鲍曼不动杆菌假定蛋白a1s_1462蛋白及制备方法和应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物技术领域，特别涉及鲍曼不动杆菌假定蛋白A1S_1462蛋白及制 备方法和应用。
【背景技术】
[0002] 鲍曼不动杆菌（Acinetobacter baumannii)为非发酵革兰阴性杆菌，广泛存在于 自然界，属于条件致病菌。该菌是医院感染的重要病原菌，主要引起呼吸道感染，也可引发 菌血症、泌尿系感染、继发性脑膜炎、手术部位感染、呼吸机相关性肺炎等。国内资料表明， 鲍曼不动杆菌约占临床分离的不动杆菌的70%以上。鲍曼不动杆菌对第三代和第四代头孢 菌素的耐药率已达63.0%~89. 9%。对四种氨基糖苷类（阿米卡星、庆大酶素、奈替米星、 妥布霉素）和环丙沙星的耐药率菌达96.3%。我国目前的绝大多数菌株对亚胺培南、美罗 培南、头孢鲍曼不动杆菌派酮/舒巴坦和多黏菌素 B保持敏感，但在呼吸道感染的治疗中效 果较差。
[0003] 由于现有抗生素难以有效治疗鲍曼不动杆菌感染，而新的可以用于治疗鲍曼不动 杆菌感染的抗生素在短期内无法获得的情况下，治疗鲍曼不动杆菌引起的感染性疾病也 变得日益复杂，近年来医学界的相关的病原微生物研宄学习者也对鲍曼不动杆菌的预防 和治疗进行了相关研宄。西班牙Michael J. McCnnell等人利用急性脓血症小鼠模型对 鲍曼不动杆菌灭活全菌疫苗的主动免疫和被动免疫两个方面进行了评价；同时，Michael J. McCnnel 1等人在2011年对鲍曼不动杆菌的外膜蛋白疫苗进行了研宄，结果提示OMC可以 刺激T细胞分泌IFN- γ及活化Thl及Th2辅助B细胞分泌IgG抗体，均对小鼠具有良好的 免疫保护性。但是以上全菌疫苗和外膜复合物疫苗成分复杂，同时含有大量的内毒素，对机 体的毒副作用较大，因此研发一种质量可控，安全有效的鲍曼不动杆菌疫苗是必然的趋势。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的是提供一种鲍曼不动杆菌蛋白A1S_1462蛋白及制备方法和应用， 该蛋白可应用于制备抗鲍曼不动杆菌感染的亚单位疫苗以及相关的检测试剂盒。
[0005] 本发明的技术方案如下：
[0006] 鲍曼不动杆菌A1S_1462重组蛋白，包含A1S_1462成熟肽，所述成熟肽的氨基酸序 列如SEQ ID NO. 1所示。
[0007] 所述重组蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO. 5所示。
[0008] 所述重组蛋白通过标签蛋白GST融合表达，所述标签蛋白融合于所述A1S_1462蛋 白的N端。
[0009] 所述重组蛋白的氨基酸序列还包括在SEQ ID NO. 1的氨基端和/或羧基端缺失、 替代、和/或添加了 1 一 20个氨基酸残基的具有免疫原性的变体，该变体与所述氨基酸序 列具有至少80%的同一性。
[0010] 该重组蛋白由融合表达并酶切后在成熟肽的的氨基端加入GPLGS五个氨基酸形 成。
[0011] 编码A1S_1462重组蛋白的多核苷酸。
[0012] A1S_1462重组蛋白的制备方法，包括以下步骤：
[0013] 1)设计PCR的引物如下：
[0014] 正向引物
[0015] 5'-CGCGGATCCATGGCACCTGTAAAAGAACAAAAAAT-3'
[0016] BamH I [0017] 反向引物
[0018] 5'-TTATGCGGCCGCCTTACTTTTTTGTAGCTGCG-3'
[0019] Not I
[0020] 2)使用步骤1)设计的引物通过PCR扩增出编码A1S_1462蛋白目的基因片段；
[0021] 3)步骤2)所得的基因片段克隆至表达载体，然后转化至宿主菌；
[0022] 4)诱导转化后的宿主菌表达A1S_1462重组蛋白；
[0023] 5)纯化重组蛋白。
[0024] 表达载体或宿主细胞，包含编码权利要求1所述重组蛋白的多核苷酸或宿主细 胞。
[0025] 所述载体是pGEX-6P_2表达载体；所述宿主细胞是大肠杆菌，所述大肠杆菌是 XLl-Blue0
[0026] 抗A1S_1462蛋白的抗体。
[0027] A1S_1462重组蛋白在制备预防或治疗鲍曼不动杆菌感染的药物中的应用。
[0028] A1S_1462重组蛋白在制备鲍曼不动杆菌检测试剂盒中的应用。
[0029] 本发明所述A1S_1462蛋白，可在SEQ ID N0:l、3或5中天然产生或人工引入突 变或变异（包括但不限于，置换，缺失和/或添加），而不影响A1S_1462的生物学特性。因 此，在本发明中，"A1S_1462"意欲包括全长A1S_1462蛋白、其成熟肽和其变体，包括SEQ ID NO: 1、SEQ ID N0:3或SEQ ID N0:5所示的多肽以及其天然或人工的变体，所述变体保留了 A1S_1462的生物学特性，即，具有强免疫原性。并且，当描述A1S_1462的序列片段时，其不 仅包括SEQ ID NO: 1、3或5所示的多肽的序列片段，还包括该多肽的天然或人工变体中的 相应序列片段。
