专利名称：一种抗大豆胰蛋白酶抑制剂抗体、制备方法及其用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及抗体领域，特别是涉及抗大豆胰蛋白酶抑制剂抗体、制备方法及其用途。
背景技术：
近年来，我国渔业生产发展迅速，其中，水产品加工业已成为我国渔业生产中发展速度最快、经济社会效益十分显著的支柱产业。在水产加工品中，鱼糜制品因其食用方便、卫生、营养价值高等特点而广受消费者的青睐。但是，随着鱼糜制品生产企业的不断增加，产品良莠不齐的情况已开始出现。最值得关注的是在鱼浆原料中添加过量大豆蛋白替代鱼肉蛋白，以次充好，损害消费者权益的情况已开始出现。由于大豆蛋白中存在未完全灭活的大豆胰蛋白酶抑制剂、致敏蛋白等成分，对人体健康存在 一定危害，因此有必要对鱼糜制品中大豆蛋白的添加量进行明确而有效的控制和规范。对大豆蛋白添加量的规范依赖于准确的定量检测方法。但目前国内尚无检测鱼糜制品原料及产品中大豆蛋白含量的方法。这是由于，一方面食品生产监管单位和鱼糜制品生产企业尚未认识到该项工作的重要性和必要性；另一方面，鱼糜制品加工过程中多种蛋白的混合以及高温处理会改变蛋白的结构及理化特性，增加了检测的难度。
发明内容
本发明的目的之一是提供一种抗大豆胰蛋白酶抑制剂特异性抗体。为实现上述目的，提供一种制备方法:将纯化的大豆胰蛋白酶抑制剂STI经过高温处理后免疫BALB/c小鼠，优选纯化的大豆胰蛋白酶抑制剂STI经过100-120 0C处理10-30 min ;经细胞融合，筛选获得能分泌抗大豆胰蛋白酶抑制剂单克隆抗体的细胞株，经细胞培养获得抗体。还包括将获得的单克隆抗体通过Protein G Sepharose亲和柱进行纯化的步骤。本发明的另外一个目的是提供一种抗大豆胰蛋白酶抑制剂抗体的制备方法。包括如下步骤:将纯化的大豆胰蛋白酶抑制剂STI经过高温处理后免疫BALB/c小鼠，优选纯化的大豆胰蛋白酶抑制剂STI经过100-120 °C处理10-30 min ;经细胞融合，筛选获得能分泌抗大豆胰蛋白酶抑制剂单克隆抗体的细胞株，经细胞培养获得抗体。还包括将获得的单克隆抗体通过Protein G Sepharose亲和柱进行纯化的步骤。本发明另一个目的是提供一种抗大豆胰蛋白酶抑制剂抗体的用途。一种用于检测鱼糜制品中大豆蛋白的方法，其特征在于，包括如下步骤:将待检样品用提取液抽提后，以制备的生物素标记的所述抗STI单克隆抗体进行Western blot检测分析。所述提取液为含有 0.1 mmol/L DTT 的 6-8 mol/L 尿素。所述生物素标记的所述抗STI单克隆抗体是将所述抗STI单克隆抗体经脱盐处理后，与生物素混匀，于冰上孵育得到。在大豆蛋白中，大豆胰蛋白酶抑制剂(Soybean Trypsin Inhibitor, STI)占大豆总蛋白含量的6 %左右，STI由于其良好的热稳定性和在大豆蛋白中所占的高比例，将其作为一个检测鱼糜制品中大豆蛋白添加量的标志物是切实可行的。本发明的其中一个实施例用于验证本发明抗STI抗体用于鱼糜制品中大豆蛋白检测的闻灵敏度。说明本发明检测方法的灵敏度闻，可实现对0.025 %及以上的大 蛋白添加量的准确检出。同时，另外一个实施例验证了本发明的抗STI抗体用于市售鱼糜制品中大豆蛋白的检测，验证了本发明的抗STI抗体用于鱼糜制品中大豆蛋白检测的准确性。本发明的抗STI抗体用于检测鱼糜制品中大豆蛋白含量，灵敏度高，特异性好，准确性高，方法简便快捷。
图1Α.纯化STI的SDS-PAGE电泳图，图1B抗STI单克隆抗体的特异性分析电泳 图2.纯化的STI对胰蛋白酶的抑制效果 图3.抗STI单克隆抗体的纯化电泳 图4.不同大豆蛋白含量的鱼糜制品中大豆蛋白检测的免疫印迹结果 图5.市售鱼糜制品中大豆蛋白检测的免疫印迹结果图。
