多重耐药鲍曼不动杆菌的高效抗菌活性反义核酸序列的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种用于抑制多重耐药鲍曼不动杆菌生长的反义寡核苷酸序列及其应用。属新型抗菌制剂研究与开发领域。本发明采用计算机辅助设计联合寡核苷酸斑点杂交技术筛选出一条以多重耐药鲍曼不动杆菌拓扑异构酶ⅡA亚基的编码基因gyrA为靶基因的反义寡核苷酸，用以抑制多重耐药鲍曼不动杆菌的生长。本发明表明该反义寡核苷酸序列在低浓度时即具有明显的抑制多重耐药鲍曼不动杆菌生长的活性，提高浓度显示出快速、高效的杀菌活性即能够引起多重耐药鲍曼不动杆菌的死亡。本发明中设计的反义核酸具有抑制活性强，专一性高的特点，非常适合在治疗多重耐药鲍曼不动杆菌感染中的应用，并极有潜力发展为抗多重耐药鲍曼不动杆菌感染的药物。
【专利说明】多重耐药鲍曼不动杆菌的高效抗菌活性反义核酸序列
【技术领域】[0001]本发明涉及一种反义核酸序列，具体为一种抑制多重耐药鲍曼不动杆菌杆菌生长的反义核酸序列。
【背景技术】
[0002]反义技术是根据核酸杂交原理设计针对特定靶序列的反义核酸从而抑制特定基因表达，近年来其发展极其迅速，作为一种新的基因治疗手段，反义技术已经被广泛应用于病毒感染、肿瘤、遗传性疾病等医学研究，并取得了丰硕的成果，具有极其重要的理论和实际意义。原核生物与真核生物相比，具有基因组结构简单，生长调控机制相对单一等优势，将反义技术应用于原核生物系统无疑有着“神奇”的应用潜力。
[0003]目前，几乎所有临床应用的抗生素都出现了相应的耐药菌，因此采用传统靶点筛选出来的抗生素难以避免耐药的问题。科学家已经完成了多种重要致病菌的全基因组测序工作，新一代测序技术将使这一名录迅速增加。这些庞大的基因组序列信息为后基因组时代分析基因功能并借此寻找新的抗菌药物作用靶点提供了可能。近年来，采用反义技术在基因组范围内筛选鉴定致病菌必需基因的研究进展显著，而这些必需基因有可能发展为新的抗菌药物靶点近年来，反义技术在新型抗菌药物研发中发挥了重要作用。人们采用反义技术鉴定必需基因，发现了许多具有发展前景的抗菌药物作用靶点；针对耐药基因的反义核酸能够有效逆转耐药菌对现有抗生素的敏感性，针对生长必需基因的反义核酸具有显著的抗菌活性，通过改善其细胞吸收特性以及抗菌活性，反义核酸有望发展成为新一代抗菌药物，为人类造福。
[0004]鲍曼不动杆菌广泛分布于环境中和健康人群中，极易在医用材料上黏附，能引起人呼吸道、泌尿道、中枢神经系统等多部位的感染，近年来由于广谱抗生素的大量应用，该菌引起的感染明显上升。目前现有抗生素对于多重耐药甚至泛耐药的鲍曼不动杆菌引起的感染治疗困难，由于其耐药机制复杂且极有可能存在新的耐药机制，因此传统的抗菌药物在治疗中有相当的局限性，迫切需要开发出新的抗菌制剂。
[0005]反义核酸可以通过与靶基因的特异性结合形成空间位阻，抑制靶基因的转录和翻译。以细菌生长的必须基因为靶，利用反义核酸使其生长所需必须蛋白缺失，可达到抑制细菌生长的目的。从基因水平上寻找治疗多重耐药鲍曼不动杆菌感染的方法有望成为抗感染治疗的新途径。
[0006]gyrA基因是细菌生长的必需基因，作为拓扑异构酶II A亚基的编码基因，在细菌DNA复制中发挥重要作用，抑制其表达可抑制细菌的生长。反义核酸对靶基因的抑制作用关键在于能否形成稳定的DNA:RNA杂化双链(heteroduplexes)结构。由于mRNA 二级结构的空间位阻作用，只有少数位点可与反义核酸结合从而发挥基因表达下调作用，因此有效核酸序列的设计筛选是反义技术的关键。目前为止还没有针对多重耐药鲍曼不动杆菌gyrA基因的高效反义核酸序列。
