引物的核苷酸序列分别为SEQ ID NO. 7和SEQ ID NO. 8,所使用的宿主细胞为大肠杆菌XL-I bule。
[0051] 本发明还提供一种A1S_1462重组蛋白在制备抗鲍曼不动杆菌的亚单位疫苗中的 应用。
[0052] 本发明还提供一种A1S_1462重组蛋白在制备鲍曼不动杆菌检测试剂盒中的应 用。
[0053] 本发明还提供一种抗A1S_1462蛋白或包含A1S_1462蛋白的融合蛋白的抗体。
[0054] 本发明采用基因工程技术克隆表达此保护性抗原假设重组蛋白，表达量高，便于 分离纯化，而且高效安全。假设重组蛋白可以直接与佐剂（如Al (OH)3佐剂、AlPO4佐剂、 1^59、4503、4504、不完全弗氏佐剂、完全弗氏佐剂、等）配合使用，优选八1?0 4佐剂用于肌肉 注射免疫。
[0055] 本发明的基因工程重组蛋白的表达方法具有以下6个优点：
[0056] I. A1S_1462蛋白及从假定蛋白均未用于重组亚单位疫苗领域；
[0057] 2.假定蛋白的表达质粒在原核表达系统（大肠杆菌）中诱导表达，表达量高，质量 安全可控；
[0058] 3.选择pGEX-6p_2表达载体，假设重组蛋白以融合蛋白形式表达，最大限度保持 了其原有的空间构象；
[0059] 4.所表达的融合蛋白中就含有个GST标签，此标签就成为蛋白纯化的标记，使 得纯化条件温和、步骤简单、不需要变性剂的加入，从而纯化后的蛋白能最大限度保持其空 间构象和免疫原性；
[0060] 5.假设重组蛋白表达率约为30%，纯化后的假设重组蛋白纯度大于95% ;
[0061] 6.假设重组蛋白能够诱导动物产生特异性的抗体。
[0062] 利用本发明假设重组蛋白制备的亚单位疫苗可通过皮下（肌肉）注射途径进行免 疫接种，激发机体产生高滴度IgG抗体和细胞免疫应答。并经动物实验证实，所述基因工程 重组单价亚单位疫苗具有良好的抗鲍曼不动杆菌感染的免疫保护效果。为进一步的联合疫 苗和多亚单位融合疫苗研宄打下基础，同时为防治疫苗和诊断试剂盒的研制及应用具有重 要的作用。
【附图说明】
[0063] 图1是假设基因片段的PCR扩增结果，其中，泳道M:核酸（DNA)分子量标准 (Marker);泳道1-3 :假设基基因片段（0. 9kb)的PCR扩增产物；
[0064] 图2为表达载体pGEX-6p-2-AlS_1462的酶切鉴定结果：其中，泳道M :核酸（DNA) 分子量标准（Marker);泳道1-4 :重组表达质粒pGEX-6p-2-AlS_1462经酶切后的鉴定结 果，泳道1-4均表示酶切后分离的片段4kb和0. 9kb ;
[0065] 图3表示不同温度下诱导蛋白表达结果：其中，泳道Μ:蛋白分子量标准 (Marker);泳道1 :重组工程菌在30°C下诱导表达后，在上清中获得的融合蛋白；泳道2 :重 组工程菌在16°C下诱导表达后，在上清中未获得的融合蛋白；
[0066] 图4表示重组工程菌在30°C过夜诱导3小时表达后，上清中获得含的融合蛋白，其 中，泳道M :蛋白分子量标准（Marker);泳道1-3:重组工程菌在30°C中诱导后，在上清中获 得含GST标签的融合蛋白。
[0067] 图5表不含GST标签的融合蛋白酶切结果，其中，泳道M :蛋白分子量标准 (Marker);泳道1 :酶切前，获取的假设重组蛋白；泳道2 :酶切后，获取的假设重组蛋白；泳 道3 :酶切后，获取的假设重组蛋白；泳道4 :酶切后，非特异性结合在谷胱甘肽-琼脂糖凝 胶4B上的目的蛋白和特异性结合在谷胱甘肽-琼脂糖凝胶4B上的酶和GST标签；
[0068] 图 6 利用在线信号肽分析软件 http://www. cbs. dtu. dk/services/SignalP-4. 0/ 对A1S_1462蛋白信号肽预测结果图，结果表明1-20氨基酸为信号肽序列。
[0069] 图7重组表达载体测序后与假定蛋白的DNA序列对比结果，结果表明DNA序列与 理论完全一致。
【具体实施方式】
[0070] 本发明所使用的菌株与各种试剂如下：
[0071] 1.菌株
[0072] 鲍曼不动杆菌17978国际标准株由美国ATCC提供；
[0073] 2.试剂
[0074] 质粒pGEX_6p_2 (购于GE公司）、pET_22b (购于Novagen公司）和大肠杆菌菌株 XL-Iblue (购于普如汀公司）由申请人微生物教研室保存；
[0075] primeSTAR HS DNA Polymerase、DNA Marker、DNA Ligation Mix、限制性内切酶 BamH I和Not I、蛋白Marker为大连TakaRa公司产品；
[0076] 质粒提取试剂盒和凝胶回收试剂盒为美国Omega公司产品；
[0077] 细菌基因组提取试剂盒、超薄回收试剂盒以及显色液为天根公司产品；
[0078] 谷脫甘肽-琼脂糖凝胶Glutathione Sepharose 4B为美国GE Healthcare公司 产品。
[0079] 实施例1 :鲍曼不动杆菌假定蛋白的克隆
