胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶抑制物、其制备和用途的制作方法

专利名称：胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶抑制物、其制备和用途的制作方法
专利说明胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶抑制物、其制备和用途 本发明涉及通式为
的胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶抑制物，其除了抑制纤溶酶外，还抑制血浆激肽释放酶，及其制备和作为药物的用途，或者作为纤维蛋白粘合剂的成分，所述药物优选用于处理失血，尤其在纤溶亢进状态的情况下、在器官移植或尤其是带有心肺转流的心脏外科手术的情况下。
纤溶酶和血浆激肽释放酶(PK)的抑制剂是已知的。纤溶酶是一种胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶，并可使大量的碱性氨基酸精氨酸或赖氨酸的C-末端底物裂解。纤溶酶是通过纤溶酶原激活因子尿激酶或tPA的催化作用由酶原纤溶酶原形成的。纤溶酶底物包括胞外基质和基膜的各种蛋白质，例如纤维连接蛋白、层粘连蛋白、IV型胶原或者纤维蛋白，还有大量的酶原如基质-金属蛋白酶或者纤溶酶原激活因子尿激酶的前体形式。在血液中，纤溶酶通过将纤维蛋白裂解为可溶性产物主要负责纤溶。
内源性纤溶酶抑制剂包括α2-巨球蛋白和丝氨酸蛋白酶抑制剂-α2-抗纤溶酶。在一定的病理条件下可以导致纤溶的自发激活。在这种高纤维蛋白溶酶血症的情况下，不仅创口愈合性纤维蛋白被分解，而且还形成抗凝的纤维蛋白原分解产物。由此可能出现严重的止血障碍。作为抗纤溶药，临床上使用合成的氨基羧酸例如ε-氨基己酸、对-氨甲基苯甲酸或氨甲环酸(反-4-氨甲基环己羧酸)。这些化合物阻止酶原纤溶酶原结合至纤维蛋白并由此抑制纤溶酶原活化为纤溶酶。因此，这些化合物不是纤溶酶的直接抑制物并且不能抑制已经形成的纤溶酶。作为其它抗纤溶药，使用抑肽酶(Trasylol

