN’的氨基酸序列中的对应氨基酸位置的编号方式进行编号。
[0137]本发明还提供分离的枯草杆菌蛋白酶变体，其中所述枯草杆菌蛋白酶变体为具有蛋白水解活性的成熟形式并且具有包含氨基酸置换的组合的氨基酸序列，所述氨基酸置换处于选自如下的位置:S101N+V104I+A232V、S101N+S103A+V104I 或 S101N+S103A+A232V (列表8)，并且其中所述枯草杆菌蛋白酶变体的氨基酸位置是根据SEQ ID N0:1中所示解淀粉芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶BPN’的氨基酸序列中的对应氨基酸位置的编号方式进行编号。
[0138]本发明还提供分离的枯草杆菌蛋白酶变体，其中所述枯草杆菌蛋白酶变体为具有蛋白水解活性的成熟形式并且具有包含氨基酸置换的组合的氨基酸序列，所述氨基酸置换处于选自如下的位置:S103A+V104I+S188D、S188D+Q245R+N248D、S103A+S188D+Q245R、V104I + S188D + Q245R、S I O 3A + VI O4 I+ S I 88D + Q245R、TO22A + SI O 3A + SI 88D、T022A + V104I + S188D、TO22A + SI O 3A + VI O4 I+ S I 88D、G I 59D + SI 88D + Q245R、S103A+S188D+A232V、S103A+G159D+S188D、V104I+S188D+A232V、V104I+G159D+S188D、S103A+V104I+S188D+A232V、 S103A+V104I+G159D+S188D、 S103A+S188D+N248D、V104I + S188D + N248D、S I O 3A + VI O4 I+ S I 88D + N248D、G I59D + SI88D + N248D、S188D+A232V+Q245R、S103A+S188D+A232V+Q245R、V104I + S188D+A232V+Q245R、S103A+V104I+S188D+A232V+Q245R、T022A+S188D+Q245R、T022A+S103A+S188D+Q245R、T022A + V104I + S188D + Q245R、S I O 3A + SI 88D + E27 IF、V I 04 I+ S I 88D + E27 IF、T022A+S103A+V104I+S188D+Q245R、 S103A+V104I+S188D+E271F, T022A+S188D+N248D、T022A+S103A+S188D+N248D、T022A+V104I+S188D+N248D、S103A+S188D+Q245R+N248D、T022A+S103A+V104I+S188D+N248D、V104I+S188D+Q245R+N248D、S103A+V104I+S188D+Q245R+N248D、T022A+S188D+A232V, T022A+S103A+S188D+A232V、T022A+V104I+S188D+A232V、T022A+S103A+V104I+S188D+A232V, S188D+A232V+N248D、S188D + Q245R + E271F、TO22A + SI 88D + E27 IF、TO22A + SI 88D + Q245R + N248D、S103A+S188D+A232V+N248D、 S103A+S188D+Q245R+E271F、 S188D+N248D+E271F、V104I+S188D+A232V+N248D、V104I+S188D+Q245R+E271F、T022A+S103A+S188D+E271F、T022A+S103A+S188D+Q245R+N248D、S103A+S188D+N248D+E27 1F、
【权利要求】
1.一种分离的枯草杆菌蛋白酶变体，其中所述枯草杆菌蛋白酶变体为具有蛋白水解活性的成熟形式并且具有包含氨基酸置换的组合的氨基酸序列，所述氨基酸置换处于选自如下的位置:T022R+V104I+Q245R、G020R+S024R+S101A、T022R+S103A+V1041、T022R+V104I+A232V, T022R+S103A+Q245R、T022R+A232V+Q245R、T022R+S103A+A232V,T022R+S103A+V104I+A232V、T022R+V104I+A232V+Q245R, T022R+S103A+V104I+Q245R,T022R+S103A+A232V+Q245R、T022R+S103A+V104I+A232V+Q245R、T022A+N076D+S103A+V104I+A232V+Q245R、T022A+N076D+S103A+V104I+A232V, T022A+N076D+V104I+A232V+Q245R,T0 2 2A + N0 7 6D + S10 3A + A2 3 2V + Q245R、TO 22A + NO76D + SI O 3A + VI O4 I+ Q245R、T022A+N076D+V104I+Q245R, T022A+N076D+A232V+Q245R, T022A+N076D+V104I+A232V,T022A+N076D+S103A+Q245R, T022A+N076D+S103A+A232V, T022A+N076D+S103A+V1041、T022A+N076D+S103A、T022A+N076D+V104I, T022A+N076D+A232V, T022A+N076D+Q245R,G020R+S101A+T213A、G020R+R045T+S101A、G020R+S101A+G21 IQ、S024R+S101A+T213A、G020R+T022W+S101A、S024R+S101A+G21 IQ、N043R+S101A+T213A、N043R+R045T+S101A、S024R+N043R+S101A、S024R+R045T+S101A、S101A+G211Q+T213A、G020R+N043R+S101A、R045T+S101A+T213A、T022W+S024R+S101A、T022R+S101G+V1041、T022W+S101A+T213A、T022R + S101G + Q245R、T0 2 2W + S101A + G2I IQ, GO 2 O R + S O 24R + Q245R,T022R + S101G + V104I+Q245R、TO22R + SI O IG + A232V、TO22R + SI O IG + SI O 3A、T022R+S101G+S103A+V1041、T022R+S101G+S103A+Q245R、T022R+S101G+A232V+Q245R、T022R+S101G+V104I+A232V、G020R+S024R+S101A+T213A, G020R+S024R+T213AS101N+V104I+A232V、 S101N+S103A+V1041、 S101N+S103A+A232V、 S101N+S103A+V104I+A232V,G020R + S103A + A232V、GO2OR + VI O4 I+A232V、GO2OR + SI O3A + VI O4 I+A232V、G020R+S103A+V1041、N018R+N076D+N116A、N018R+N076D+T213A、N018R+N076D+S101A、N018R+N076D+A215F或N018R+N076D+G211Q，并且其中所述枯草杆菌蛋白酶变体的氨基酸位置是根据SEQ ID NO:1中所示解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)枯草杆菌蛋白酶BPN’的氨基酸序列中的对应氨基酸位置所对应的编号方式进行编号。
2.根据权利要求1所述的分离的枯草杆菌蛋白酶变体，其中所述位置为T022A+N076D+S103A+V104I+A232V+Q245R,并且其中所述枯草杆菌蛋白酶变体的氨基酸位置是根据SEQID NO:1中所示解淀粉芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶BPN’的氨基酸序列中的对应氨基酸位置的编号方式进行编号。
3.根据权利要求1所述的分离的枯草杆菌蛋白酶变体，其中所述位置选自 T022R+S103A+V104I+A232V+Q245R、 T022A+N076D+S103A+V104I+A232V、T022A+N076D+V104I+A232V+Q245R、 T0 22A+N076D+S103A+A23 2V+Q245R 或T022A+N076D+S103A+V104I+Q245R，并且其中所述枯草杆菌蛋白酶变体的氨基酸位置是根据SEQ ID NO:1中所示解淀粉芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶BPN’的氨基酸序列中的对应氨基酸位置的编号方式进行编号。
4.根据权利要求1所述的分离的枯草杆菌蛋白酶变体，其中所述位置选自T022R+S103A+V104I+A232V、T022R+V104I+A232V+Q245R, T022R+S103A+V104I+Q245R,T022R+S103A+A232V+Q245R、T022A+N076D+V104I+Q245R, T022A+N076D+A232V+Q245R,T022A+N076D+V104I+A232V, T022A+N076D+S103A+Q245R, T022A+N076D+S103A+A232V,T022A+N076D+S103A+V1041、T022R+S101G+V104I+Q245R、T022R+S101G+S103A+V1041、T022R+S101G+S103A+Q245R、T022R+S101G+A232V+Q245R、T022R+S101G+V104I+A232V、G020R+S024R+S101A+T213A、S101N+S103A+V104I+A232V 或 G020R+S103A+V104I+A232V，并且其中所述枯草杆菌蛋白酶变体的氨基酸位置是根据SEQ ID NO:1中所示解淀粉芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶BPN’的氨基酸序列中的对应氨基酸位置的编号方式进行编号。