具体实施例方式下面通过具 体实施方式对本发明作进一步详细说明。但本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。实施例1:大豆蛋白STI标准品的制备
用高速药物粉碎机将大豆磨成粉末，并过60目筛，称取100 g粉末，加入300 mL丙酮搅拌2 h,絹布过滤,弃去丙酮层。残留物用80 %的乙醇洗漆,8000 g离心20 min,弃上清，如此重复4次。将所得沉淀浸泡于0.08 mol/L H2SO4中30 min, 6000 g离心15 min，弃上清，沉淀再重悬于0.125 mol/L H2SO4*，搅拌4 h,8000 g离心20 min,絹布过滤,弃沉淀。上清液用I mol/L的NaOH调pH至4.7，静置0.5 h,8000 g离心20 min，弃沉淀。上清液加Λ 70 %饱和度的(NH4)2SO4,4 °C放置 2 h，8000 g离心 20 min，沉淀用 20 mmol/L Tris-HCl(pH 8.0)的缓冲液溶解，透析过夜。将透析后的样品上样于预先用20 mmol/L Tris-HCl (pH 8.0)的缓冲液平衡好的DEAE-Sephacel层析柱，经0-0.5 mol/L NaCl线性洗脱、收集对胰蛋白酶抑制活性峰部分，于20 mmol/L的HAc-NaAc (pH 4.0)缓冲液中透析21 h，期间分别间隔1、2、4、6 h更换一次缓冲液，。透析后样品进一步上样于SP-Sepharose离子交换层析柱,经20 mmol/LHAc-NaAc (pH 4.0_6.0)的缓冲液洗脱，得到纯化的大豆胰蛋白酶抑制剂(STI)。蛋白的纯化效果如图1A和图1B，其中泳道M为蛋白标准分子量，泳道I为纯化的STI ;从图中可以看出泳道I除了 STI条带外，不存在其它条带，即经过一系列的分离纯化，得到了高度纯化的STI。纯化的STI抑制活性采用荧光底物进行鉴定。即取50 μ L纯化的STI加入850UL 20 mM Tris-HCl (pH 8.0)缓冲液中，再加入50 μ L适量浓度的猪胰蛋白酶(Sigma公司)混勻，常温孵育 10 min 后，加入 10 μ mol/L 突光底物 Boc-Phe-Ser-Arg-MCA (PeptideInstitute公司，日本)50 μ L于37 °C反应10 min,用1.5 mL终止液(甲醇:异丙醇:水=35:30:35 v:v:v)终止反应。反应释放的产物 7-amino-4-methylcoumarin (AMC)用突光分光光度计(FP-6200，JASC0，日本)，在激发波长380 nm和发射波长450 nm下进行测定。所得到的值即STI的抑制活力用Ti表示。对照(胰蛋白酶酶活力)的测定方法类似，即将50 μ L的缓冲液代替50 μ L纯化的STI反应，所测得的值用T表示。抑制活力单位(Unit)定义为将丝氨酸蛋白酶活性降低I个活力单位的抑制活性，其中丝氨酸蛋白酶的活力单位定义为每分钟释放I nmol AMC所需要的酶量。抑制率采用百分数I (%)表示，计算公式如下:1 (%) = ( (T-Ti)/T) X IOOo结果如图2所示,横坐标表示纯化的STI的浓度,纵坐标表示抑制率I (%)，从图中可以看出，当纯化的STI浓度为1/64000 mg/mL (15.6 ng/mL)时，对胰蛋白酶仍然有10 %左右的抑制活性，纯化STI的JCki (导致丝氨酸蛋白酶活力下降50 %的抑制剂浓度)为1/32000 mg/mL即31.3 ng/mL，说明纯化的STI对胰蛋白酶具有强烈的抑制效果。实施例2抗大豆蛋白STI单克隆抗体的制备
