R扩增产物；
[0042] 图2为表达载体pGEX-6p-2-lAlS_1969的酶切鉴定结果：其中，泳道M :核酸（DNA) 分子量标准（Marker);泳道1-6 :重组表达质粒pGEX-6p-2-lAlS_1969经酶切后的鉴定结 果，其中泳道5-6均表示酶切后分离的片段4000bp和1107bp ;
[0043] 图3表示不同温度下诱导蛋白表达结果：其中，泳道M :蛋白分子量标准（Marker) 泳道I :pGEX-6p-2-lAlS_1969/XL-lblue表达菌载体在16°C下诱导表达后，在上清中获得 的GST融合蛋白，泳道2 :pGEX-6p-2-lAlS_1969/XL-lblue表达菌在30°C下诱导表达后，在 上清中获得的GST融合蛋白，泳道3 :pGEX-6p-2-lAlS_1969/XL-lblue表达菌在16°C下诱 导表达后，在沉淀中获得的GST融合蛋白，泳道4 :PGEX-6p-2-lAlS_1969/XL-lblue表达菌 在30°C下诱导表达后，在沉淀中获得的GST融合蛋白。
[0044] 图4表示pGEX-6p-2-lAlS_1969/XL-lblue表达菌在30°C下诱导表达后，上清中获 得含的GST融合蛋白，并用蛋白酶将GST标签切除后获得的1A1S_1969重组蛋白：其中，泳 道M :蛋白分子量标准（Marker);泳道1 :酶切后，获取的1A1S_1969重组蛋白；泳道2 :酶切 后，获取的1A1S_1969重组蛋白；泳道3 :酶切后，获取的1A1S_1969重组蛋白；
[0045] 图 5 利用在线信号肽分析软件 http://www. cbs. dtu. dk/services/SignalP-4. 0/ 对A1S_1969蛋白信号肽预测结果图，结果表明1-43位氨基酸为信号肽序列。
[0046] 图 6 利用 http://www. sbg. bio. ic. ac. uk/phyre2/ 在线软件对 A1S_1969 蛋白 三维结构的预测结果，结果表明该成熟蛋白（44-855)可以分为主要含alpha螺旋部分 (44-414)及主要含beta折叠部分（415-855)。
[0047] 图7是重组表达载体测序后与1A1S_1969蛋白的核酸序列对比结果，结果表明，获 得的序列与理论序列完全一致。
【具体实施方式】
[0048] 本发明所使用的菌株与各种试剂如下：
[0049] 1.菌株
[0050] 鲍曼不动杆菌17978国际标准株由美国ACTT提供；
[0051] 2.试剂
[0052] 质粒pGEX_6p_2 (购于GE公司）、pET_22b (购于Novagen公司）和大肠杆菌菌株 XL-I blue (购于普如汀公司）由申请人微生物教研室保存；
[0053] primeSTAR HS DNA Polymerase、DNA Marker、DNA Ligat ion Mix、限制性内切酶 BamH I和Not I、蛋白Marker为大连TakaRa公司产品；
[0054] 质粒提取试剂盒和凝胶回收试剂盒为美国Omega公司产品；
[0055] 细菌基因组提取试剂盒、超薄回收试剂盒以及显色液为天根公司产品；
[0056] 谷脫甘肽-琼脂糖凝胶Glutathione Sepharose 4B为美国GE Healthcare公司 产品。
[0057] 实施例1 :鲍曼不动杆菌A1S_1969蛋白的克隆
[0058] 1.首先根据鲍曼不动杆菌17978标准株A1S_1969基因序列，其氨基酸序列如SEQ ID NO. 3所示。应用生物信息软件进行结构分析，其信号肽序列如图5所示，其空间结构分 析如图6所示。
[0059] 2.根据分析结果，采用PCR方法以鲍曼不动杆菌17978全基因组为模板（SEQ ID NO. 4)分别扩增A1S_1969蛋白两个片段的基因片段，扩增步骤如下：
[0060] 1)设计PCR引物如下，用正向引物P1A1S1969B1 (SEQ ID NO :9)、反向引物 P1A1S1969N2(SEQ ID N0:10)扩增第一个片段，正向引物 P2A1S1969B1(SEQ ID N0:11)、反 向引物P2A1S1969N2(SEQ ID N0:12)扩增第二个片段（用下划线示酶切位点碱基序列）。
[0061] 正向引物 P1A1S1969B1 :SEQ ID NO. 9
[0062] 5'-CGCGGATCCGATTTCGTTGTTAGAGATATTCGTGT-3'
[0063] BamH I
[0064] 反向引物 P1A1S1969N2 :SEQ ID NO. 10
[0065] 5'-TTATGCGGCCGCCTTAACGCTCTAAACGAACTTTAG-3'
[0066] Not I
[0067] 正向引物 P2A1S1969B1 :SEQ ID NO. 11