5.根据权利要求1所述的分离的枯草杆菌蛋白酶变体，其中所述位置选自T022R+V104I+Q245R、G020R+S024R+S101A、T022R+S103A+V1041、T022R+V104I+A232V、T022R+S103A+Q245R、T022R+A232V+Q245R、T022R+S103A+A232V, T022A+N076D+S103A、T022A+N076D+V1041、T022A+N076D+A232V、T022A+N076D+Q245R、G020R+S101A+T213A、G020R+R045T+S101A、G020R+S101A+G21IQ、S024R+S101A+T213A、G020R+T022W+S101A、S024R+S101A+G211Q、N043R+S101A+T213A、N043R+R045T+S101A、S024R+N043R+S101A、S024R+R045T+S101A、S101A+G211Q+T213A、G020R+N043R+S101A、R045T+S101A+T213A、T022W+S024R+S101A、T022R+S101G+V1041、T022W+S101A+T213A、T022R+S101G+Q245R、T022W+S101A+G211Q, G020R+S024R+Q245R、T022R+S101G+A232V、T022R+S101G+S103A、G020R+S024R+T213A、 S101N+V104I+A232V、 S101N+S103A+V1041、 S101N+S103A+A232V、G020R+S103A+A232V、G020R+V104I+A232V, G020R+S103A+V1041、N018R+N076D+N116A、N018R+N076D+T213A、N018R+N076D+S101A、N018R+N076D+A215F 或 N018R+N076D+G211Q，并且其中所述枯草杆菌蛋白酶变体的氨基酸位置是根据SEQ ID NO:1中所示解淀粉芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶BPN’的氨基酸序列中的对应氨基酸位置的编号方式进行编号。
6.一种分离的枯草杆菌蛋白酶变体，其中所述枯草杆菌蛋白酶变体为具有蛋白水解活性的成熟形式并且具有包含氨基酸置换的组合的氨基酸序列，所述氨基酸置换处于选自如下的位置:S103A+V104I+S188D、S188D+Q245R+N248D、S103A+S188D+Q245R、V104I + S188D + Q245R、S I O 3A + VI O4 I+ S I 88D + Q245R、TO22A + SI O 3A + SI 88D、T022A + V104I + S188D、TO22A + SI O 3A + VI O4 I+ S I 88D、G I 59D + SI 88D + Q245R、S103A+S188D+A232V、S103A+G159D+S188D、V104I+S188D+A232V、V104I+G159D+S188D、S103A+V104I+S188D+A232V、 S103A+V104I+G159D+S188D、 S103A+S188D+N248D、V104I + S188D + N248D、S I O 3A + VI O4 I+ S I 88D + N248D、G I59D + SI88D + N248D、S188D+A232V+Q245R、S103A+S188D+A232V+Q245R、V104I + S188D+A232V+Q245R、S103A+V104I+S188D+A232V+Q245R、T022A+S188D+Q245R、T022A+S103A+S188D+Q245R、T022A + V104I + S188D + Q245R、S I O 3A + SI 88D + E27 IF、V I 04 I+ S I 88D + E27 IF、T022A+S103A+V104I+S188D+Q245R、 S103A+V104I+S188D+E271F, T022A+S188D+N248D、T022A+S103A+S188D+N248D、T022A+V104I+S188D+N248D、S103A+S188D+Q245R+N248D、T022A+S103A+V104I+S188D+N248D、V104I+S188D+Q245R+N248D、S103A+V104I+S188D+Q245R+N248D、T022A+S188D+A232V, T022A+S103A+S188D+A232V、T022A+V104I+S188D+A232V、T022A+S103A+V104I+S188D+A232V, S188D+A232V+N248D、S188D + Q245R + E271F、TO22A + SI 88D + E27 IF、TO22A + SI 88D + Q245R + N248D、S103A+S188D+A232V+N248D、 S103A+S188D+Q245R+E271F、 S188D+N248D+E271F、V104I+S188D+A232V+N24 