，Bayer AG，Leverkusen)，一种从牛肺中获得的58个氨基酸的多肽。抑肽酶以1nM的抑制常数抑制纤溶酶，却是相对非特异地，并且也能有效地抑制胰蛋白酶(Ki＝0.1nM)和血浆激肽释放酶(Ki＝30nM)。抑肽酶还能抑制其他的酶，虽然是以减低的活性。
抑肽酶的一个主要用途是用于减少失血，尤其在具有心肺转流(CPB)的心脏外科手术的情况下，由此明显地减少了围手术期输血的需求(Sodha等人，2006)。此外，抑肽酶也用于其他的手术，例如在器官移植中，用以防止失血，或者作为纤维蛋白粘合剂的添加剂使用。
使用抑肽酶具有较多缺点。这是因为它是从牛器官中分离的，原则上存在病原体污染和变态反应的危险。过敏性休克的风险在第一次给予抑肽酶时相对较小(＜0.1％)，然而，在200天之内重复给予的情况下则增加至4-5％。
近来报道，与ε-氨基己酸或氨甲环酸直接相比，给予抑肽酶诱发的副作用的案例数增加(Mangano等人，2006)。给予抑肽酶使得肾损害的案例数加倍，由此使透析成为必需。同样地，与对照组相比，给予抑肽酶增加了心肌梗死和卒中发作的风险。
迄今，仅有少数的合成纤溶酶抑制剂是已知的。Sanders和Seto(1999)描述纤溶酶具有≥50μM的抑制常数的、相对弱效的4-杂环己酮衍生物。Xue和Seto(2005)报道了IC50值≥2μM的肽环己酮衍生物，但并不知其进展。Okada和Tsuda对具有4-氨甲基环己酰残基的各种衍生物作了描述，所述衍生物以IC50值≥0.1μM抑制纤溶酶，但并不知这些抑制剂的临床用途(Okada等人，2000；Tsuda等人，2001)。
在关于开发凝血蛋白酶抑制物作为抗血栓药的大量出版物中，发表了纤溶酶的抑制常数，其中虽然在这些情况下目的在于尽可能弱的纤溶酶抑制作用。这些论文都没有提及在心脏外科手术的情况下这些化合物用于减少失血的可能用途。这样，例如，凝血酶抑制剂美拉加群以0.7μM的Ki值抑制纤溶酶，而结构上相近的相关化合物H317/86对纤溶酶具有0.22μM的抑制常数(Gustafsson等人，1998)。然而，这两种化合物都以≤2nM的Ki值显著较强烈地抑制蛋白酶凝血酶，由此，通过给予美拉加群导致强抗凝血作用。
如引言所述，除了抑制纤溶酶之外，抑肽酶还抑制血浆激肽释放酶(PK)。PK是多功能的、胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶，已知它的多种生理底物。例如PK能够通过蛋白酶切从高分子的激肽原释放血管活性肽缓激肽并激活酶原凝血因子XII、尿激酶原、纤溶酶原和MMP3酶原。因此认为，PK/激肽系统在各种病症中具有重要作用，例如在血栓栓塞性疾病、弥散性血管内凝血、败血症性休克、变态反应、胃切除术后综合征、关节炎和ARDS(成人呼吸窘迫综合征)(Tada等人，2001)中。
所以，抑肽酶通过其对PK的抑制效应抑制肽类激素缓激肽的释放。通过激活缓激肽B2受体，缓激肽引起各种效应。通过缓激肽诱导的tPA、NO和前列环素从内皮细胞的释放(参见综述文章，Schmaier，2002)影响纤溶、血压和炎症事件。对通过抑制缓激肽释放减少作为手术中可能发生的副反应的全身性炎症过程进行了讨论。
作为PK抑制剂描述了具有微摩尔Ki值的ω-氨基和ω-胍基烷基羧酸的酯以及各种二苄脒例如戊烷脒和相关化合物，(Asghar等人，1976；Muramatu和Fuji，1971；Muramatu和Fuji，1972；Ohno等人，1980；Muramatu等人，1982；Satoh等人，1985；Teno等人，1991)。
第一个选择性的竞争性抑制剂，其衍生自精氨酸或苯丙氨酸，由Okamoto等人(1988)开发，它们以约1μM的Ki值抑制PK。Okada的小组已发表了多篇开发竞争性PK抑制剂的论文，其中最有效的化合物，其衍生自反-4-氨基甲基环己羰基-苯丙氨酸-4-羧甲基酰苯胺，具有约0.5μM的抑制常数(Okada等人，1999；Okada等人，2000，Tsuda等人，2001)。所述PK抑制剂的共同之处是其相对高的Ki值。在US6,472,393中描述了具有约1nM抑制常数的有效PK抑制物，它们具有作为P1残基的4-脒基苯胺。在US 5,602,253中也描述了PK抑制物。在US 2006/0148901中描述了PK抑制物，但其对纤溶酶的抑制作用相对低，因此这些抑制物不同于本申请中所描述的抑制剂。
对于本发明任务，因此基于提供适合于治疗应用的低分子活性物质，所述活性物质尤其以高的活性和特异性可逆地且竞争性地抑制纤溶酶和血浆激肽释放酶，并因此在各种应用中适合用于止血，例如在具有CPB的心脏外科手术的情况下，在器官移植或其他手术的情况下。这些化合物的另一个优点在于，通过其作为血浆激肽释放酶抑制物的作用，还减少了激肽释放，并因此能够抑制激肽介导的炎症反应。通过被抑制的激肽的释放进一步抑制了激肽诱导的tPA从内皮细胞的释放，通过该机制纤维蛋白溶解可被下调。这些化合物的另一个优点为尽管其选择性，对FXa和/或凝血酶也有一定的抑制作用，由此在使用这些化合物的情况下还应该可以减少血栓性并发症。
现在，令人惊奇地发现，通过根据式I的两个立体化学要求高的和/或疏水性残基R2和R3的组合，优选经取代或未经取代的芳族体系，可以获得对纤溶酶和血浆激肽释放酶具有强抑制常数的抑制剂。可比较的良好效果还可以用在R2上带有非芳族残基和在R3上带有碱性取代的苯基残基的物质而获得。
因此，本发明的主题是通式(I)的化合物，
具有 R1，可选地，存在一个或多个并彼此独立地是COOR5残基，R5等于氢或支化或线性的具有1-6个碳原子的低级烷基基团，优选甲基或乙基，尤其是甲基，支化或线性的具有1-6个碳原子的氨基烷基残基，优选甲基，卤素或假卤素残基，优选氯或者氰基基团，或者式(II)或(III)的聚乙二醇残基 CH3-O-(CH2-CH2-O-)n-CH2-CH2-(C＝O)-NH-CH2- (II) CH3-O-(CH2-CH2-O-)n-CH2-CH2-NH-(C＝O)-CH2-CH2-(C＝O)-NH-CH2- (III) 其中n通常如此定义，使得所述聚乙二醇残基具有10000Da、5000Da、3400Da、2000Da、1000Da或750Da的平均分子量。通常，n为约18至约250之间的整数，尤其为约18、约25、约50、约85、约125或约250； R2可选地具有5-13个碳原子的经取代的芳族或非芳族环或二环或具有4-5个碳原子和一个氮原子、氮氧化物、氧原子或硫原子，优选氮原子或氮氧化物的芳族杂环；或结构如下的残基
R3可选地具有5-6个碳原子的经取代的芳族环或具有3-5个碳原子和1-2个氮原子、一个氮氧化物、氧原子或硫原子，优选一个氮原子或氮氧化物的芳族杂环； R4可选地，存在一个或多个的卤素残基，优选氟； o＝1、2或3，尤其是1； p＝0、1、2、3或4，尤其是3；和 i＝0或1，尤其是0； 以及其外消旋混合物和其与有机酸或无机酸的盐。
实验结果表明，在R2和R3处具有环状结构和尤其是R2和R3处具有芳族碳环的化合物的情况下，对纤溶酶和血浆激肽释放酶的抑制特别好。此外可以表明，通过对取代基的适当选择，在R2和R3处具有芳族碳环的化合物的情况下，还可以达到好的Xa因子抑制和/或凝血酶的抑制。
实验结果还表明，当R1为3-COOH基团时，达到凝血酶抑制的明显减少。因此，在一个优选的实施方案中，R1存在一个并在间或对位，优选地，R1为COOH残基，尤其是，R1存在一个并且选自氢、4-COOH基团或尤其是3-COOH基团。当R4为氟原子，尤其是处于邻位时由此还可以达到凝血酶抑制的进一步减少。
本发明的进一步优选的实施方案涉及这样的化合物，其中R2为具有6-13个碳原子的经取代或未经取代的芳族环或二环或者具有5个碳原子和一个氮原子的杂环。
通常，R2处的取代基为卤素残基，优选氯或氟，尤其是氯；可选地经氟取代的、支化的或线性的具有1-6个碳原子的烷基残基，优选甲基或叔丁基；可选地经氟取代的、支化的或线性的具有1-6个碳原子的烷氧基残基；优选甲基、羟基残基或氰基残基。
在一个可替代的实施方案中，R2也可以是具有6个碳原子的非芳族环。
式(I)的化合物被证明是特别适宜的化合物，其中R3处的取代基为具有碱性残基的芳族体系，尤其是具有1-3个碳原子，优选1个碳原子的烷基氨基残基、脒基残基或胍基残基。尤其是具有下列残基的、具有i＝0和无R4的根据式(I)的化合物被证明是特别适宜的。