[0080] 1.首先根据鲍曼不动杆菌17978标准株A1S_1462基因序列，应用生物信息软件进 行结构分析，分析结果参见附图6,从而确定需要扩增的假定蛋白的基因片段。
[0081] 2.根据分析结果，采用PCR方法以鲍曼不动杆菌17978全基因组为模板扩增假定 蛋白的基因片段，扩增步骤如下：
[0082] 1)设计PCR引物如下，分别为SEQ ID NO :7-8 (下划线示酶切位点碱基序列）
[0083] 正向引物 PA1S1462B1 :SEQ ID NO. 7
[0084] 5'-CGCGGATCCATGGCACCTGTAAAAGAACAAAAAAT-3'
[0085] BamH I
[0086] 反向引物 PA1S1462N2 :SEQ ID NO. 8
[0087] 5'-TTATGCGGCCGCCTTACTTTTTTGTAGCTGCG-3'
[0088] Not I
[0089] 本实施例将编码SEQ ID NO. I所示假定蛋白氨基酸序列的DNA序列SEQ ID NO. 2 作为目的基因片段进行PCR扩增。
[0090] 2)-80°c冷冻库中取出保存的鲍曼不动杆菌17978菌株涂布于专用LB固体培养基 上，于37°C培养过夜，再挑取单菌落接种于LB液体培养基中培养8个小时，参照细菌基因组 抽提试剂盒抽提全基因组。
[0091] 3)以鲍曼不动杆菌17978全基因组DNA为模板PCR扩增假定蛋白基因片段
[0092] PCR 体系：
[0093]
【主权项】
1. 一种鲍曼不动杆菌A1S_1462重组蛋白，其特征在于：包含A1S_1462成熟肽，所述成 熟肽的氨基酸序列如SEQ ID NO. 1所示。
2. 根据权利要求1所述的蛋白，其特征在于：所述重组蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO. 3所示。
3. 根据权利要求1所述的重组蛋白，其特征在于：所述重组蛋白通过标签蛋白GST融 合表达，所述标签蛋白融合于所述A1S_1462蛋白的N端。
4. 根据权利要求1所述的重组蛋白，其特征在于：所述重组蛋白的氨基酸序列还包括 在SEQ ID NO. 1的氨基端和/或羧基端缺失、替代、和/或添加了 1 一 20个氨基酸残基的 具有免疫原性的变体，该变体与所述氨基酸序列具有至少80%的同一性。
5. 根据权利要求1所述的重组蛋白，其特征在于：该重组蛋白由融合表达并酶切后在 权利要求1所述的氨基端加入GPLGS五个氨基酸形成。
6. 编码权利要求1所述的A1S_1462重组蛋白的多核苷酸。
7. 权利要求1所述的A1S_1462重组蛋白的制备方法，，其特征在于，包括以下步骤： 1) 设计PCR的引物如下： 正向引物 5,-CGCGGATCCATGGCACCTGTAAAAGAACAAAAAAT~3, BamH I 反向引物 5'-TTATGCGGCCGCCTTACTTTTTTGTAGCTGCG-3' Not I 2) 使用步骤1)设计的引物通过PCR扩增出编码A1S_1462蛋白目的基因片段； 3) 步骤2)所得的基因片段克隆至表达载体，然后转化至宿主菌； 4) 诱导转化后的宿主菌表达A1S_1462重组蛋白； 5) 纯化重组蛋白。
8. -种表达载体或宿主细胞，其特征在于：包含编码权利要求1所述重组蛋白的多核 苷酸或宿主细胞。
9. 根据权利要求7所述的载体或宿主细胞，其特征在于：所述载体是pGEX-6P-2表达 载体；所述宿主细胞是大肠杆菌，所述大肠杆菌是XLl-Blue。
10. 抗权利要求1所述的A1S_1462蛋白的抗体。
11. 权利要求1所述的A1S_1462重组蛋白在制备预防或治疗鲍曼不动杆菌感染的药物 中的应用。
12. 权利要求1所述的A1S_1462重组蛋白在制备鲍曼不动杆菌检测试剂盒中的应用。
【专利摘要】本发明涉及一种A1S_1462的重组蛋白及其制备方法和应用，该重组蛋白包含A1S_1462成熟肽，该重组蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。该重组蛋白表达量高，便于分离纯化，高效安全，可以直接与佐剂配合使用，用于制备抗鲍曼不动杆菌感染的亚单位疫苗以及相关的检测试剂盒。经动物实验证实，所述基因工程重组单价亚单位疫苗具有良好的抗鲍曼不动杆菌感染的免疫保护效果。为进一步的联合疫苗和多亚单位融合疫苗研究打下基础，同时对防治疫苗和诊断试剂盒的研制及应用具有重要的作用。
【IPC分类】C12N15-31, A61K39-02, C07K19-00, A61P31-04, C07K16-12, C12N15-70, C07K14-22, C12N1-21, C12N15-62
【公开号】CN104861048
【申请号】CN201510200665
【发明人】蔡昌芝, 曾浩, 邹全明, 冯强, 石云, 魏振波
【申请人】中国人民解放军第三军医大学
【公开日】2015年8月26日
【申请日】2015年4月24日