8D、V104I+S188D+Q245R+E271F、T022A+S103A+S188D+E271F、T022A+S103A+S188D+Q245R+N248D、S103A+S188D+N248D+E27 1F、T022A+V104I+S188D+E27 1F、T022A+V104I+S188D+Q245R+N248D、 S103A + V104I + S188D + Q245R + E271F、S 1 03A + V 1 04 I+ S188D + A232V + N248D、 V104I+S188D+N248D+E271F、S188D+A232V+E271F、T022A+S103A+V104I+S188D+E271F, T022A+S103A+V104I+S188D+Q245R+N248D, S103A+V104I+S188D+N248D+E271F, S103A+S188D+A232V+E271F、V104I+S188D+A232V+E271F、T022A+S188D+A232V+Q245R、 T022A+S188D+Q245R+E271F、 T022A+S188D+N248D+E271F、 S103A+V104I+S18 8D+A232V+E271F、 T02 2A+S103A+S188D+A232V+Q245R、 S188D+A232V+Q245R+N248D、 S188D+Q245R+N248D+E271F、 T022A+S188D+A232V+N248D、 T022A+S103A+S188D+Q245R+E271F、 T022A+S103A+S188D+N248D+E271F、 T022A + V104I + S18 8D + A232V + Q2 4 5R、S 1 03A + S 1 88D + A232V + Q245R + N248D、 S103A + S188D + Q24 5R + N2 48D + E271F、T022A + S 1 03A + S188D + A232V + N248D、 T022A + V104I + S18 8D + N2 48D + E271F、T022A + V 1 04 I+ S188D + Q245R + E271F、 S188D+A232V+Q245R+E271F、 S188D+A232V+N248D+E271F、 T022A+S103A+V104I+S188D+ A232V+Q245R、V104I+S188D+A232V+Q245R+N248D、T022A+V104I+S188D+A232V+N248D、 V104I+S188D + Q245R + N248D + E271F、TO22A + S188D+A232V + E271F、T022A + S1 03A + V104I + S188D + Q245R + E2 71F, TO22A + S103A + V1041+ S188D + N248D + E271 F、T022A + S188D + Q245R + N248D + E271F, S 103A + S188D+A232V + Q245R + E271F, S103A+S188D+A232V+N248D+E271F、 S103A+V104I+S188D+Q245R+N248D+E271F, T022A+S103A+V104I+S188D+A232V+N248D, S103A+V104I+S188D+A232V+Q245R+ N248D、 T022A+S103A+S188D+A232V+E271F、 V104I+S188D+A232V+N248D+E271F、 V104I+S188D+A2 3 2V+Q245R+E2 71F、 T02 2A+S10 3A+S188D+Q245R+N248D+E2 7 IF、T0 22A+V104I+S188D+A2 32V + E2 71F, TO22A + S188D+A232V+N248D + E271F, T022A+S188D+A232V+Q245R+N248D、 S188D+A232V+Q245R+N248D+E271F、 T022A+V10 4I+S188D+Q245R+N248D+E271F、 S103A+V104I+S188D+A232V+N248D+E271F, S103A+V 104I+S188D+A232V+Q245R+E271F、 T022A+S188D+A232V+Q245R+E271F、 T022A+S103A +V104I+S188D+A232V+E271F、 T022A+S103A+S188D+A232V+N248D+E271F, T022A+S1 03A+S188D+A232V+Q245R+N248D、 S103A+S188D+A232V+Q245R+N248D+E271F、 T022A +V104I+S188D+A232V+Q245R+N248D、 T022A+S103A+S188D+A232V+Q245R+E271F, TO 22A+V104I+S188D+A232V+N248D+E271F, T022A+S188D+A232V+Q245R+N248D+E27IF、 V104I+S188D+A232V+Q245R+N248D+E271F、 T022A+V104I+S188D+A232V+Q245R+E27 IF、 G159D+S188D+Q245R+N248D、 T022A+G159D+S188D、 