【发明内容】
[0007]为了克服多重耐药鲍曼不动杆菌对现有抗生素广泛耐药，抗感染治疗成功率低的难题，本发明提供了一种针对多重耐药鲍曼不动杆菌具有高效抗菌活性的反义核酸序列，该序列为一段人工合成的核苷酸序列，它与多重耐药鲍曼不动杆菌必需基因gyrA特定位点序列是互补的。将一定剂量本发明所述的反义核酸序列加以稳定性修饰并转至菌体内，该类反义核酸能够与靶基因特异性结合从而抑制靶基因的表达，达到高效、低毒或无毒地抑抑制多重耐药鲍曼不动杆菌的生长的目的，进而治疗与其感染有关的疾病。
[0008]本发明是采用如下技术方案实现的:
[0009]1.本发明针对gyrA基因全长编码区序列,通过利用Mfold和RNA structured:.6两种mRNA 二级结构分析软件预测分析gyrA mRNA的二级结构，以最低自由能原则绘制37°C时gyrA mRNA的二级结构图，并进行自由能计算,包括Overall AG、Duplex AG、Breaktarg A G、oligo-self A G和oligo-oligo A G等参数,选择mRNA局部杂交松弛区，如发卡、膨胀环、内环等结构区域，设计反义寡核苷酸探针。利用斑点杂交技术，将设计的反义寡核苷酸探针与地高辛标记的gyrA mRNA分子进行原位杂交，验证其与靶基因结合的有效性，筛选出一条能与gyrA基因稳定结合的反义核酸序列。
[0010]2.根据以上I项所述的反义核酸序列，其特征在于，具有与多重耐药鲍曼不动杆菌gyrA基因的下述序列(Seq ID N0.1)互补的核苷酸序列:5’ GAUGGUGAUAGCGCUGCGGC 3’
[0011]3.根据以上I项所述的反义核酸序列，其特征在于，具有下述序列(Seq IDN0.2):
[0012]5， GCCGCAGCGCTATCACCATC 3，
[0013]4.根据以上1-3项中任一项的反义核酸序列，其特征在于它与多重耐药鲍曼不动杆菌gyrA mRNA的碱基互补，能有效地抑制多重耐药鲍曼不动杆菌生长。
[0014]本发明所提供的反义核酸序列，经过稳定性修饰并导入细菌体内，可以显著抑制细菌的生长且无明显毒性作用。在本发明的一个优选实施例中，所述反义核酸的12个连续碱基序列Seq ID N0.3以肽核酸的形式合成，经过穿膜肽KFFKFFKFFK序列修饰，达到将反义序列以稳定的形式转入细菌体内的目的。
[0015]本发明所提供的反义核酸序列可用于制备对抗多重耐药鲍曼不动杆菌感染的治疗药物，其对细菌生长的抑制作用是传统抗生素无法匹敌的。
【专利附图】
【附图说明】
[0016]图1是不同浓度的PNA作用下根据测定0D600值绘制的细菌生长曲线(5 U mo I/L肽核酸浓度即可显著抑制鲍曼不动杆菌生长)
[0017]图2是不同浓度的PNA作用下根据平板菌落计数绘制的细菌生长曲线(5 u mol/L肽核酸浓度具有良好的抑制细菌生长效果，10 u mol/L肽核酸浓度即具有杀菌活性)
【具体实施方式】
[0018]1:反义核酸的合成
[0019]为保持反义核酸在研究中的稳定，不易被降解而失去抑制效能，将所述反义核酸以肽核酸(PNA)的形式合成以增加其稳定性，并加穿膜肽KFFKFFKFFK序列修饰，克服细菌膜结构对大分子的屏障作用，以达到将反义序列以稳定的形式转入细菌体内的目的。
