鲍曼不动杆菌1a1s_1969重组蛋白及其制备方法和应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物技术领域，涉及一种鲍曼不动杆菌1A1S_1969蛋白及其制备方法 和应用。
【背景技术】
[0002] 鲍曼不动杆菌（Acinetobacter baumannii)为非发酵革兰阴性杆菌，广泛存在于 自然界的水及土壤、医院环境及人体皮肤、呼吸道、消化道和泌尿生殖道中，为条件致病菌。 感染的病人多是老年患者、危重疾病及机体抵抗力弱的患者，以及使用各种侵入性操作和 长期使用广谱抗生素治疗的患者。国内资料表明，鲍曼不动杆菌约占临床分离的不动杆菌 的70%以上。鲍曼不动杆菌对第三代和第四代头孢菌素的耐药率已达63. 0%~89. 9%。 对四种氨基糖苷类（阿米卡星、庆大酶素、奈替米星、妥布霉素）和环丙沙星的耐药率菌达 96. 3%。随着鲍曼不动杆菌耐药性的发展，且治疗鲍曼不动杆菌引起的感染性疾病也变得 日益复杂，因此研发安全有效的预防性和治疗性疫苗已经成为预防和治疗鲍曼不动杆菌引 起的感染性疾病的重要趋势。
[0003] 目前在国内外还没有鲍曼不动杆菌进入临床研宄，在疫苗的研发中优势抗原的选 择十分重要，传统的全菌疫苗所含疫苗成分复杂，并且有一定的毒副作用，因此安全性不 高。目前国外一些学者对鲍曼不动杆菌外膜复合物疫苗进行了初步研宄，但是外膜复合物 成分复杂，同时含有大量的内毒素，对机体的毒副作用较大。因此研发一种质量可控，安全 有效的鲍曼不动杆菌疫苗是必然的趋势。
[0004] 在以往的疫苗研发中细菌外膜蛋白是一种较好的候选抗原，细菌外膜含有丰富的 抗原，外膜抗原在早细菌感染初期具有粘附定植等作用，同时也能与机体产生相互作用，刺 激机体产生免疫反应。在Burkholderia multivorans疫苗研宄中，采用的外膜蛋白疫苗能 防止细菌早期的定植和感染；在脑膜炎奈瑟菌疫苗研宄中，外膜蛋白疫苗能激发机体产生 较高的血清抗体水平；同样在Francisella tularensis疫苗研宄中证实膜外蛋白对哺乳 动物具有良好的保护性；同时在绿脓假单胞杆菌疫苗早期人体试验中，显示外膜蛋白就有 良好的安全性和免疫原性；以上研宄均证实了在革兰氏阴性菌中，外膜蛋白含有多种抗原 可以激发机体产生抗体并与细菌表面抗原产生抗体中和作用，从而使外膜蛋白有望成为疫 苗候选抗原。
【发明内容】
[0005] 本发明提供一种鲍曼不动杆菌1A1S_1969重组蛋白及其制备方法和应用，该重组 蛋白表达量高，便于分离纯化，高效安全，可以直接与佐剂配合使用，用于制备抗鲍曼不动 杆菌感染的亚单位疫苗以及相关的检测试剂盒。
[0006] 本发明利用反向疫苗学筛选出一种外膜蛋白，A1S_1969蛋白是存在于鲍曼不动杆 菌细胞壁上的一种蛋白，结构和功能未知。编码A1S_1969的基因表达出855个氨基酸的序 列，通过信号肽分析，该蛋白含43个氨基酸的信号肽序列，如图5所示。通过三维结构预测， 该成熟蛋白（44-855)可以分为主要含alpha螺旋部分（44-414)及主要含beta折叠部分 (415-855)，如图6所示。因此，本发明利用基因工程技术分别构建表达表达这两部分，得到 的重组蛋白分别被命名为1A1S_1969及2A1S_1969。
[0007] 鉴于A1S_1969蛋白含有一个信号肽，本发明截去A1S_1969(SEQ ID NO. 3)氨基 端1~45位氨基酸后并选取A1S_1969的第46~414位氨基酸序列（SEQ ID NO. 1)和第 415~855位氨基酸（SEQ ID NO. 7,其DNA序列如SEQ ID NO. 8所示）分别利用SEQ ID NO. 2及SEQ ID NO. 8作模板进行克隆、表达和酶切，优选地，获得1A1S_1969重组蛋白（SEQ ID NO. 5)，再进行免疫保护性的评价。
[0008] 本发明优选1A1S_1969重组蛋白，其制备时质量可控，纯化工艺简单快捷。该重组 蛋白在抵抗鲍曼不动杆菌致死性感染中有较高的免疫保护性，可用作制备抗鲍曼不动杆菌 感染的亚单位疫苗以及相关的检测试剂盒。
[0009] 本发明的技术方案具体如下：
[0010] 1A1S_1969的重组蛋白，包含A1S_1969的第46-414位氨基酸序列的成熟肽，该重 组蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO. 5所示。
[0011] 所述成熟肽的氨基酸序列如SEQ ID NO. 1所示，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 2所 不O
[0012] 所述重组蛋白通过标签蛋白GST融合表达，所述标签蛋白融合于所述1A1S_1969 蛋白的N端。
[0013] 该重组蛋白由融合表达并酶切后在成熟肽的氨基端加入GPLGS五个氨基酸形成。
[0014] 编码1A1S_1969重组蛋白的多核苷酸。
