一种褐虱蛋白翻译延伸因子NlEF1γ、编码蛋白及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及基于基因沉默技术的褐飞虱蛋白质翻译延伸因子NlEFly基因、编码 蛋白及其应用。 (二）
【背景技术】
[0002] 水稻是现在世界上的其中一种最主要的粮食作物，以水稻为主食的人口占世 界上人口的一半以上。而同翅目飞虱科褐飞虱（Ni Iaparvata 1 μ gens Stdl ) (Brown planthopper)通过吸食韧皮部的光合产物而直接危害水稻，除此之外还会传播水稻病毒造 成间接危害，是对水稻危害最大的害虫之一。因此，有效地控制水稻害虫对水稻增产具有重 要意义。
[0003] 目前，控制褐飞虱致害性的首要方法是化学杀虫剂如吡虫啉、噻嗪酮、仲丁威及异 丙威，但随着吡虫啉大范围高频次的使用，稻飞虱对其抗药性快速提高，各地反映其对稻飞 虱的效果大不如前。其次是培育抗性水稻品种，但由于褐飞虱的强适应性，化学农药容易导 致产生抗药性种群和飞虱的再猖獗，抗性水稻的培育和种植虽对环境友好但也由于能克服 寄主抗性的新褐飞虱致害性种群出现，导致其危害越来越严重。
[0004] RNA干涉技术（RNA interference，RNAi)是一种广泛存在于动植物中的现象。其 原理是将靶基因正义RNA和反义RNA组装成的双链RNA (dsRNA)导入细胞，dsRNA在双链特 异核糖核酸酶的作用下被切割成21-25核苷酸的小干扰RNA(SiRNA)，siRNA与某些作用因 子结合形成RNA诱导沉默复合物，该复合物在RNA解旋酶、核酸内切酶和外切酶的作用下， 可将靶基因的转录产物mRNA特异地降解，进而抑制了目的基因的表达。该技术目前在基因 功能验证以及害虫防治中都取得了成功。在植物介导的RNAi中，由于有害生物的基因是通 过有目的地选择性插入到植物，所以其对靶标生物的抗虫作用是特异的，同时RNAi介导的 抗虫性是依赖于RNA序列的杂交配对，这种作用机制比依赖于蛋白质之间相互作用的要持 久，它不会因为少量核苷酸的突变被抑制，因此，昆虫克服这种抗性的可能性比较小。在鳞 翅目棉铃虫（Mao et al.，2007)和玉米根萤叶甲（Baum et al.，2007)鞘翅目中通过转基 因植株产生dsRNA沉默昆虫基因以达到防治害虫的目的已有报道。虽然如此，但由于缺乏 对害虫功能基因的深入了解，目前利用该技术来实现对害虫的控制作用还远不如转Bt基 因的植物。要利用表达dsRNA的转基因植物来控制害虫，首选需要筛选出合适的可供转入 植物的靶标基因，这种基因在转录水平的降低能致使害虫发育受阻，可导致高的死亡率。同 时该基因与目标植物无高度相似的序列。
[0005] 蛋白质翻译延伸因子（translation elongation factor，EF)具有三磷酸鸟苷 (GTP)或鸟苷二磷酸（GDP)亲和性，参与肽链的延伸过程。在真核细胞中，主要有eEFl 和 eEF2。其中 eEFl 由 4 个亚基 EF-I a (51kDa), EF-I β '（26kDa), EF-I β (33kDa)and EF-I y(49kDa)组成（Kidou et al·, 1998 ;Ejiri·, 2002)。EF-Ia 由一个多基因家族编 码，不同的物种具有不同数量的EF-Ia同源基因。且EF-Ia高度保守，而EF-Ιγ基因为 单拷贝基因，不同物种间差异比较大。目前在昆虫中仅有报道利用RNAi技术沉默斜纹夜蛾 (Spodopteraexigua)的EF-lβ'基因，发现沉默后36h时存活率为58·7%显著低于对照 (Zhao et al.，2012)。本专利发明是克隆了褐飞虱的EF-Ιγ基因命名为NIEFly，通过比对 发现核苷酸序列与Papilio xuthus AY077628.1相似度最高为，蛋白序列与幢虫（Locusta migratoria)相似度最高为64%。在此基础上合成该基因的dsRNA，体外喂食和注射该基因 的dsRNA发现，褐飞虱若虫体内目标基因表达显著表达，死亡率显著增加。雌成虫卵巢停止 发育而不能正常产卵。本发明为建立利用RNA干扰技术控制褐飞虱的新策略提供了序列和 数据基础。 (三）