T022A+S103A+G159D+S188D、 T022A+V104I+G159D+S188D、T022A+S103A+V104I+G159D+S188D、 S103A+G159D+S188D+Q245R、V104I+G159D+S188D+Q245R、 S103A+V104I+G159D+S188D+Q245R、S103A+G159D+S188D+N248D、 V104I+G159D+S188D+N248D、S103A+V104I+G159D+S188D+N248D、 G159D + S188D+A232V, S103A+G159D + S188D+A232V, V104I+G159D + S188D+A232V, S103A+V104I+G159D+S188D+A232V, T022A+G159D+S188D+Q245R、G159D+S188D+E271F、 T022A+S103A+G159D+S188D+Q245R、S103A+G159D+S188D+E27 1F、 T022A + V104I+G159D + S188D + Q245R、V 1 04 I+G159D + S188D + E271F、T022A +
7.根据权利要求6所述的分离的枯草杆菌蛋白酶变体，其中所述位置选自T022A+S103A+V104I+S188D+Q245R+N248D.T022A+S103A+V104I+S188D+A232V+Q245R.T022A+S103A+V1
8.根据权利要求6所述的分离的枯草杆菌蛋白酶变体，其中所述位置选自
9.根据权利要求6所述的分离的枯草杆菌蛋白酶变体，其中所述位置选自S103A+V104I+S188D+Q245R、 T022A+S103A+V104I+S188D、 S103A+V104I+S188D+A232V、S103A+V104I+G159D+S188D、 S103A+V104I+S188D+N248D、 S103A+S188D+A232V+Q245R、V104I+S188D+A232V+Q245R、T022A+S103A+S188D+Q245R、T022A+V104I+S188D+Q245R、S103A+V104I+S188D+E271F、 T022A+S103A+S188D+N248D、 T022A+V104I+S188D+N248D、S103A+S188D+Q245R+N248D、V104I+S188D+Q245R+N248D、T022A+S103A+S188D+A232V、T022A+V104I+S188D+A232V、 T022A+S188D+Q245R+N248D、 S103A+S188D+A232V+N248D、S103A+S188D+Q245R+E271F、V104I+S188D+A232V+N248D、V104I+S188D+Q245R+E271F、T022A+S103A+S188D+E271F、 S103A+S188D+N248D+E271F、 T022A+V104I+S188D+E271F、V104I+S188D+N248D+E271F、S103A+S188D+A232V+E271F、V104I+S188D+A232V+E271F、T022A+S188D+A232V+Q245R、 T022A+S188D+Q245R+E271F、 T022A+S188D+N248D+E271F、S188D+A232V+Q245R+N248D、 S188D+Q245R+N248D+E271F、 T022A+S188D+A232V+N248D、S188D+A232V+Q245R+E271F、 S188D+A232V+N248D+E271F、 T022A+S188D+A232V+E271F、
10.根据权利要求6所述的分离的枯草杆菌蛋白酶变体，其中所述位置选自
11.一种分离的枯草杆菌蛋白酶变体，其中所述枯草杆菌蛋白酶变体为具有蛋白水解活性的成熟形式并且具有包含氨基酸置换的组合的氨基酸序列，所述氨基酸置换的组合选
12.—种分离的枯草杆菌蛋白酶变体，其中所述枯草杆菌蛋白酶变体为具有蛋白水解活性的成熟形式并且具有包含氨基酸置换的组合的氨基酸序列，所述氨基酸置换的组合选自
13.一种分离的枯草杆菌蛋白酶变体，其中所述枯草杆菌蛋白酶变体为具有蛋白水解活性的成熟形式并且具有包含氨基酸置换的组合的氨基酸序列，所述氨基酸置换的组合选自
14.一种分离的枯草杆菌蛋白酶变体，其中所述枯草杆菌蛋白酶变体为具有蛋白水解活性的成熟形式并且具有包含氨基酸置换的组合的氨基酸序列，所述氨基酸置换的组合选白 