专利名称：一种苦荞麦胰蛋白酶抑制剂基因tbti的克隆和表达方法
技术领域：
本发明属于生物工程技术领域，更具体的，本发明涉及一种苦荞麦胰蛋白酶抑制剂基因(TBTI)的克隆和表达方法。
背景技术：
蛋白酶抑制剂(Protease Inhibitor，PI)是一类对蛋白酶有抑制作用多肽或蛋白质，能够抑制蛋白水解酶活性，它存在于所有生物体中，是自然界中含量最为丰富的蛋白种类之一。自从40年代发现豆科植物中存在蛋白酶抑制剂以来，在动物、植物和微生物体内已发现普遍存在着多种类型的蛋白酶抑制剂(PI)，后来又陆续在20种植物中发现这类蛋白，如烟草、番茄、马铃薯、豌豆、玉米、菜豆、小麦、大麦等。PI能与蛋白酶的活性部位和变构部位结合，抑制酶的催化活性或阻止酶原转化为有活性的酶。因此它具有防止体内不必要的蛋白降解，调节蛋白代谢及调节各种蛋白酶的生理活性的功能，与相应蛋白水解酶形成一定动态平衡，调节生物体内许多重要生命活动。例如，PI对胰腺炎、肺气肿、癌症、HIV 等疾病有一定疗效，已引起医药学界普遍关注。很多植物的PI还具抑制某些病原微生物及某些昆虫体内蛋白酶的作用，是植物体的一种自然防御体系，因此PI也具有抗病虫害天然防御功能，可削弱或阻断昆虫消化道内蛋白酶对食物蛋白质消化作用限制氨基酸的释放而使昆虫因缺少营养非正常发育或死亡，是抗虫基因工程的理想元件。PI还能抑制某些病原微生物的核酸复制和侵染相关酶，从而起到抗病原微生物(细菌、真菌和病毒)的作用。PI 目前被广泛应用于医药、农业、食品和生物工程等领域中。荞麦是蓼科(Polygonaceae)、荞麦属O^agopy-Film Mill)的双子叶禾谷类作物， 又名乌麦、花麦或三角麦。荞麦有苦荞(F.tataricum，又称野荞麦、鞑靼荞、万年荞、野南荞)、甜荞(F. esculentum,又称普通荞麦)、金荞和齿翅野荞4种。我国常见的有苦荞和甜荞2种，其中苦荞为中国独有。俄罗斯是世界最大的荞麦生产国，中国次之。目前，我国荞麦主要分布在西北、东北、华北以及西南一带高寒山区，四川省凉山彝族自治州是苦荞麦的主要产区和起源地之一。荞麦蛋白酶抑制剂对人体有益，它不但能降血糖、降血脂、降血压、防止便秘、抑制胆结石和抗衰老，而且能够抗癌和防治艾滋病，更吸引人的是，蛋白酶抑制剂对植物的保护作用，对人体TALL细胞的生长抑制作用，预示了其在生物农药、辅助治疗白血病、生物技术应用中的潜在前景。尽管荞麦种子中的蛋白酶抑制剂已引起人们广泛关注，但与来自大豆、可豆、水稻、马铃落等植物中的PI相比，苦荞麦蛋白酶抑制剂的研究还需要进一步深入。目前对于甜荞一级结构的报道大约已有10种左右，对于编码其蛋白序列的基因序列的克隆和原核表达也有人报道。对苦荞麦蛋白酶抑制剂的纯化和特性研究已有相关报道，但对苦荞麦蛋白酶抑制基因结构及其表达调控的研究还处于空白。本发明利用已知的甜荞麦胰蛋白酶抑制剂氨基酸序列和其它十几种植物胰蛋白酶抑制剂的氨基酸序列进行氨基酸序列比对，找出相对保守的氨基酸序列，然后设计兼并引物克隆出TBTI基因的保守序列，再利用Genome-walking技术和3’RACE技术克隆出TBTI 的全长基因序列，并实现其在真核生物的高效表达，结合已知的蛋白质序列进行分析，得出基因表达与调控的相关信息，为进一步研究其生理功能和表达调控做好准备。
发明内容
本发明的目的是克隆出TBTI的全长基因序列，并实现其在真核生物的高效表达， 为下一步把TBTI基因转入小麦、玉米和水稻等作物，提高其抗虫(小菜娥、玉米螟、甘蓝夜蛾等)和抗病(小麦赤霉病、玉米大斑病、水稻稻瘟病等)能力打下基础。本发明的具体实施步骤如下1、TBTI基因保守区序列的获得根据其它植物胰蛋白酶抑制剂的蛋白质氨基酸序列利用DNAMAN和ClustalW2. 