本发明的化合物的盐通常由盐酸、HBr、乙酸、三氟乙酸、甲苯磺酸或其他适宜的酸形成。
选自下列的化合物是特别适宜的 其中R2选自下列残基



或

尤其是
和/或其中R3选自
尤其是
这类化合物的实例为式(I)的化合物，其如下定义



结果表明，通式(IV)的化合物
其相应于通式(I)的化合物，其中 R1，可选地，存在一个或多个并彼此独立地是COOR5残基，R5等于氢或支化或线性的具有1-6个碳原子的低级烷基基团，优选甲基或乙基，尤其是甲基，支化或线性的具有1-6个碳原子的氨基烷基残基，优选甲基，卤素或假卤素残基，优选氯或氰基基团，或者式(V)或(VI)的聚乙二醇残基 CH3-O-(CH2-CH2-O-)n-CH2-CH2-(C＝O)-NH-CH2- (V) CH3-O-(CH2-CH2-O-)n-CH2-CH2-NH-(C＝O)-CH2-CH2-(C＝O)-NH-CH2- (VI) 其中n如此定义，使得所述聚乙二醇链具有10000Da、5000Da、3400Da、2000Da、1000Da或750Da的平均分子量，优选n为约18至约250之间的整数，尤其为约18、约25、约50、约85、约125或约250； R2是支化或线性的具有1-6个碳原子的烷氧基残基，优选叔丁基、羟基残基、氨基残基或支化的或线性的具有1-6个碳原子的烷氧基羰基氨基残基，优选叔丁基，或者具有如上所定义n的式(V)或(VI)的聚乙二醇残基； R3选自下列残基
优选
R4可选地存在一个或多个的卤素残基，优选氟； o＝1或2； p＝1、2、3或4，尤其是1或4； i＝0或1，尤其是0； 以及其外消旋混合物和与有机酸或无机酸的盐，根据本发明也是适宜的。
在这种情况下，也优选化合物，其中R1存在一个并在间或对位，优选R1为氢或COOH残基，尤其是R1存在一个并且选自氢、4-COOH基团或3-COOH基团。
通常，这些化合物的盐还是由盐酸、HBr、乙酸、三氟乙酸、甲苯磺酸或其他适宜的酸形成。
这类化合物的实例为具有i＝0和无R4残基的式(IV)的化合物，其如下定义


通式I的化合物可以以如下文所述的原则上已知的方法来制备，例如如下其中通常将相应的氨基酸依次偶联到脒基被保护的脒基苄胺上。在此，N-末端氨基酸已经具有P4残基，或者P4-残基随即被连接上去。
本发明的化合物的各个组成部分P1，P2，P3和P4的命名在下文阐明。(也可参见Schechter和Berger，1967)。
例如，按照本领域技术人员已知的方法，从商购可得的4-氰基苄胺(Showa Denko K.K.，Japan)获得经保护的优选Boc-保护的并且脒基基团处被保护的脒基苄胺，尤其是4-乙酰氧基脒基苄胺。保护基团解离之后，通过标准偶联方法和保护基团进行进一步的氨基酸和P4残基的偶联，优选以Boc作为N末端保护基团。P3氨基酸还可以作为经保护的优选经苄基磺酰基保护的、已经具有R1残基的氨基酸直接偶联。从乙酰氧基脒基苄胺起始，依次地构建肽类似物。大多数中间产物结晶良好，因此可容易地进行纯化。抑制物的最终纯化在最后阶段优选通过制备型反相HPLC来进行。
因此，本发明的另一个主题是制备本发明的化合物的方法，其中将相应的氨基酸依次偶联到在脒基或胍基基团处被保护的脒基苄胺或胍基苄胺上，例如4-乙酰氧基脒基苄胺上或4-(苄氧基羰基脒基)苄胺上，其中N末端氨基酸已经带有P4残基，或者P4残基随即被连接上去。在可能的纯化之后，可将所获得的化合物可选地进行PEG化。
制备本发明的化合物的示例方法包括以下步骤 (a)用相应的经保护的氨甲基苯甲脒或氨甲基苯甲胍来酰胺化带有R3残基的相应的Nα-保护的氨基酸， (b)在具有R3的氨基酸的Nα保护基团解离后，所获得的产物与具有R1和R2残基的相应的苄基磺酰氨基酸反应以及剩余的保护基团解离生成本发明的化合物之后，并且在可能的纯化之后， (c)可选地使所获得的化合物PEG化。
本领域技术人员公知的进一步的方法细节，例如关于所选择的保护基团或者PEG化，可在实施例中获悉。酰胺氮优选的保护基团为例如叔丁氧羰基(Boc)。起始化合物为例如氨基酸衍生物或PEG衍生物。通常，所述化学品可以购得。所述PEG化，即用聚乙二醇进行的衍生化，通常用经活化的PEG衍生物，例如用呈N-羟基琥珀酰亚胺酯活化的PEG，经由P3氨基酸或者经由P4苄基磺酰基残基来进行。
PEG偶联化合物的一个有利的性质是延长抑制剂在血液循环中的半衰期。下面的结构显示了其中PEG链经由P3氨基酸(D-Lys)偶联的实例。