G020R-T022W-S024R-R045T-S101A-N204S-G211Q, T022W-S024R-S101A-P2101-T213A、G020R-S101A-G211Q、G020R-S024R-S101A-P2101-G211Q-T213A、G020R-S101A-P2101-T213A,T022ff-S024R-N043R-S101A-P210I,G020R-S024R-N043R-R045T-S101A-G211Q、T022R-S101T-S103N-V104L-A232M-Q245R、G020R-T022A-S024R-R045T-S101A-T213A、T022R-S101G-S103N-V1041-A232M-Q245R、G020R-T022W-S024R-S101A-N116L-G211Q-T213A,G020R-T022ff-N043R-S101A-N116L-G211Q,G020R-T022ff-N043R-R045T-S101A,T022W-N043R-R045T-S101A-P2101-T213A, G020R-S024R-R045T-S101A-Q109R-P2101-G211Q-T213A、S024R-N043K-S101A-N204D-P2101、G020R-S024R-R045T-S101A-P2101、S024R-N043R-R045T-S101A-P2101-T213A、G020R-S024R-R045T-S101A-T213A、T022R-S101A-S103N-V1041-A232T-Q245R、GO2OR-TO22W-S024R-R045T-SI ` IA-N2O4S-P2IO 1-G211 Q、T022ff-N043R-S101A-P2101-G211Q,G020R-S024R-N043K-R045T-S101A-N116L-P210I,T022A-S101G-S103A-V1041-1107V-L217Q-A232V-Q245R, S024R-N043R-R045T-S101A-G211Q-T213A、T022R-S101A-S103G-V1041-A232M-Q245R、T022R-S101G-S103N-V104L-A232V-Q245R、S024R-S078G-G118S-Q245R-N248D-H249R、S024R-N043R-S101A-P2101-T213A、T022K-S101N-S103A-V1041-A232T-Q245R、G020R-N043R-S101A-P2101-G211Q、T022R-S101T-S103A-V1041-A232M-Q245R、S024R-V026A-N043R-S101A-P2101-G211Q、T022A-S078N-S101G-S103A-V1041-S128A-L217Q-A232V-Q245R、T022K-S101T-S103G-V1041-A232L-Q245R、G020R-T022W-S024R-N043R-R045T-S101A-G211Q、G020R-S024R-S078G-G118D-Q245R、T022A-S101N-S103A-V1041-S128A-P129S-A232V-Q245R、T022A-G097A-S101G-S103A-V1041-L217Q-A232V-Q245R、G020R-T022W-N043R-S101A-G211Q-T213A、N018K-G020R-S024R-R045T-S101A-P2101-G211Q-T213A、G020R-T022W-S024R-N043R-R045T-S101A、T022R-S101N-S103A-V104L-A232T-Q245R、G020R-S024R-S101A-T213A、T022R-S101N-S103G-V1041-A232V-Q245R、G020R-T022W-S024R-S101A-G211Q-T213A、T022A-S024G-S101G-S103A-V1041-S128A-L217Q-A232V-Q245R、S024R-S078G-G118D-P129E-Q245R-H249R、 T022R-S101T-S103A-V104L-A232L-Q245R,G020R-S024R-S101A-G211Q-T213A、T022A-S024G-S101G-S103A-V1041-L217Q-A232V-Q245R、G020R-T022W-N043R-V051A-S101A-P2101-G21 IQ, S024R-S078G-G118D-Q245R、N043R-S101A-P2 101、T022Y-S101G-S103N-V1041-A232L-Q245R、G020R-T022W-N043R-S101A-T213A、G020R-S024R-S078D-G118S-S188D-Q245R-H249R、T022Y-S101N-S103N-V1041-A232T-Q245R、G020R-T022W-S024R-F050L-S101A-G211Q-T213A、N018S-T022W-S024R-N043R-S101A-G211Q、T022A-S101G-S103A-V1041-S128A-P129S-L217Q-A232V-Q245R、T022R-S101N-S103N-V1041-A232V-Q245R、T022A-S024G-S078N-G097S-S101Q-S103A-V1041-L217Q-A232V-Q245R,S101A-P2101-G211Q-T213A.G020R-N043R-R045T-S101A-P
15.一种分离的枯草杆菌蛋白酶变体，其中所述枯草杆菌蛋白酶变体为具有蛋白水解活性的成熟形式并且具有包含氨基酸置换的组合的氨基酸序列，所述氨基酸置换的组合选自
16.一种分离的枯草杆菌蛋白酶变体，其中所述枯草杆菌蛋白酶变体为具有蛋白水解活性的成熟形式并且具有包含氨基酸置换的组合的氨基酸序列，所述氨基酸置换的组合选