【发明内容】
[0006] 本发明目的是提供一种从水稻褐飞虱中克隆NlEFl γ基因的cDNA序列，该序列的 dsRNA以及蛋白质序列，通过饲喂和注射提供了该基因的dsRNA，达到防治褐飞虱的目的， 为抗褐飞虱转基因水稻的研宄开发提供了新的基因来源。
[0007] 本发明采用的技术方案是：
[0008] 本发明提供一种褐虱蛋白翻译延伸因子NlEFl γ，所述延伸因子NlEFlY的核苷 酸序列为SEQ ID NO. 1所示。
[0009] 本发明还提供一种所述褐飞虱蛋白翻译延伸因子NlEFly编码的蛋白，所述编码 蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO. 2示。
[0010] 本发明所述褐虱蛋白翻译延伸因子NlEFl γ克隆方法包括如下步骤：
[0011] 1)取褐飞虱，提取总RNA，合成cDNA第一条链；
[0012] 2)以步骤1合成的第一条链为模板，以序列SEQ ID NO. 3所示的NlEFl γ -F为上 游引物，以SEQ ID NO. 4的NlEFly-R为下游引物进行RT-PCR扩增；
[0013] 3)PCR产物经琼脂糖胶电泳分离，回收1324bp处的目标DNA片段；
[0014] 4)回收片段在T3连接酶作用下插入至pCR? 2. 1载体中，转化到大肠杆菌DH5a， 涂于含有X-gal，IPTG和卡那霉素的LB培养基，37°C过夜培养；
[0015] 5)挑选白色单菌落，用含卡那霉素的LB培养液将阳性克隆扩增，提取克隆质粒 ρΤΟΡ-NlEFly ；
[0016] 6)质粒pTOP-NlEFl γ测序，得到SEQ ID NO. 1所示NlEFl γ基因片段。
[0017] 其中RT-PCR扩增体系为：包含3.0yL稀释后的cDNA，上下游引物各20pmol， 0.2mM dNTP，IX PCR buffer，2. 5units of r_Taq DNA polymerase (Takara)，共 25 μ LoPCR 扩增程序为：95°C变性2min ;35个循环的95°C变性30s，58°C退火30s，72°C延伸90s ;最后 72°C延伸 lOmin。
[0018] 本发明涉及由所述褐飞虱蛋白翻译延伸因子NlEFl γ合成的dsRNA，所述dsRNA的 核苷酸序列为SEQ ID NO. 5示，其合成方法包括：
[0019] 1)根据已验证的NlEFl γ基因片段序列，设计并合成序列为SEQ ID NO. 6所示的 引物dsNIEFly-F和SEQ ID N0.7所示的dsNIEFly-R引物。以含NlEFly基因的质粒 ρΤΟΡ-NlEFly为模板，以序列SEQ ID NO. 6为上游引物，以SEQ ID NO. 7为下游引物进行 PCR扩增，以得到含有T7启动子的NlEFl γ基因片段。
[0020] 2)回收步骤1获得的PCR产物，以此扩增产物为模板，体外转录合成NlEFl γ的 (^1?隱。合成体系为：模板约1.5-2即，2.(^1^10\了7131^€61'，2.(^1^六了？，2.(^1^6丁？， 2.0卩1^0?，2.0卩1^爾，2.0卩1^76晴1116，共20.0卩1^37。。保温5小时，72。。灭活5分 钟；合成dsRNA经降解去除DNA和单链RNA后，纯化获得dsRNA。
[0021] 其中质粒？0?扩增体系为：1.(^1^质粒0嫩，上下游各2(^111〇1，0.21111(1阶1 3，1\?0? buffer，2.5units of r_Taq DNA polymerase(Takara)，共 25μΙ^ΡΟ?扩增程序为：95°C 变 性2min ;35个循环的95°C变性30s，58°C退火30s，72°C延伸40s ;最后72°C延伸lOmin。
[0022] 本发明还涉及一种褐飞虱蛋白翻译延伸因子NlEFly在制备防治褐飞虱药物中 的应用，具体所述的应用是通过将NlEFl γ合成的dsRNA显微注射或饲喂褐飞虱达到防治 的目的。
[0023] dsRNA的褐飞虱饲喂方法，包含如下步骤：