通过使用琥珀酰基链接获得下面的化合物
此外，PEG链经由相应于下述通式的适合的P4-苄基磺酰基残基进行偶联，其中P4残基在对位或邻位用氨甲基基团修饰。

通过使用琥珀酰链接获得下面的化合物
然而，其他可以同样方式实施的制备方法也是本领域技术人员已知的。PEG化的化合物通常为各种PEG化程度的化合物的混合物，其中PEG残基的分子量通常在750、1000、2000、3400、5000或10000Da的范围内。然而，也可以购得具有确定分子量的个别的聚乙二醇。
本发明也扩展至包含至少一种本发明的化合物的药物，所述药物优选地用于处理失血，尤其在纤溶亢进状态的情况下、在器官移植或尤其是带有心肺转流的心脏外科手术的情况下。
本发明还包括包含至少一种本发明的化合物的纤维蛋白粘合剂，其中抑肽酶被本发明的适宜的抑制物所取代。
纤维蛋白粘合剂通常意指生理学的双组分粘合物质，其包含作为第一组分的纤维蛋白原、XIII因子和抑肽酶或至少一种本发明的化合物，和作为第二组分的用于激活XIII因子的凝血酶和氯化钙。
本发明还涉及至少一种本发明的化合物的用途，用于按本领域技术人员公知的方法，例如通过与适宜的辅料或添加剂相混合，制备本发明的药物或本发明的纤维蛋白粘合剂。
本发明还涉及下面的主题 通式
的化合物 i为0或1，优选0 R4为H或OH，优选H A选自下列结构
其中A优选为苯基残基， R1为H、COOH、COOR5(R5＝甲基或乙基)，氨甲基、卤素、假卤素，但优选为H和COOH和特别优选COOH，因为羧基延长抑制剂在循环中的半衰期， R3为
R2为支化或未支化的具有3-12个碳原子的烷基，还可以是环烷基取代的具有6-14个碳原子的芳基或芳烷基，为杂芳基或者作为具有6-12个碳原子和1-3个杂原子的杂芳烷基，此外
R6为具有p＝0，1，2的卤素或假卤素， 以及其外消旋体、结晶形式和水合物及其与有机酸和无机酸的盐。
下式的化合物，其中称为P4-P1的各个位置为
其中 P4＝未经修饰或经取代的苄基磺酰基残基 P3＝D构型的疏水氨基酸、D-苯基丙基甘氨酸和其他氨基酸 P2＝L构型的碱性疏水氨基酸 P1＝4-脒基苄基酰胺残基和相关基团。
下面结构的化合物，其如下经由P3偶联到PEG
或
标记R1，R2，R3，R4，A和i相应于上面给出的定义。B相应于PEG链，其末端以甲基醚存在。Y为用于将PEG偶联至P3氨基酸的适宜的链接，例如丙酰基残基，和X为NH基团或NH-烷基基团或NH-芳基基团。所述偶联以本身已知的方法来进行。
本发明的化合物具有例如PEG链，其具有750Da、1000Da、2000Da、5000Da、10000Da、20000Da的平均摩尔质量，或者个别的PEG链。
本发明的化合物用于制备药物的用途，所述药物适合于减少纤溶亢进状态情况下的失血，和本发明的化合物作为用于制备纤维蛋白粘合剂的试剂的用途。
下面的实施例将会详细阐明本发明，但并不限制本发明。
实施例 1.分析方法 1.1分析型HPLC 对于分析型反相HPLC，使用Shimadzu公司的LC-10A HPLC装置，其由分系统CTO-10AS柱室、LC-10AD泵(2x)、DGU-14A除气器、SIL-10AD自动注射器、SCL-10A系统控制器、SPD-10A UV-Vis检测器和一个Phenomenex公司的Luna 5μm C18(2)

250x4.6mm柱组成，使用附带的Shimadzu CLASS-VP软件，5.3版。检测在220nm下进行。具有0.1％TFA(A)的水和具有0.1％TFA(B)的乙腈在1ml/分钟的流速和线性梯度(1％B/分钟)的情况下用作洗脱剂。视化合物而定，对分析型PHLC采用不同的起始条件，其在相应的化合物的情况下说明。
使用Phenomenex公司的5μm C18(2)

250x4.6mm Jupiter柱来分析所有经聚乙二醇-修饰的活性物质。
1.2制备型HPLC 对于制备型RP-HPLC，使用Shimadzu公司的HPLC装置，其由分系统LC-8A制备型泵(2x)、DGU-14A除气器、FRC-10A级分收集器、SCL-10A系统控制器、SPD-10A UV-Vis检测器和一个Phenomenex公司的Luna 5μm C8(2)