选择5只雌性、6 8周龄的BALB/c小鼠(上海斯莱克实验动物有限公司)，将实施例1得到纯化的大豆蛋白STI经110 °C，处理30 min后(100 μ L)与等体积的弗氏完全佐剂(Sigma)混匀所得即为抗原，每只小鼠100 μ g抗原的剂量进行腹腔注射；之后每隔2周以相同剂量的抗原加强免疫；免疫3次后，对小鼠进行尾部取血，利用间接ELISA法检测小鼠血清效价，即抗原以2 yg/mL的浓度包被酶标板，4 1:包被过夜，以200 μ L/孔TBST洗涤5遍，经5 %的脱脂奶37 °C条件下温育1.5 h，以200 μ L/孔TBST洗涤2遍，将小鼠抗血清以 1:200、1:1000、1:5000、1:10000、1:20000、1:60000、1:240000 的稀释度稀释，50 μ L/孔加样，37 °C条件下温育I h，用TBST以200 μ L/孔洗涤2遍，HRP标记的羊抗鼠二次抗体1:5000稀释使用，以100 μ L/孔加样，37 °C条件下温育I h，用TBST以200 μ L/孔洗漆 3 遍,加 100 μ L/ 孔 TMB (3，3’，5, 5’ -Tetramethylbenzidine 3, 3’，5，5’ -四甲基联苯胺)显色液，反应20 min后，加入50 μ L/孔的H2SO4终止反应，酶标仪测定OD450 nm读数，选择抗体滴度最高的一只小鼠(血清稀释度为1:10000时，OD45tl nm为1.294)在细胞融合前4天，进行强化免疫I次。免疫量仍然为每只小鼠100 μ g抗原。分离强化免疫的小鼠脾脏淋巴细胞，将其与SP2/0骨髓瘤细胞(中国科学院细胞库)在聚乙二醇(Sigma)的介导下进行融合；融合后的细胞在含有I % HAT (Sigma)和20%胎牛血清(Invitrogen)的RPMI 1640 (Invitrogen)培养基中37 °C培养；杂交瘤细胞通过ELISA法进行筛选(方法同之前提供的间接ELISA法)。筛选出的阳性细胞采用有限稀释法进行克隆化培养，该操作重复3次以保证筛选出能分泌抗STI抗体的单克隆阳性细胞株。筛选的能分泌抗STI单克隆抗体的阳性细胞株进行扩大培养，收集培养上清，在1500 g离心10 m in，取上清即得抗STI单克隆抗体。将得到的单克隆抗体与平衡缓冲液(20mmol/L的PBS，pH 7.0)混合后，上样于预先用20 mmol/L的PBS (pH 7.0)平衡的ProteinG Sepharose亲和层析柱(Amersham Biosciences),收集该部分样品(未吸附部分);继续用平衡缓冲液流洗至A28tl nm为基线，然后以0.1 mol/L glycine (甘氨酸)-HCl (pH 2.7)进行洗脱至A28tlnm为基线，收集时先在离心管中预先加入100 μ L lmol/L Tris-HCKpH 9.0)的缓冲液，每管收集I mL，洗脱部分所得样品称为吸附部分。分别将细胞培养上清、未吸附部分及吸附部分的蛋白峰经SDS化后(样品:上样缓冲液=3:1，v:v)，进行SDS-PAGE电泳分析,结果如图3泳道1、2、3所示。说明经Protein G Sepharose亲和层析柱的纯化,去除了杂蛋白，得到了高度纯化的抗STI单克隆抗体，如泳道3所示(吸附部分)，在还原条件下(力口入β-巯基乙醇)分别显示出50 kDa左右的重链和25 kDa左右的轻链。