[0024] 1)将玻璃管一端用封口膜封好，封口膜正中央用移液枪加入含dsRNA的饲料 70 μ L，用一个新的封口膜，将饲料和dsRNA封在两层膜之间；
[0025] 2)用吸虫器吹入30头2龄褐飞虱若虫，用灭菌纱布将玻璃管另一开口端封好；
[0026] 3)将玻璃管平放，玻璃管上方盖一层湿润的黑布保湿，有饲料的一端对着光源，饲 养温度26°C。每48h换一次饲料。
[0027] dsRNA的褐飞虱显微注射方法，包含如下步骤：
[0028] 1)制作固定褐飞虱的琼脂糖胶凹槽：配制浓度为2. 0-2. 5wt%的琼脂糖胶，将溶 化后的琼脂糖胶倒入直径9cm的培养皿中，琼脂糖胶的高度略高于培养皿，培养皿上方放 置4-5根直径0. 5-0. 8_的毛细管。待琼脂糖胶冷却后，去掉毛细管，即得到可固定褐飞虱 的琼脂糖胶凹槽；
[0029] 2)将褐飞虱若虫吹入玻璃试管中，用CO2麻醉1分后，将褐飞虱倒入提前装有琼脂 糖凝胶的培养皿中，用软毛笔将褐飞虱整齐的摆放在琼脂糖胶的凹槽中；
[0030] 3)利用eppendorf显微注射仪（型号TransferMan NK2,上海艾本德公司），在褐 飞虱胸部中足基部柔软的地方每个褐飞虱注射0. 1 μ LdsRNA，dsRNA浓度700ng/ μ L ;
[0031] 注射后褐飞虱接种于分蘖盛期的水稻品种（Taichung Native I) TNl上，每个水稻 单株用笼罩罩住，每个笼罩中接入30头虫，并将笼罩放置于带水的大水盆中，控制室内温 度在25 ± I °C，湿度80 %左右。每日观察褐飞虱的存活率。
[0032] 与现有技术相比，本发明的有益效果主要体现在：
[0033] 本发明提供一种褐飞虱蛋白翻译延伸因子NlEFly，编码蛋白，合成的dsRNA ;该 基因在维持褐飞虱正常的生长发育过程中发挥重要功能，其功能受到抑制会导致褐飞虱若 虫生长变缓，体型变小，不能正常发育至成虫而死亡；雌成虫中其功能受到抑制会导致卵巢 停止发育，雌虫不能正常产卵；本发明就是利用该基因片段的dsRNA注射和喂养褐飞虱，均 可使褐飞虱的死亡率达70%，产卵量为0,为建立利用RNA干扰技术控制害虫的新策略提 供序列和数据基础；本发明利用注射或饲喂的RNAi技术沉默蛋白质合成延伸elongation factor Igamma基因，对褐飞虱具有明显的致死和抑制卵巢发育的效果，说明该基因可作为 利用RNAi技术控制害虫的有效靶点。 (四）【附图说明】
[0034] 图1为NlEFly基因片段扩增电泳图，泳道M为IOObpDNA ladder ;泳道1为空白 对照，泳道2和3为扩增的NlEFl γ基因片段。
[0035] 图2为NlEFl γ基因 dsRNA合成电泳图，泳道M为IOObp DNA ladder ;泳道1为 NlEFl γ 基因 dsRNA。
[0036] 图3为3龄褐飞虱注射dsRNA的死亡率比较，*表示处理与对照有显著差异 (ρ〈0· 05)，校正死亡率=(处理死亡率-对照死亡率）八100_对照死亡率）X 100%。
[0037] 图4为2龄褐飞虱饲喂dsRNA对死亡率的影响，*表示处理与对照有显著差异 (ρ〈0· 05)，校正死亡率=(处理死亡率-对照死亡率）八100_对照死亡率）X 100%
[0038] 图5为5龄褐飞虱注射dsRNA对卵巢发育的影响，A为对照初羽化后IOd的卵巢； B为处理初羽化后IOd的卵巢。 (五）【具体实施方式】
[0039] 下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于 此：
[0040] 实施例UNlEFl γ基因的克隆，dsNIEFI γ的合成
[0041] DNlEFly基因的克隆
[0042] 利用Qiagen公司的RNeasy Mini kit (74106)提取5-10头褐飞虱整虫RNA，用 Toyobo公司的ReverTra AceqPCR RT Kit试剂盒合成cDNA序列，10 μ L合成体系含Ing RNA，2. 0 yL 5xRT bufTer，0.5yL primer mix，0.5 yL RT enzyme 1111叉。37。〇保温 45 分钟， 98°