250x30.0mm柱组成，使用附带的Shimadzu CLASS-VP软件，5.3版。检测在220nm下进行。具有0.1％TFA(A)的水和具有0.1％TFA(B)的乙腈在10或20ml/分钟的流速和适当的线性梯度的情况下用作洗脱剂。
1.3质谱 质谱按标准在Finnigan公司(Bremen，Germany)的ESI-MS LCQ上测量。将所有聚乙二醇-偶联化合物在Bruker公司的MaldiUltraflex Tof/Tof仪器上进行分析。
使用的缩写 ACN 乙腈 4-Amba 4-脒基苄胺 Ame 氨甲基 Boc 叔丁氧羰基 BSA 小牛血清白蛋白 Bzl 苄基 Bzls 苄基磺酰基 DIEA 二异丙基乙胺 DCM 二氯甲烷 DMF N，N-二甲基甲酰胺 HBTU 2-(1H-苯并三唑-1-基)-1，1，3，3-四甲基脲六氟磷酸 HPLC 高效液相色谱 i.V. 在真空中 LM溶剂 MS质谱仪 ONHS N-羟基琥珀酰亚胺酯 NMM N-甲基吗啉 PEG 聚乙二醇 Phe(3-Ame) 3-氨甲基苯丙氨酸 Ppg 苯基丙基甘氨酸 RT室温 tBu 叔丁基 Tfa 三氟乙酰基 TFA 三氟乙酸 TEA 三乙胺 TMS-Cl氯化三甲基硅烷 Me甲基 2.抑制剂的合成 2.1 3-HOOC-Bzls-d-Ppg-Phe(3-Ame)-4-Amba x 2乙酸盐(3)
a)Boc-Phe(3-Ame)-OH x乙酸盐
将5g(17.2mmol)Boc-Phe(3-CN)-OH(Acros Organics)溶于700ml 90％的醋酸中并在常压下用氢和作为催化剂的800mg 10％Pd/C于40℃下氢化3小时。在真空下除去LM，将残留物溶于少量的甲醇中并通过添加二乙醚进行沉淀。
产率4.1g(HPLC16.7分钟，始自10％B) b)Boc-Phe(3-Tfa-Ame)-OH
将4.6g(13mmol)Boc-Phe(3-Ame)-OH x乙酸盐溶于30ml甲醇中，并在室温下混以4ml(29.9mmol)DIEA和2ml(16.78mmol)三氟乙酸乙酯。搅拌所得混合物，约15分钟后最初的悬液被彻底溶解。一小时之后，在真空下除去LM并将残留物溶于醋酸酯和水中。醋酸酯相用5％KHSO4溶液洗涤2次并用饱和NaCl溶液洗涤3次，并将有机相用Na2SO4干燥。在真空下除去LM。
产率4.9g无定形固体(HPLC28.13分钟，始自20％B) c)Boc-Phe(3-Tfa-Ame)-4-(乙酰基羟基脒基)苄基酰胺
将5.43g(13.9mmol)Boc-Phe(3-Tfa-Ame)-OH和4.28g(15.3mmol)4-(乙酰基羟基脒基)苄胺(合成描述于Schweinitz等人，2004的增补本中)溶于50ml DMF并于0℃下与5.2ml(30mmol)DIEA和5.81g(15.3mmol)HBTU混合。将所得混合物在0℃下搅拌15分钟并在室温下进一步搅拌3h。在真空下除去溶剂，将残留物溶于醋酸。醋酸酯相用5％KHSO4溶液洗涤3次，用饱和NaCl溶液洗涤1次，用饱和NaHCO3溶液洗涤3次并用饱和NaCl溶液洗涤2次。抽滤两相之间析出的产物并在真空下干燥。
产率4.17g白色结晶(HPLC28.08分钟，始自20％B) d)H-Phe(3-Tfa-Ame)-4-(乙酰基羟基脒基)苄基酰胺x HCl
将4.1g Boc-Phe(3-Tfa-Ame)-4-(乙酰基羟基脒基)苄基酰胺悬浮于60ml干燥的二噁烷中并与11ml二噁烷中的4N HCl混合。在短暂的超声处理后，将所得混合物在室温下摇动1小时。1小时之后通过添加二乙醚使产物沉淀，抽滤并在真空下干燥。
产率3.8g白色固体(HPLC9.47分钟，始自20％B) e)3-MeOOC-Bzl-SO3-x Na+
将5g(21.8mmol)3-溴甲基苯甲酸甲酯(Acros Organics)悬浮于25ml水中并混以2.94g(23.8mmol)Na2SO3。将所得混合物在回流下加热5小时，然后在真空下部分地除去溶剂，直至开始结晶。将混合物在4℃过夜保存并过滤出产物。
产率3.7g白色结晶(HPLC12.02分钟，始自10％B) f)3-MeOOC-Bzls-Cl
将2.5g(9.91mmol)3-MeOOC-Bzl-SO3-x Na+用磷酰氯润湿并混以2.27g(10.9mmol)PCl5。将所得混合物在0℃下冷却约5分钟然后在油浴中加热4小时(浴温80℃)。此后将所得混合物倒在冰上并剧烈搅拌。搅拌约30分钟之后，酰氯开始析出，抽滤并在真空下干燥。
产率1.4g白色固体 g)3-MeOOC-Bzls-d-Ppg-OH
将1.3g(6.72mmol)H-d-Ppg-OH(Peptech，Burlingtom，MA)悬浮在90ml干燥DCM中并混以2ml(15.7mmol)TMS-Cl和2.6ml(15mmol)DIEA。将所得混合物在回流下加热1小时，将透明的溶液冷却至0℃并混以2g(8mmol)3-MeOOC-Bzls-Cl和2.6ml DIEA。将混合物在0℃下搅拌15分钟并在室温下搅拌1.5小时。在真空下除去溶剂并将残留物溶于700ml半饱和的NaHCO3溶液中。将所得混合物用少量醋酸酯萃取2次，然后将水相用HCl(pH约2-3)酸化。将所得混合物用150ml醋酸酯萃取3次，将合并的醋酸酯相用5％KHSO4溶液洗涤2次并用饱和NaCl溶液洗涤1次。将有机相用Na2SO4干燥并在真空下除去溶剂。
产率2.4g油(HPLC33.53分钟，始自20％B) h)3-MeOOC-Bzls-d-Ppg-Phe(3-Tfa-Ame)-4-(乙酰基羟基脒基)苄基酰胺
将0.605g(1.5mmol)3-MeOOC-Bzls-d-Ppg-OH和0.85g(1.65mmol)H-Phe(3-Tfa-Ame)-4-(乙酰基羟基脒基)苄基酰胺x HCl溶于40ml干燥DMF中并在0℃下混以0.63g(1.65mmol)HBTU和0.6ml(0.34mmol)DIEA。将所得混合物在0℃下搅拌15min并进一步在室温下搅拌3小时。在真空下除去溶剂并将残留物溶于醋酸酯中。将醋酸酯相用5％KHSO4溶液洗涤3次，用饱和NaCl溶液洗涤1次，用饱和NaHCO3溶液洗涤3次并用饱和NaCl溶液洗涤2次。在真空下除去溶剂。