[0030] 根据本发明，当在蛋白/多肽的背景中使用时，术语"变体"是指这样的蛋白，其氨 基酸序列与参照蛋白/多肽（例如，本发明的A1S_1462蛋白）的氨基酸序列具有一个或 多个（例如1-10个或1-5个或1-3个）氨基酸差异（例如，保守氨基酸置换），或者具有 至少 60%，80%，85%，90%，91%，92%，93%，94%，95%，96%，97%，98%，或 99% 的同一 性，并且其保留了参照蛋白/多肽的必要特性。在本发明中，蛋白/多肽（例如，本发明的 A1S_1462蛋白）的必要特性可以指，具有强免疫原性。
[0031] 上述"同一性"用于指两个多肽之间或两个核酸之间序列的匹配情况。当两个进行 比较的序列中的某个位置都被相同的碱基或氨基酸单体亚单元占据时（例如，两个DNA分 子的每一个中的某个位置都被腺嘌呤占据，或两个多肽的每一个中的某个位置都被赖氨酸 占据），那么各分子在该位置上是同一的。两个序列之间的"百分数同一性"是由这两个序列 共有的匹配位置数目除以进行比较的位置数目XlOO的函数。例如，如果两个序列的10个 位置中有6个匹配，那么这两个序列具有60%的同一性。例如，DNA序列CTGACT和CAGGTT 共有50%的同一性（总共6个位置中有3个位置匹配）。通常，在将两个序列比对以产生 最大同一性时进行比较。
[0032] 如本文中使用的，术语"保守置换"意指不会不利地影响或改变包含氨基酸序列的 蛋白/多肽的生物学活性的氨基酸置换。例如，可通过本领域内已知的标准技术例如定点 诱变和PCR介导的诱变引入保守置换。保守氨基酸置换包括用具有相似侧链的氨基酸残基 替代氨基酸残基的置换，例如用在物理学上或功能上与相应的氨基酸残基相似（例如具有 相似大小、形状、电荷、化学性质，包括形成共价键或氢键的能力等）的残基进行的置换。
[0033] 根据本发明，术语"免疫原性（immunogenicity) "是指，能够刺激机体形成特异抗 体或致敏淋巴细胞的能力。其既指，抗原能刺激特定的免疫细胞，使免疫细胞活化、增殖、分 化，最终产生免疫效应物质如抗体和致敏淋巴细胞的特性，也指抗原刺激机体后，机体免疫 系统能形成抗体或致敏T淋巴细胞的特异性免疫应答。
[0034] 在本发明中，术语"多肽"和"蛋白质"具有相同的含义，可互换使用。
[0035] 本发明鉴于全长A1S_1462蛋白含有一个信号肽，其信号肽对应1~20位的氨基 酸序列，为了在最大限度上保持A1S_1462的结构和功能不发生较大的变化，本发明还提 供了一种融合蛋白，其包含A1S_1462蛋白的成熟肽、其变体或其片段以及标签蛋白。优 选地，所述标签蛋白为GST ;优选地，标签蛋白融合于A1S_1462蛋白的成熟狀的N端。上 述融合蛋白经酶切获得A1S_1462重组蛋白；优选地，当标签蛋白为GST时，酶切所用酶为 PreScission protease (PP酶），酶切获得的A1S_1462重组蛋白在A1S_1462蛋白的成熟肽 N端增加五个氨基酸残基GPLGS。
[0036] 在另一个方面，本发明涉及编码本发明的A1S_1462蛋白、融合蛋白及其变体的多 核苷酸以及含有该多核苷酸的载体。
[0037] 可用于插入目的多核苷酸的载体包括但不限于克隆载体和表达载体。在一个实施 方案中，载体是例如质粒，粘粒，噬菌体，柯斯质粒等等。
[0038] 在另一个方面，本发明还涉及包含上述多核苷酸或载体的宿主细胞。此类宿主细 胞包括但不限于，原核细胞例如大肠杆菌细胞，以及真核细胞例如酵母细胞，昆虫细胞，植 物细胞和动物细胞（如哺乳动物细胞，例如小鼠细胞、人细胞等）。本发明的宿主细胞还可 以是细胞系。
[0039] 本发明提供一种获得A1S_1462重组蛋白的方法，其包含以下步骤：
[0040] 1.利用重组宿主细胞表达本发明的融合蛋白；
[0041] 2.回收所述融合蛋白；
[0042] 3.对回收的融合蛋白进行酶切，并从酶切产物中回收A1S_1462重组蛋白；
[0043] 优选地，当标签蛋白为GST时，酶切所用酶为PreScission protease (PP酶）。
[0044] 在一个优选实施方案中，获得本发明的A1S_1462重组蛋白的方法的步骤（1)还包 括：
[0045] ( i )根据编码A1S_1462蛋白的核酸序列设计正向引物和反向引物；
[0046] ( ii )使用步骤（i )设计的正向引物和反向引物，通过PCR扩增出编码A1S_1462 蛋白的基因片段；
[0047] (iii)将步骤（ii )所获得的基因片段克隆至表达载体，然后转化至宿主细胞；
[0048] ( iv )诱导转化后的宿主细胞表达A1S_1462融合蛋白。
[0049] 本发明优选采用pGEX-6p_2质粒来构建重组原核细胞（例如大肠杆菌），表达 A1S_1462融合蛋白，其主要特点是所表达的融合蛋白中的氨基端接有一个26kDa的GST标 签，该标签可作为蛋白纯化标记。与其他融合载体相比，PGEX系列载体具有纯化条件温和、 步骤简单、不需要变性剂的加入，从而使纯化后的蛋白能最大限度保持其空间构象和免疫 原性。
[0050] 本发明所述正向引物和反向