将得到的单克隆抗体进行特异性分析，结果见图1A和B，其中泳道M为蛋白分子量标准，泳道I为纯化的STI ；泳道2为空白对照(鱼肉+淀粉)；泳道3为大豆分离蛋白，图1A的SDS-PAGE电泳所示，除纯化的STI，空白对照及大豆分离蛋白均含有许多杂蛋白，但图1B (抗STI单克隆单克隆抗体的Western blot分析)结果显示,大豆分离蛋白及纯化的STI只在STI处存在免疫反应，空白对照(鱼肉+淀粉)则没有任何反应条带。说明制备的抗STI单克隆抗体具有较好的特异性，除大豆蛋白STI外，不与大豆及鱼肉淀粉中的其它杂蛋白发生免疫反应。抗大豆蛋白STI单克隆抗体的生物素标记:将纯化的抗大豆蛋白STI单克隆抗体经脱盐柱(thermo)处理，使抗体缓冲液置换成含有0.15 mol/L NaCl的0.1 mol/L PBSCpH
7.2)。标记前预先将生物素(Sulfo-NHS-LC-Biotin，Pierce，美国)回温至室温，配置成10mmol/L生物素溶液，并将10 mmol/L生物素和脱盐处理后的抗大豆蛋白STI单克隆抗体以80:1 (摩尔比)的比例混匀，于冰上孵育2 h，再通过脱盐柱(thermo)去除未结合的生物素。由于生物素与亲和素特异性的相互作用可使检测信号有效放大，大大提高本发明检测体系的灵敏度。
实施例3灵敏度检测试验
鱼丸的制备:以鲜活的鲢鱼为原料。用10 1:左右的低温水冲洗干净，除去表面附着的黏液和污物，然后去鳞、去头、去内脏，用低温水漂洗3次。分离鱼肉,剔除鱼骨、鱼皮。将鱼肉切成薄片，用3 10 °C的冰水漂洗(鱼:水=1:5，w: V)，先慢速搅拌10 min，使水溶性蛋白等成分充分溶出，然后静置，使鱼肉充分沉淀，弃去上清液，如此重复3次。漂洗后的鱼肉脱水后，充分绞碎。将绞碎的鱼肉置于预先冷却好的研钵中，进行擂溃，擂溃分三阶段进行:空擂10 15 min ;盐擂20 30 min ;然后按照鱼肉:淀粉=5:1 (w:w)的比例,添加玉米淀粉进行充分擂溃后，分组制备含(O %、0.01 %、0.0125 %、0.025 %、0.05 %、0.I %、0.5 %)(w:w)大豆蛋白的鱼丸，每组制备100 g,(例如:制备含0.5 %大豆蛋白的鱼丸，即称取0.5g的大豆蛋白粉末加入99.5 g (鱼肉+淀粉),继续擂溃10 min。),该工序整个过程中温度不超过10 °C。用手工成丸，将水温控制在40 °C左右，定型20 min，之后在水温85 95°C水煮。待鱼丸全部漂起，即可捞出，采用水冷的方法将鱼丸冷却。将含不同大豆蛋白的自制鱼丸分别取100 g剁碎后，取20 g加入120 mL含有0.1mmol/L DTT (Dithiothreitol) (二硫苏糖醇)的7 mol/L尿素提取液中，组织捣碎后,4000g离心20 min，所得上清即为自制鱼丸粗提液。将自制鱼丸粗提液进行SDS-PAGE电泳后，转移到硝酸纤维素膜，采用生物素标记的抗STI单克隆抗体(实施例2所得)为一抗、辣根过氧化物酶标记的亲和素(Sigma)为二抗，以 ECL (Enhanced chemiluminescence method增强化学发光法)化学发光显色液(Thermo)进行Western blot分析。结果如图4所示，其中泳道I为空白对照；泳道2-7为自制鱼丸样品，大豆蛋白的添加量分别为0.01 %、0.0125%、0.025 %、0.05 %、0.1 %和0.5 %。从图4可以看出，大豆蛋白的添加量为0.025%及更高含量时条带清晰，说明本发明检测方法的灵敏度高，可实现对0.025 %及以上的大豆蛋白添加量的准确检出。实施例4市售鱼糜制品中大豆蛋白的检测