产率1.36g油(HPLC38.40分钟，始自20％B) i)3-MeOOC-Bzls-d-Ppg-Phe(3-Tfa-Ame)-4-脒基苄基酰胺x乙酸盐
将1.3g 3-MeOOC-Bzls-d-Ppg-Phe(3-Tfa-Ame)-4-(乙酰基羟基脒基)苄基酰胺溶于100ml 90％的乙酸中并在常压下用氢和作为催化剂的150mg 10％Pd/C氢化过夜。滤除催化剂，将滤液在真空下浓缩。
产率1.2g油(HPLC29.45分钟，始自20％B) 2.2 3-HOOC-Bzls-d-Ppg-Phe(3-Ame)-4-脒基苄基酰胺x 2乙酸盐(3)
将1.2g 3-MeOOC-Bzls-d-Ppg-Phe(3-Tfa-Ame)-4-脒基苄基酰胺x乙酸盐在由10ml二噁烷和10ml 1N LiOH组成的混合物中搅拌1.5小时。随即，通过加入TFA中和所得混合物，用制备型反相HPLC来纯化产物。将包含产物的级分合并并冻干。
产率0.4g呈TFA的盐(HPLC24.16min，始自10％B) MS计算值698.29实测值699.3(M+H)+ 将产物用制备型HPLC通过借助含有0.1％乙酸的上升乙腈梯度洗脱，转化为乙酸盐。
产率0.32g 相应于以上的合成描述合成其他抑制剂，其中构入作为d-苯基丙基甘氨酸的替代物的不同的经取代或未取代的苄基磺酰基残基和各种P3氨基酸。d-苯基丙基甘氨酸进一步的类似物用Heck偶联法合成并在P3位构入抑制剂中。所述合成可以例如如下地进行 2.3 Bzls-d-Gly(3-Cl-Phpr)-Phe(3-Ame)-4-Amba x 2TFA(6)
a)Bzls-d-Gly(烯丙基)-OH
将1.0g(8.68mmol)D-烯丙基甘氨酸(Peptech，Burlingtom，MA)悬浮于50ml干燥DCM中并混以2.4ml(19mmol)TMS-Cl和3.3ml(19mmol)DIEA。将所得混合物在回流下加热1小时，将透明的溶液冷却至0℃并混以2.35g(9.55mmol)Bzls-Cl和1.8ml DIEA。将所得混合物在0℃下搅拌15min并在室温下搅拌1.5小时。在真空下除去溶剂并将残留物溶于700ml半饱和的NaHCO3溶液中。将所得混合物用醋酸酯萃取2次，随后将水相用HCl酸化(pH约2-3)。将所得混合物用150ml的醋酸萃取三次，并将合并的醋酸酯相用5％KHSO4溶液洗涤2次并用饱和NaCl溶液洗涤1次。将有机相用Na2SO4干燥并在真空下除去溶剂。
产率2.2g油(HPLC21.1分钟，始自20％B) MS(ESI，m/e)267[M-1]- b)Bzls-d-Ala(3-Cl-苯乙烯基)-OH
将0.476g(1.48mmol)四正丁基溴化铵、0.34g(4.05mmol)NaHCO3、0.32g(1.34mmol)1-氯-3-碘苯和9mg(0.04mmol)乙酸钯(II)在由2.5ml DMF与2.5ml水组成的混合物中的悬浮液于室温下搅拌10分钟。向该悬浮液中加入在2.5ml DMF和2.5ml水中的0.4g(1.48mmol)Bzls-d-Gly(烯丙基)-OH的溶液并将所得混合物在45-50℃下加热4-6天，任选地重复补加少量催化剂。滤除催化剂，在真空下除去溶剂并将残留物悬浮于50ml的5％KHSO4溶液中。将所得混合物每次用15-20ml的醋酸酯萃取3次，将合并的醋酸酯相用5％KHSO4溶液洗涤2次并用饱和NaCl溶液洗涤1次。将有机相用Na2SO4干燥并在真空下除去溶剂。将残留物(0.55g黑色油)用快速色谱在硅胶60(40-63μM)(梯度0-20％在DCM中的甲醇)上纯化。
产率0.23g(HPLC39.7分钟，始自20％B) 抑制剂的进一步构建的进行类似所述的抑制物1的合成。类似方法2h，将中间体2.2.b与中间体2d(H-Phe(3-Tfa-Ame)-4-(乙酰基羟基脒基)苄基酰胺x HCl)偶联。所获得的中间体的氢化类似方法2i地进行，但在这种情况下丝毫观察不到P3氨基酸的Cl原子的裂解。在最后一个步骤中三氟乙酰基保护基团的解离借助于二噁烷中的LiOH类似在化合物3的制备中的最后合成步骤地进行。
HPLC29.04分钟，始自10％B MS计算值688.26实测值689.2(M+H)+ 2.4 3-HOOC-Bzls-d-Ppg-Phe(3-Ame)-4-胍基苄基酰胺x 2乙酸盐(4)
类似上面的合成描述2.2a-i还合成了化合物4，其中使用对硝基苄胺代替4-(乙酰基羟基脒基)苄基酰胺用于步骤c)。用甲醇/THF(1∶1)作为溶剂类似步骤2.2i地将硝基苄胺残基还原成对氨基苄胺。对氨基苄胺残基的胍基化用商购可得的1，3-二-Boc-2-(三氟甲基磺酰基)胍(Fluka)作为胍基化试剂来进行。为此，将由还原得到的中间体溶于二噁烷中，并用所述胍基化试剂与TEA在50℃下搅拌一天。待去除溶剂之后，以已知的方式用TFA使Boc保护基团解离。待去除溶剂之后，在最后一个步骤中三氟乙酰基-保护基团和甲基酯的裂解借助于二噁烷中的LiOH类似在化合物3中的制备的最后合成步骤地进行。
HPLC25.1分钟，始自10％B MS计算值713.3实测值714.4(M+H)+ 2.5PEG化的化合物 用标准方法合成共价偶联有不同链长的聚乙二醇(PEG)链的其它抑制物。对于所有合成均使用具有不同的平均分子量(1000Da，2000Da，5000Da，10000Da)的Fluka公司、Nektar Therapeutics公司或RappPolymere公司的商购可得的PEG衍生物。所使用的PEG衍生物在一端以甲基酯进行保护和在另一端用N-羟基琥珀酰亚胺酯活化的丙酸残基或琥珀酸残基修饰。因此，该活化的PEG衍生物与抑制剂的游离氨基基团反应(见合成示意