[0020]肽核酸(PNA)是人工合成的DNA类似物，以肽键(NH-CO)代替核酸天然骨架3’，5’磷酸二酯键，具有高水溶性、高稳定性、与碱基配对的特异性高等特点。然而，肽核酸比常用药物的分子量大很多，导致其难以顺利通过细菌外膜渗透进入细菌体内，通过穿膜肽修饰可提高肽核酸的渗透能力。除此之外，肽核酸的长度也将影响其自身的穿膜能力，一般9mer-12mer的肽核酸与穿膜肽KFFKFFKFFK连接时，可显著提高肽核酸的渗透能力，同时有效提高反义抑制效率。
[0021]因此，本研究选用了 12mer的PNA序列，即选择所述的反义核酸序列的其中12个连续碱基序列seq ID N0.3，进行肽核酸合成，并加穿膜肽序列KFFKFFKFFK修饰，形成肽肽核酸(KFF) 3K-PNA。
[0022]2:多重耐药鲍曼不动杆菌的培养
[0023]研究所用多重耐药鲍曼不动杆菌菌株由重庆医科大学附属第一医院检验科提供，药敏试验结果显示其对氨苄西林、哌拉西林、头孢唑啉、头孢呋辛酯、头孢他啶、头孢吡肟、亚胺培南、妥布霉素、左旋氧氟沙星、甲氧苄啶/磺胺甲恶唑、氨苄西林/舒巴坦、哌拉西林/他唑巴坦、头孢呋辛、头孢替坦、头孢曲松、氨曲南、庆大霉素、环丙沙星、呋喃妥因均耐药。将菌株接种于LB液体培养基于37°C摇床振荡过夜培养。
[0024]3:反义核酸对多重耐药鲍曼不动杆菌的生长抑制作用
[0025]将上述过夜培养的菌液用MHB培养基稀释至约105CFU/ml，取100 U I稀释后的菌液加入96孔板，同时加入(KFF) 3K-PNA,使其浓度分别为0，5，10，20，40 y mol/L。将96孔板放入37°C孵箱培养24h，分别于Oh, lh，2h，3h，4h，5h，6h，7h，8h取出测定0D600值，同时于oh，2h，4h，6h，8h做平板菌落计数，观察(KFF) 3K_PNA对细菌生长的抑制作用。
[0026]体外对多重耐药鲍曼不动杆 菌的抑菌试验结果显示:本研究所使用的肽核酸在5 ii mol/L浓度时能显著抑制细菌的生长，在IOii mol/L浓度时具有杀菌活性，结果见图1，图2。细胞毒性试验在40 u mol/L浓度时未见明显的毒性反应。结果表明本发明所提供的反义核酸序列具有极强的抗菌活性，可用于制备抗多重耐药鲍曼不动杆菌感染的治疗药物。
【权利要求】
1.一种反义核苷酸，其特征在于具有与多重耐药鲍曼不动杆菌gyrA基因的下述序列互补的核苷酸序列:5’ GAUGGUGAUAGCGCUGCGGC 3’。
2.如权利要求1所述的反义核苷酸，其特征在于具有以下序列:5’ GCCGCAGCGCTATCACCATC 3’
3.如权利要求1-2所述的反义核苷酸，其特征在于它与多重耐药鲍曼不动杆菌gyrAmRNA的碱基互补，有效地抑制多重耐药鲍曼不动杆菌生长。
4.如权利要求1-3中任一项的反义核苷酸序列的修饰型。
5.如权利要求1-3中一项反义核苷酸序列作为治疗和/或预防多重耐药鲍曼不动杆菌感染的基因药物的应用。
6.如权利要求1-3中任一项反义核酸序列在医学中的应用。
7.如权利要求4的反义核酸序列的修饰型作为治疗和/或预防多重耐药鲍曼不动杆菌感染的基因药物的应用 。
【文档编号】A61P31/04GK103571836SQ201210251518
【公开日】2014年2月12日 申请日期:2012年7月20日 优先权日:2012年7月20日
【发明者】夏云, 王慧娟, 罗鹏 申请人:夏云, 王慧娟, 罗鹏