0两种生物信息学软件进行多重序列比对找出两个保守区的氨基酸序列=WPELVG和RCDRV，利用已经测得的苦荞麦胰蛋白酶抑制剂N-端氨基酸序列和甜荞的胰蛋白酶抑制剂基因序列设计兼并引物Pl :TGGCCNGARCTNGTTGGA和P2 RACNCAYACNCGGTCACA，送hvitrogen公司合成引物，进行PCR扩增.2、TBTI基因5，末端序列的获得参照Takara公司Genome-Walking试剂盒说明书，根据已克隆的保守序列设计3条特异引物SPl TCACAACGAAAGTCGAAAGTGC, SP2 GGTGGCTAGAGTGGTTAAAGGAGG、SP3 :CTTCCCTTTGGTTCCAACAAGC，利用试剂盒自带的 3 个兼并引物API、AP2、AP3分别进行3次PCR，PCR产物经1 %琼脂糖凝胶电泳，采用琼脂糖凝胶回收试剂盒(Omigal公司)回收后，与pGEMT Easy vector (ftOmega，美国)连接，转化大肠杆菌DH5ci感受态细胞，含100mg/ml青霉素的LB平板筛选阳性克隆，阳性克隆进一步经T 载体引物的菌落PCR鉴定后，37°C培养12h，采用质粒DNA提取试剂盒(Omigal公司)提取质粒DNA，送北京诺赛基因公司测序。利用NCBI (www. ncbi. nih. gov)的BLAST在线分析工具进行序列比对分析。蛋白质的翻译采用ExPASy网站的tool (http //expasy. org/tools/ dna. html)进行。3、TBTI基因3，末端序列的获得3，RACE cDNA第一链合成按TaKaRa公司试剂盒的说明书操作，参照TaKaRa公司3’ RACE试剂盒说明书，根据已克隆的保守序列设计2条特异引物外部引物GSPl GCAGCCACCATAGATAAGGAGAA和内部引物GSP2 CTTTAACCACTCGCCACCTGC，利用试剂盒自带的2个兼并引物(外部引物AP1和内部引物AP2) 分别进行2次PCR，PCR产物经琼脂糖凝胶电泳，采用琼脂糖凝胶回收试剂盒(Omigal公司)回收后，与pGEMT Easy vector (ftOmega，美国)连接，转化大肠杆菌DH5 α感受态细胞，含100mg/ml青霉素的LB平板筛选阳性克隆，阳性克隆进一步经T载体引物的菌落PCR 鉴定后，37°C培养12h，采用质粒DNA提取试剂盒(Omigal公司)提取质粒DNA，送北京诺赛基因公司测序。利用NCBI (www. ncbi. nih. gov)的BLAST在线分析工具进行序列比对分析。 蛋白质的翻译采用 ExPASy 网站的 tool (http//expasy. org/tools/dna. html)进行。4、TBTI全长基因的获得，实现了苦荞麦胰蛋白酶抑制剂基因在毕赤酵母中的高效表达。设计带酶切位点的弓丨物Pl :CCGGAATTCCATGTTAATTTACGCTAAAGTT P2 GAATGCGGCCGCTCAACCGACGGTTGG将回收的PCR产物经EcoR I，Not I双酶切后，连入同样经过双酶切的含有AOXl启动子和氨苄青霉素、卡那霉素抗性基因的表达载体pPIC9K中；使用电击转化的方法，将含有TBTI基因的表达载体质粒转入毕赤酵母GS115感受态细胞中，通过MD平板筛选出阳性转化子。
图1 :TBTI基因保守区PCR扩增电泳检测泳道M为Marker I泳道2为目的片段；图2 =TBTI基因3’端序列PCR扩增电泳检测泳道M为Marker I，无标记泳道为第一轮PCR产物，泳道1为第二轮PCR产物；图3 =TBTI基因5’端序列PCR扩增电泳检测泳道M为Marker I，无标记泳道为第一轮和第二轮PCR产物，泳道1为第三轮PCR产物；图4 =TBTI基因全长序列的PCR扩增电泳检测泳道M为Marker I，泳道1为目的片段。