图1至5)。在最后一个步骤中，通过混以1NNaOH溶液，解离TFA保护基团并将产物通过离子交换色谱在Fractogel

CE(Merk KGaA，Darmstadt)上借助于乙酸铵梯度纯化并从水中冻干3次。下面的实施例产生了平均摩尔质量约1000、2000、5000或10000Da的具有PEG链的抑制剂。
示意图1
示意图2
示意图3
示意图4
示意图5
将根据实施例合成的化合物，包括其抑制常数，总结于下表中。
3.对纤溶酶和PK的抑制常数(Ki值以nM计)的测定 对各种酶的抑制效应的测定类似已知方法(Stürzebecher等人，1997)地进行。
用于测定人-纤溶酶和人-血浆激肽释放酶的反应于25℃在下面的混合物中进行 -200μl TBS(0.05M三羟甲基氨基甲烷；0.154M NaCl，2％乙醇，pH 8.0；包含所述抑制剂) -25μl底物(用于纤溶酶，LOXO公司的2mM、1mM和0.67mMTosyl-Gly-Pro-Lys-pNA＝Chromozym PL；用于PK，Chromogenix公司的2mM、1mM和0.5mM H-D-Pro-Phe-Arg-pNA＝S2302，溶于H2O中) -50μl酶溶液(纤溶酶来自Calbiochem公司2-5mU/ml在0.154M NaCl+0.1％BSA m/v+25％v/v甘油中；血浆激肽释放酶来自Enzyme Research Lab.公司20-60ng/ml在0.154M NaCl+0.1％BSA m/v中)。
对于零级动力学，在20分钟后通过加入25μl乙酸(50％v/v)来终止反应，405nm处的吸收借助酶标仪(Microplate Reader)(Multiscan Ascent，Thermo公司)来测定。在假一级动力学的情况下，平衡状态的反应速率通过记录反应动力学来获取。Ki值根据Dixon(1953)用计算机程序通过线性回归或者通过相应的竞争性抑制的速率方程的参数拟合来确定。Ki值是至少两次测定的平均值。
表格 Ki值A表示＜10nM，B表示＜100nM，C表示＜1000nM和D表示＞1000nM 第1组 第2组 PEG化的化合物 结果 1.纤溶酶抑制的Ki值一般＜100nM。尤其是在R2和R3处具有环状结构的化合物的情况下，Ki-值明显低于100nM，并且在R2和R3处具有芳族碳环的化合物的情况下，Ki值低于约10mM。令人惊奇地，存在特别大量的具有低于5nM的Ki值的本发明化合物，例如编号1-11、13、14、16-18、20-33、35、38、39、46和48-56的化合物。
2.同样地，血浆激肽释放酶抑制的Ki值一般＜100nM。尤其是在R2和R3处具有芳族碳环的化合物的情况下，Ki-值明显低于100nM。令人惊奇地，存在特别大量的具有低于1nM的Ki-值的本发明化合物，例如编号1-3、5-6、8-25、27、29、34-36、39、40、49-57、59-61、64、65和68-70的化合物。
3.通过在P3处构入高酪氨酸或吡啶和相应的N-氧化物作为杂环，可以明显地降低对FXa的选择性。
4.当R1为3-COOH基团时，通常，可以达到凝血酶抑制的明显降低。当R4为氟原子时，尤其是在邻位时，可以达到凝血酶抑制的进一步降低。
5.特别适宜的化合物证明为具有下列残基的、具有i＝0和无R4的根据式(I)的化合物。