[0015] 所述多核苷酸的核苷酸序列如SEQ ID NO. 2或SEQ ID NO. 6所示或紧密结合在其 的一端或两端添加或缺失若干个核苷酸得到的编码与SEQ ID NO. 5所示蛋白具有相同或相 似功能的重组蛋白的序列。
[0016] A1S_1969重组蛋白的制备方法，包括以下步骤：
[0017] 1)根据编码1A1S_1969蛋白的核酸序列设计正向引物P1A1S1969B1(SEQ ID NO. 9)和反向引物P1A1S1969N2(SEQ ID NO. 10);根据编码2A1S_1969蛋白的核酸序列设计 正向引物 P2A1S1969B1(SEQ ID NO. 11)和反向引物 P2A1S1969N2(SEQ ID NO. 12);
[0018] 2)使用步骤1设计的正向引物和反向引物，通过PCR扩增出编码1A1S_1969蛋白 及2A1S_1969的基因片段；
[0019] 3)步骤2)所得的基因片段克隆至表达载体，然后转化至宿主菌；
[0020] 4)诱导转化后的宿主菌表达1A1S_1969重组蛋白和2A1S_1969融合蛋白；
[0021] 5)纯化重组蛋白。
[0022] 表达载体或宿主细胞，包含编码1A1S_1969重组蛋白的多核苷酸或宿主细胞。
[0023] 所述载体是pGEX-6P-2表达载体；所述宿主细胞是大肠杆菌，所述大肠杆菌是 XLl-Blue0
[0024] 抗1A1S_1969蛋白的抗体。
[0025] 1A1S_1969蛋白在制备预防或治疗鲍曼不动杆菌感染的药物中的应用。
[0026] 1A1S_1969蛋白在制备鲍曼不动杆菌检测试剂盒中的应用。
[0027] 本发明所述1A1S_1969蛋白，主要包含SEQ ID NO. 1的氨基酸，由于融合表达并酶 切后在氨基端加入GPLGS五个氨基酸形成如SEQ ID NO. 5所示的氨基酸序列。
[0028] 本发明用于表达1A1S_1969蛋白的重组表达载体，其包含编码所述1A1S_1969蛋 白的DNA序列以及载体序列。
[0029] 所述编码1A1S_1969蛋白的DNA序列可以是SEQ ID NO. 2或SEQ ID NO. 6,或在紧 密结合它们的的一端或两端添加或缺失若干个核苷酸后得到的编码与SEQ ID NO. 5所示蛋 白具有相同或相似功能蛋白的序列。
[0030] 本发明优选采用PGEX-6P-2质粒来构建重组表达载体，表达1A1S_1969融合蛋白， 其主要特点是所表达的融合蛋白中的氨基端接有一个26kDa的GST标签，该标签可作为蛋 白纯化标记。与其他融合载体相比，PGEX系列载体具有纯化条件温和、步骤简单、不需要变 性剂的加入，从而使纯化后的蛋白能最大限度保持其空间构象和免疫原性。
[0031] 本发明采用基因工程技术克隆表达此保护性抗原1A1S_1969重组蛋白，表达量 高，便于分离纯化，而且高效安全。1A1S_1969重组蛋白可以直接与佐剂（如Al (OH)3佐剂、 AlPO4佐剂、MF59、AS0 3、AS04、不完全弗氏佐剂、完全弗氏佐剂、等）配合使用，优选AlPO4K 剂用于肌肉注射免疫。
[0032] 本发明的基因工程重组蛋白的表达方法具有以下6个优点：
[0033] 1、A1S_1969蛋白及1A1S_1969蛋白均未用于重组亚单位疫苗领域；
[0034] 2、1A1S_1969蛋白的表达质粒在原核表达系统（大肠杆菌）中诱导表达，表达量 高，质量安全可控；
[0035] 3、选择pGEX-6p-2表达载体，1A1S_1969重组蛋白以融合蛋白形式表达，最大限度 保持了其原有的空间构象；
[0036] 4、所表达的融合蛋白中就含有个GST标签，此标签就成为蛋白纯化的标记，使 得纯化条件温和、步骤简单、不需要变性剂的加入，从而纯化后的蛋白能最大限度保持其空 间构象和免疫原性；
[0037] 5、1A1S_1969融合蛋白表达率约为30%，纯化后的1A1S_1969融合蛋白纯度大于 95% ；
[0038] 6、1A1S_1969融合蛋白能够诱导动物产生特异性的抗体。
[0039] 利用本发明1A1S_1969融合蛋白制备的亚单位疫苗可通过皮下（肌肉）注射途径 进行免疫接种，激发机体产生IgG抗体和细胞免疫应答。并经动物实验证实，所述基因工程 重组单价亚单位疫苗具有良好的抗鲍曼不动杆菌感染的免疫保护效果。为进一步的联合疫 苗和多亚单位融合疫苗研宄打下基础，同时为防治疫苗和诊断试剂盒的研制及应用具有重 要的作用。
[0040] 为了使本发明目的、技术方案及优点更加清楚明白，下面结合附图及实施例，对本 发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用 于限定本发明。
【附图说明】
[0041] 图1是1A1S_1969基因片段的PCR扩增结果，其中，泳道M :核酸（DNA)分子量标 准（Marker);泳道I :1A1S_1969基基因片段（1107bp)的PC