购买6种不同的鱼糜制品，分别取100 g剁碎后，取20 g加入120 mL含有0.1 mmol/L DTT的7 mol/L尿素提取液中，组织捣碎后，4000 g离心20 min，所得上清即市售鱼丸粗提液。对粗提液进行Western blot法进行分析(同实施例3步骤)。结果如图5所示，其中泳道I为空白对照；泳道2-7为市售的不同鱼糜制品；泳道8为阳性对照即自制鱼丸样品(大豆蛋白的添加量为2 %)。从图中可以看出，空白对照没有条带，阳性对照的目的条带清晰，检测的6种市售鱼糜制品中均含有大豆蛋 白，与阳性对照(含有2 %大豆蛋白的自制鱼丸)的条带粗细相比可知，检测的鱼糜制品中，泳道2和3所代表的鱼糜制品中含有的大豆蛋白含量最高，泳道4-6所代表的鱼糜制品中含有的大豆蛋白含量次之，泳道7所代表的鱼糜制品中含有的大豆蛋白含量较少，条带较淡。以上所述的具体实施例，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明。所应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施例而已，并不用于限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
权利要求
1.一种抗STI单克隆抗体，其特征在于，其制备方法为:将纯化的大豆胰蛋白酶抑制剂STI经过高温处理后免疫BALB/c小鼠，优选纯化的大豆胰蛋白酶抑制剂STI经过100-1200C处理10-30 min ;经细胞融合，筛选获得能分泌抗STI单克隆抗体的细胞株，经细胞培养获得。
2.权利要求1所述的抗STI单克隆抗体,还包括将获得的单克隆抗体通过ProteinGSepharose亲和柱进行纯化的步骤。
3.权利要求1或2所述的抗STI单克隆抗体的制备方法，其特征在于，包括如下步骤:将纯化的大豆胰蛋白酶抑制剂STI经过高温处理后免疫BALB/c小鼠，优选纯化的大豆胰蛋白酶抑制剂STI经过100-120 °C处理10-30 min ;经细胞融合，筛选获得能分泌抗大豆胰蛋白酶抑制剂单克隆抗体的细胞株，经细胞培养获得抗体。
4.权利要求3所述抗STI单克隆抗体的制备方法，还包括将获得的单克隆抗体通过Protein G Sepharose亲和柱进行纯化的步骤。
5.权利要求1或2所述抗STI单克隆抗体的用途。
6.权利要求5的用于检测鱼糜制品中大豆蛋白的用途。
7.一种用于检测鱼糜制品中大豆蛋白的方法，其特征在于，包括如下步骤: 将待检样品用提取液抽提后，以制备的生物素标记的权利要求1或2所述抗STI单克隆抗体进行Western blot检测分析。
8.权利要求7所述方法，其特征在于，所述提取液为含有0.1 mmol/L DTT的6_8 mol/L尿素。
9.权利要求7所述方法，其特征在于，所述生物素标记的权利要求1或2所述抗STI单克隆抗体是将权利要求1或2所述抗STI单克隆抗体经脱盐处理后，与生物素混匀，于冰上孵育得到。
全文摘要
本发明涉及一种抗大豆胰蛋白酶抑制剂(Soybeantrypsininhibitor,STI)抗体、制备方法及其用途。抗大豆胰蛋白酶抑制剂抗体制备方法为将纯化的大豆胰蛋白酶抑制剂STI经过高温处理后免疫BALB/c小鼠，优选纯化的大豆胰蛋白酶抑制剂STI经过100-120oC处理10-30min；经细胞融合，筛选获得能分泌抗STI单克隆抗体的细胞株，经细胞培养获得。还包括将获得的单克隆抗体通过ProteinGSepharose亲和柱进行纯化的步骤。本发明所得到的抗STI抗体还可用于检测鱼糜制品中大豆蛋白的添加。该检测方法的灵敏度高，特异性好，准确性高，简便快捷。
文档编号G01N33/68GK103102413SQ20131001958
公开日2013年5月15日 申请日期2013年1月21日 优先权日2013年1月21日
发明者蔡秋凤, 曹敏杰, 江韬玲, 沈建东, 刘光明, 苏文金 申请人:集美大学