参考文献 Asghar et al.，Biochim Biophys Acta，438，250-264，1976 Collen et al.，J.Lab.Clin.Med.，99，76-83，1982 Dixon et al.，Biochem.J.，55，170-171，1953 Gustafsson et al.，Thromb.Res.，79，110-118，1998 Mangano et al.，New Engl.J.Med.，354，353-365，2006 Muramatu und Fuji，Biochim.Biophys.Acta，242，203-208，1971 Muramatu und Fuji，Biochim.Biophys.Acta，268，221-224，1972 Muramatu et al.，Hoppe-Seyler′s Z.Physiol.Chem.，363，203-211，1982 Ohno et al.，Thromb.Res.，19，579-588，1980 Okada et al.，Chem.Pharm.Bull.，48，1964-1972，2000 Okada et al.，Biopolymers，51，41-50，1999 Okada et al.，Bioorg.Med.Chem.Lett.，10，2217-2221，2000 Okamoto et al.，Thromb.Res.，Suppl.VIII，131-141，1988 Sanders und Seto，J.Med.Chem.，42，2969-2976，1999 Satoh et al.，Chem.Pharm.Bull.，33，647-654，1985 Schechter und Berger，Biochem Biophys Res Comm，27，157-162，1967 Schmaier，A.H.，Journal of Clinical Investigation，109，1007-1009，2002 Schweinitz et al.，J.Biol.Chem.，279，33613-33622，2004 Sodha et al.，Expert Rev.Cardiovasc.Ther.，4，151-160，2006 Stürzebecher et al.，J.Med.Chem.，40，3091-3099，1997 Tada et al.，Biol.Pharm.Bull，24，520-524，2001 Teno et al.，Chem.Pharm.Bull.，39，2930-2936，1991 Tsuda et al.，Chem.Pharm.Bull.，49，1457-1463，2001 Xue und Seto，J.Med.Chem.，48，6908-6917，2005 US 5,602,253 US 6,472,393 US 2006/014890权利要求
1.通式(I)的化合物，
其中
R1，可选地，存在一个或多个并彼此独立地为COOR5残基，R5等于氢或支化的或线性的具有1-6个碳原子的低级烷基基团，优选甲基或乙基，尤其是甲基，支化或线性的具有1-6个碳原子的氨基烷基残基，优选甲基、卤素或假卤素残基，优选氯，或者氰基基团，或者式(II)或(III)的聚乙二醇残基
CH3-O-(CH2-CH2-O-)n-CH2-CH2-(C＝O)-NH-CH2-
(II)
CH3-O-(CH2-CH2-O-)n-CH2-CH2-NH-(C＝O)-CH2-CH2-(C＝O)-NH-CH2-
(III)
其中n如此定义，使得所述聚乙二醇残基具有10000Da、5000Da、3400Da、2000Da、1000Da或750Da的平均分子量，优选n为约25至约250的整数，尤其为约18、约25、约50、约85、约125或约250；
R2可选地经取代的具有5-13个碳原子的芳族或非芳族环或二环或者具有4-5个碳原子和一个氮原子、氮氧化物、氧原子或硫原子，尤其是氮原子或氮氧化物的芳族杂环；或结构如下的残基
R3可选地经取代的具有5-6个碳原子的芳族环或具有3-5个碳原子和1-2个氮原子、一个氮氧化物、氧原子或硫原子，尤其是氮原子或氮氧化物的芳族杂环；
R4可选地存在一个或多个的卤素残基，优选氟；
o＝1、2或3，尤其是1；
p＝0、1、2或4，尤其是3；和
i＝0或1，尤其是0；
以及其外消旋混合物和与有机酸或无机酸的盐。
2.根据权利要求1的化合物，其特征在于，R1存在一个并在间位或对位，优选R1为COOH残基，尤其是，R1存在一个并且选自氢、4-COOH基团或尤其是3-COOH基团。
3.根据权利要求1或2的化合物，其特征在于，R2为具有6-13个碳原子的芳族环或二环或者具有5个碳原子和一个氮原子的杂环。
4.根据权利要求1至3之一的化合物，其特征在于，R2处的取代基为卤素残基，优选氯或氟，尤其是氯；可选地经氟取代的、支化的或线性的具有1-6个碳原子的烷基残基，优选甲基或叔丁基；可选地经氟取代的、支化的或线性的具有1-6个碳原子的烷氧基残基；优选甲基、羟基残基或氰基残基。
5.根据权利要求1或2的化合物，其特征在于，R2为具有6个碳原子的非芳族环。
6.根据权利要求1至5中任一项的化合物，其特征在于，R3处的取代基为碱性残基。
7.根据权利要求1至6中任一项的化合物，其特征在于，R3处的取代基为具有1-3个优选3个碳原子的烷基氨基残基，为脒基残基或胍基残基。
8.根据权利要求1至7中任一项的化合物，其特征在于，所述盐由盐酸、HBr、乙酸、三氟乙酸或甲苯磺酸形成。
9.根据权利要求1至8中任一项的化合物，其特征在于， R2选自下列残基
尤其是
10.根据权利要求1至9中任一项的化合物，其特征在于，R3选自
尤其是
11.根据权利要求1至10中任一项的化合物，其特征在于，所述化合物如下定义
12.通式(IV)的化合物
其中
R1，可选地，存在一个或多个并且彼此独立地是COOR5残基，R5等于氢或支化或线性的具有1-6个碳原子的低级烷基基团，优选甲基或乙基，尤其是甲基，支化或线性的具有1-6个碳原子的氨基烷基残基，优选甲基、卤素或假卤素残基，优选氯，或者氰基基团，或者式(V)或(VI)的聚乙二醇残基
CH3-O-(CH2-CH2-O-)n-CH2-CH2-(C＝O)-NH-CH2-
(V)
CH3-O-(CH2-CH2-O-)n-CH2-CH2-NH-(C＝O)-CH2-CH2-(C＝O)-NH-CH2-
(VI)
其中n如此定义，使得所述聚乙二醇残基具有10000Da、5000Da、3400Da、2000Da、1000Da或750Da的平均分子量，优选n为约25至约250的整数，尤其为约18、约25、约50、约85、约125或约250；
R2可选地支化或线性的具有1-6个碳原子的烷氧基残基，优选叔丁基，羟基残基，氨基残基或支化的或线性的具有1-6个碳原子的烷氧基羰基氨基残基，优选叔丁基，或具有如上所定义的n的式(V)或(VI)的聚乙二醇残基；
R3选自下列残基
优选
R4可选地存在一个或多个的卤素残基，优选氟；
o＝1或2；
p＝1、2、3或4，优选是1或4；
i＝0或1，尤其是0；
以及其外消旋混合物和与有机酸或无机酸的盐。
13.根据权利要求12的化合物，其特征在于，R1存在一个并在间位或对位，优选R1为氢或COOH残基，尤其是，R1存在一个并且选自氢、4-COOH基团或3-COOH基团。
14.根据权利要求12-13中任一项的化合物，其特征在于，所述盐由盐酸、HBr、乙酸、三氟乙酸、或甲苯磺酸形成。
15.根据权利要求12-14中任一项的化合物，其特征在于，所述化合物如下定义
16.制备根据权利要求1-15中任一项的化合物的方法，其特征在于，将相应的氨基酸依次偶联到脒基或胍基基团处被保护的脒基苄胺或胍基苄胺上，其中N末端氨基酸已经带有P4残基，或者P4残基随即被连接上去，并随后将所获得的化合物可选地纯化和可选地PEG化。
17.制备根据权利要求1-15中任一项的化合物的方法，包括下列步骤
(a)用相应的被保护的氨甲基苯甲脒或氨甲基苯甲胍来酰胺化带有R3残基的相应的Nα-保护的氨基酸，
(b)使具有R3的氨基酸的Nα保护基团解离，所获得的产物与具有R1和R2残基的相应的苄基磺酰基氨基酸反应和剩余的保护基团解离而产生式(I)的化合物，并且在可能的纯化之后，
(c)可选地将所获得的化合物PEG化。
18.包含至少一种根据权利要求1-15中任一项的化合物的药物。
19.根据权利要求17的药物用于处理失血，尤其在纤溶亢进状态的情况下、在器官移植和尤其是带有心肺转流的心脏外科手术的情况下。
20.包含至少一种根据权利要求1-15中任一项的化合物的纤维蛋白粘合剂。
21.至少一种根据权利要求1-15中任一项的化合物用于制备根据权利要求18或19的药物或者根据权利要求20的纤维蛋白粘合剂的用途。
全文摘要
本发明涉及通式(I)的胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶抑制物，其除了抑制纤溶酶外，还抑制血浆激肽释放酶，及其制备和作为药物的用途，所述药物优选用于处理失血，尤其在纤溶亢进状态的情况下、在器官移植或尤其是带有心肺转流的心脏外科手术的情况下，或者作为纤维蛋白粘合剂的成分。
文档编号C07C311/33GK101541742SQ200780043696
公开日2009年9月23日 申请日期2007年10月24日 优先权日2006年10月24日
发明者T·斯特恩梅特泽, A·施维尼兹, J·斯图尔泽贝彻, P·斯特恩梅特泽, A·泽芬, A·范德罗驰, S·尼克里施, C·里彻尔特, F-A·路德维格, A·舒尔茨, M·达基施, J·赫尼克 申请人:药物公司(莱比锡)有限公司