17.根据权利要求1至16中任一项所述的分离的枯草杆菌蛋白酶变体，其中所述枯草杆菌蛋白酶变体是迟缓芽孢杆菌(Bacillus lentus)枯草杆菌蛋白酶GG36蛋白酶的枯草杆菌蛋白酶变体，其中所述迟缓芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶GG36蛋白酶包含SEQ ID N0:2中所示的氨基酸序列。
18.根据权利要求1至17中任一项所述的分离的枯草杆菌蛋白酶变体，其中所述枯草杆菌蛋白酶变体与所述包含SEQ ID N0:2中所示氨基酸序列的迟缓芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶GG36蛋白酶具有至少90%的氨基酸同一性。
19.根据权利要求1至18中任一项所述的分离的枯草杆菌蛋白酶变体，其中所述变体的总净电荷相对于所述迟缓芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶GG36蛋白酶的总净电荷为0、+1、+2、+3、+4、+5、-1、-2、-3、~4 或-5。
20.根据权利要求19所述的分离的枯草杆菌蛋白酶变体，其中所述变体的总净电荷相对于迟缓芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶GG36蛋白酶的总净电荷为-1、0、+1、+2、+3、+4或+5。
21.根据权利要求20所述的分离的枯草杆菌蛋白酶变体，其中所述变体的总净电荷相对于迟缓芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶GG36蛋白酶的总净电荷为-1、0、+1、+2、+3或+4。
22.根据权利要求19所述的分离的枯草杆菌蛋白酶变体，其中所述变体的总净电荷相对于迟缓芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶GG36蛋白酶的总净电荷为+1、0、-1、-2、-3、-4或-5。
23.根据权利要求22所述的分离的枯草杆菌蛋白酶变体，其中所述变体的总净电荷相对于迟缓芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶GG36蛋白酶的总净电荷为+1、0、-1、-2、-3或-4。
24.根据权利要求1-23中任一项所述的分离的枯草杆菌蛋白酶变体，其中所述总净电荷通过一个或多个选自如下的置换获得:A001E、V004E、R010H/A、Q012E、A015D、N018D、R019H/S、V026D、K027E、N043D、R045C/T/S/P、S049D、V051E、G061E、N062D/E、N076D、N077D、S078D、S087D、A098E、S101D、S106E、G115E、G118D、N123D、S128D、P129E、S130D/E、S132D、A158E、G159D/E、S160D、S166D、R170T、N183D、N184D、N185E、R186H、S188D/E、A194E、A200D、Y209E、A215D、N204D、S212D、L217D/E、N218D、A230E、K235F、N237D、K237E、N238D、S240D、N243D、Q245D、R247L、N248D/E、K251C、N263D、N269D/E、A272D、A273E 或 R275H/S，并且其中所述蛋白酶变体的氨基酸位置是根据SEQ ID NO:1中所示解淀粉芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶BPN’的氨基酸序列中的对应氨基酸位置的编号方式进行编号。
25.根据权利要求1-23中任一项所述的分离的枯草杆菌蛋白酶变体，其中所述总净电荷通过一个或多个选自如下的置换获得:A001R、V004R、Q012R、P014R、H017R、N018R/K、G020K/R、T022R/K、S024R/K、G025R、D0321、D041K/L/N、N043R/K、G046R、A048R、F050R/K、P055R、S056R/K、T057R、Q059K、G061R、N076K、S078R、P086R、S087R、E089G/P/1、G097R、S099R、Q109R、G115R、G118R、S132K、S144R、G159R/K、D181C/S/T、L196K、N204K、Q206R、K235R、Q236R/K、K237R、N238R、S240R、W241R、S242R/K、V244R、Q245R/K、N248R、H249R、N252R/K、S256R、G258R、T260K、N269R/K 或 E271F/H/T/L/W/R/S/I/A/G/V，并且其中所述蛋白酶变体的氨基酸位置是根据SEQ ID NO:1中所示解淀粉芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶BPN’的氨基酸序列中的对应氨基酸位置的编号方式进行编号。