[0068] 5'-CGCGGATCCACAGGTTTCTTTAAAACCGTTGATAT-3'
[0069] BamH I
[0070] 反向引物 P2A1S1969N2 :SEQ ID NO. 12
[0071] 5'-TTATGCGGCCGCTTAGAAAGTACGACCAATTTCAA-3'
[0072] Not I
[0073] 本实施例将编码SEQ ID NO. I所示A1S_1969蛋白氨基酸序列的DNA序列SEQ ID NO. 2作为目的基因片段进行PCR扩增，但本领域技术人员应该理解，可以选择衍生自SEQ ID NO. 2所示DNA序列、在其对应编码蛋白氨基酸序列氨基端缺失多个密码子后所获得的 任意序列作为目的基因片段（如SEQ ID NO. 6所示）。
[0074] 2) _80°C冷冻库中取出保存的鲍曼不动杆菌17978菌株涂布于专用LB固体培养基 上，于37°C培养过夜，再挑取单菌落接种于LB液体培养基中培养8个小时，参照细菌基因组 抽提试剂盒抽提全基因组。
[0075] 3)以鲍曼不动杆菌17978全基因组DNA为模板PCR扩增A1S_1969蛋白基因片段 (以扩增第一个片段为例）。
【主权项】
1. 一种1A1S_1969的重组蛋白，其特征在于：包含A1S_1969的第46-414位氨基酸序 列，所述的氨基酸序列如SEQ ID NO. 1所示，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 2所示。
2. 根据权利要求1所述的重组蛋白，其特征在于：该重组蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO. 5所示。
3. 根据权利要求1所述的重组蛋白，其特征在于：所述重组蛋白通过标签蛋白GST融 合表达，所述标签蛋白融合于所述1A1S_1969蛋白的N端。
4. 根据权利要求1所述的重组蛋白，其特征在于：该重组蛋白由融合表达并酶切后在 权利要求1所述的氨基端加入GPLGS五个氨基酸形成。
5. 编码权利要求1所述的1A1S_1969重组蛋白的多核苷酸。
6. 根据权利要求5所述的多核苷酸，其特征在于：所述多核苷酸的核苷酸序列如SEQ ID NO. 2或SEQ ID NO. 6所示或紧密结合在其的一端或两端添加或缺失若干个核苷酸得到 的编码与SEQ ID NO. 5所示蛋白具有相同或相似功能的重组蛋白的序列。
7. 权利要求1所述的1A1S_1969重组蛋白的制备方法，其特征在于，包括以下步骤： 1) 设计PCR的引物如下： 正向引物 5'-CGCGGATCCGATTTCGTTGTTAGAGATATTCGTGT-3' BamH I 反向引物 5,-TTATGCGGCCGCCTTAACGCTCTAAACGAACTTTAG-3' Not I 2) 使用步骤1)设计的引物通过PCR扩增出编码1A1S_1969蛋白目的基因片段； 3) 步骤2)所得的基因片段克隆至表达载体，然后转化至宿主菌； 4) 诱导转化后的宿主菌表达1A1S_1969重组蛋白； 5) 纯化重组蛋白。
8. -种表达载体或宿主细胞，其特征在于：包含编码权利要求1所述重组蛋白的多核 苷酸或宿主细胞。
9. 根据权利要求8所述的载体或宿主细胞，其特征在于：所述载体是pGEX-6P-2表达 载体；所述宿主细胞是大肠杆菌，所述大肠杆菌是XLl-Blue。
10. 抗权利要求1所述的1A1S_1969蛋白的抗体。
11. 权利要求1所述的1A1S_1969蛋白在制备预防或治疗鲍曼不动杆菌感染的药物中 的应用。
12. 权利要求1所述的1A1S_1969蛋白在制备鲍曼不动杆菌检测试剂盒中的应用。
【专利摘要】本发明涉及一种1A1S_1969的重组蛋白及其制备方法和应用，该重组蛋白包含A1S_1969的第46-414位氨基酸序列，该重组蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示。该重组蛋白表达量高，便于分离纯化，高效安全，可以直接与佐剂配合使用，用于制备抗鲍曼不动杆菌感染的亚单位疫苗以及相关的检测试剂盒。经动物实验证实，所述基因工程重组单价亚单位疫苗具有良好的抗鲍曼不动杆菌感染的免疫保护效果。为进一步的联合疫苗和多亚单位融合疫苗研究打下基础，同时对防治疫苗和诊断试剂盒的研制及应用具有重要的作用。
【IPC分类】A61K38-16, C07K14-22, C12N1-21, G01N33-569, A61P31-04, C07K16-12, C12N15-70, C12N15-31
【公开号】CN104861049
【申请号】CN201510202161
【发明人】冯强, 蔡昌芝, 邹全明, 曾浩, 石云, 敬海明
【申请人】中国人民解放军第三军医大学
【公开日】2015年8月26日
【申请日】2015年4月24日