26.根据权利要求1-41中任一项所述的分离的枯草杆菌蛋白酶变体，其中所述枯草杆菌蛋白酶变体具有如下特性中的一者或多者:a)至少1.1、至少1.2、至少1.3、至少1.4、至少1.5、至少1.6、至少1.7、至少1.8、至少1.9、至少2、1.1至约10、1.1至约8或甚至1.1至约5的测试方法2性能指数；b)至少1.1、至少1.2、至少1.3、至少1.4、至少1.5、至少.1.6、至少1.7、至少1.8、至少1.9、至少2、1.1至约10、1.1至约8或甚至1.1至约5的测试方法3性能指数；c)至少1.0、至少1.1、至少1.2、至少1.3、至少1.4、至少1.5、至少1.6、至少1.7、至少1.8、至少1.9、至少2、1.0至约10、1.0至约8或甚至1.0至约5的测试方法4性能指数；和/或d)至少1.0、至少1.1、至少1.2、至少1.3、至少1.4、至少1.5、至少.1.6、至少1.7、至少1.8、至少1.9、至少2、1.0至约10、1.0至约8或甚至1.0至约5的测试方法6性能指数；和/或e)至少1.1、至少1.2、至少1.3、至少1.4、至少1.5、至少1.6、至少1.7、至少1.8、至少1.9、至少2、1.1至约15、1.1至约10或甚至1.1至约7的测试方法7性能指数。
27.一种分离的核酸，其包含编码权利要求1-26中任一项提供的枯草杆菌蛋白酶变体的多核苷酸序列。
28.一种表达载体，其包含根据权利要求27所述的核酸。
29.根据权利要求28所述的表达载体，其中所述至少一种核酸与启动子有效连接。
30.一种宿主细胞，其包含根据权利要求28或29中任一项所述的表达载体。
31.一种用于产生芽孢杆菌属(Bacillus)枯草杆菌蛋白酶的至少一种枯草杆菌蛋白酶变体的方法，其包括: a)用包含编码至少一种根据权利要求1-26中任一项所述的枯草杆菌蛋白酶变体的至少一种核酸的表达载体转化宿主细胞，以产生转化的宿主细胞；以及 b)在适于产生至少一种枯草杆菌蛋白酶变体的条件下培养所述转化的宿主细胞，以产生至少一种枯草杆菌蛋白酶变体。
32.根据权利要求31所述的方法，还包括收获所产生的枯草杆菌蛋白酶变体。
33.根据权利要求30-31中任一项所述的方法，其中所述宿主细胞为芽孢杆菌属物种。
34.根据权 利要求33所述的方法，其中所述芽孢杆菌属物种为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。
35.一种包含至少一种根据权利要求1-26中任一项所述的枯草杆菌蛋白酶变体的组合物，其中所述组合物不是织物和家庭护理产品。
36.根据权利要求35所述的组合物，其中所述组合物为清洁组合物。
37.根据权利要求35-36中任一项所述的组合物，其中所述清洁组合物为颗粒、粉末、固体、条棒、液体、片剂、凝胶或糊剂组合物。
38.根据权利要求35-37中任一项所述的组合物，还包含至少一种漂白剂。
39.根据权利要求35-38中任一项所述的组合物，其中所述清洁组合物不含磷酸盐。
40.根据权利要求35-39中任一项所述的组合物，其中所述清洁组合物含有磷酸盐。
41.根据权利要求35-40中任一项所述的组合物，还包含至少一种另外的酶。
42.根据权利要求41所述的组合物，其中所述至少一种另外的酶选自半纤维素酶、纤维素酶、过氧化物酶、蛋白酶、金属蛋白酶、木聚糖酶、脂肪酶、磷脂酶、酯酶、过水解酶、角质酶、果胶酶、果胶酸裂解酶、甘露聚糖酶、角蛋白酶、还原酶、氧化酶、酚氧化酶、脂氧合酶、木质酶、支链淀粉酶、鞋酸酶、戍聚糖酶、malanase、β -葡聚糖酶、阿拉伯糖苷酶、透明质酸酶、软骨素酶、漆酶和淀粉酶或它们的任何组合。
43.根据权利要求35-42中任一项所述的组合物，其中所述枯草杆菌蛋白酶变体不是冷水蛋白酶变体。
44.一种清洁方法，包括使表面或物品与包含至少一种根据权利要求1-26中任一项所述的枯草杆菌蛋白酶变体的清洁组合物接触。
45.一种清洁方法，包括使表面或物品与权利要求35-43中任一项所示的清洁组合物接触。
46.根据权利要求44-45中任一项所述的方法，还包括在使所述表面或物品分别与所述清洁组合物接触后漂洗所述表面或物品。
47.根据权利要求44-46中任一项所述的方法，还包括在使所述表面或物品与所述清洁组合物接触后漂洗所述表面或物品的步骤。
48.根据权利要求47所述的方法，还包括在所述表面或物品的所述漂洗后干燥所述表面或物品的步骤。
49.一种清洁表面或物品的方法，包括:提供根据权利要求35-43中任一项所述的清洁组合物和需要清洁的表面或物品；以及使所述清洁组合物与所述需要清洁的表面或物品在适于清洁所述表面或物品的所述表面的条件下接触，以产生清洁的表面或物品。
50.根据权利要求49所述的方法，还包括漂洗所述清洁过的表面或物品以产生漂洗过的表面或物品的步骤。
51.根据权利要求49-50中任一项所述的方法，还包括干燥所述漂洗过的表面或物品的步骤。
52.根据权利要求44-51中的 任一项所述的方法，其中所述枯草杆菌蛋白酶变体不是冷水蛋白酶变体。
【文档编号】C12N9/54GK103764823SQ201280021911
【公开日】2014年4月30日 申请日期:2012年5月4日 优先权日:2011年5月5日
【发明者】N·S·阿明, K·奥古斯汀, J·R·巴斯勒, L·G·卡斯康-佩雷拉, K·D·科利尔, E·M·孔卡, D·A·埃斯特尔, J·T·小凯利斯, E·J·马格尼斯, A·比萨奇科, A·J·保罗斯, P·F·苏特, G·S·沃德, J·姚 申请人:丹尼斯科美国公司, 宝洁公司