具体实施例方式下面结合具体实施例对本发明做进一步阐述，但实施例不限制本发明的保护范围。下述实施例中，所用的试验材料及其来源包括1、材料、菌株和质粒；苦荞麦种子由西昌学院食品系胡建平副教授惠赠，大肠杆菌DH5 α本实验室构建，受体菌酵母GSl 15购自hvitrogen公司，酵母表达载体pPIC9K购自hvitrogen公司， 克隆载体PMD19-T Vector,Genome-walking试剂盒和3，RACE试剂盒购自大连宝生物公司。2、化学试剂和酶制剂；EcoR I、Not I、氨节青霉素、卡那霉素、T4 DNA Ligase, Taq DNA Polymerase、 Prime STAR 高保真聚合酶、dNTP、DNA Maker DL2000 DNA Maker I 购自 Takara Biotechnology，质粒提取试剂盒、纯化试剂盒、凝胶回收试剂盒购自OMEGA。NaCl、NaOH, HCl、K2HPO4 · 3H20、KH2PO4, MgCl2JjC乙酸、甲醇、甲酸、蛋白胨、酵母抽提物、葡萄糖、蔗糖、琼脂粉、生物素、无氨基酸酵母氮源(YNB)、甘油、琼脂糖、乙二胺四乙酸 (EDTA)、Tris-HCl、十二烷基硫酸钠(SDQ、考马斯亮蓝R250、丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺、 过硫酸铵、N，N, N’ N’ -四甲基乙二胺(TEMED)等。3、引物合成；本发明涉及的引物由hvitrogen公司合成。下述实施例中常规的基因操作方法参照《分子克隆实验指南》(第三版)。实施例1 :TBTI保守区的获得；(一 )实验方法1、苦荞麦基因组DNA提取将荞麦种子于室温无土培养至根尖Icm长时剪取备用，或将种子种于花盆培养至长出第一对子叶时备用；称取新鲜备用材料0. 3g，置于陶瓷研钵中，加入液氮研磨成细粉， 分装于Eppendorf管中；加ImlRNA提取缓冲液和SDS (终浓度为1 % )，剧烈振荡2min， 65°C，保温20min。加5mol/LKAc (终浓度为lmol/L)，充分混勻后冰浴20min, 4°C 8000g离心15min ；吸取上清，加入0. 6倍体积的异丙醇，混勻，_20°C放置Ih以上，4°C 12000g离心15min ；弃上清，沉淀用Iml 70%的乙醇(_20°C预冷)洗1次，4°C 12000g离心IOmin ；弃上清，用lmll00%的乙醇(_20°C预冷)洗沉淀1次，4°C 12000g离心IOmin ；吸去上清，将管口用封口膜封好，膜上扎小孔，真空干燥后以25ml灭菌水溶解DNA，_70°C保存。2、TBTI基因保守区的PCR扩增根据其它植物胰蛋白酶抑制剂的蛋白质氨基酸序列利用DNAMAN和ClustalW2. 0 两种生物信息学软件进行多重序列比对找出两个保守区的氨基酸序列=WPELVG和RCDRV， 利用已经测得的苦荞麦胰蛋白酶抑制剂N-端氨基酸序列和甜荞的胰蛋白酶抑制剂基因序列设计兼并引物Pl :SEQ ID N0:11和P2:SEQ ID NO :12，，送hvitrogen公司合成引物，进行 PCR 扩增，PCR 反应体系为 10XPCR buffer 2. 5 μ L，2. 5mmol/L dNTPs 2. 0 μ L, 25mmol/ L MgCl2 1.5口1^，1(^11101/1引物各1.(^1^，5"]\1 1 Taq 聚合酶 0· 2 μ L，50ng/μ L DNA 模板 2. 5μ L，加 ddH20 M 25 μ L0 反应条件为 94°C预变性 4min ；94°C变性 lmin，47°C退火 lmin， 72°C延伸lmin, 35个循环；最后72°C延伸10min，4°C保存。( 二)实验结果1、PCR反应产物经1. 5%琼脂糖凝胶电泳检测，大小约150bp (图1)。2、PCR扩增得到的TBTI基因保守区序列连T载体，转化到大肠杆菌DH5 α，送北京诺赛基因公司测序结果(SEQ ID NO 1)及翻译成蛋白质(SEQ ID NO :2)。实施例2 =Genome-Walking克隆TBTI 5，端基因序列(一 )实验方法1、参照Takara公司Genome-Walking试剂盒说明书，根据已克隆的保守序列设计3 条特异引物 SPl (SEQ ID NO :13),SP2(SEQ ID NO 14)、SP3 (SEQ ID NO 15)，利用试剂盒自带的3个兼并引物API、AP2、AP3分别进行3次PCR，PCR产物经1 %琼脂糖凝胶电泳，采用琼脂糖凝胶回收试剂盒(Omigal公司)回收后，与pGEMT Easy vector (ftOmega，美国)连接，转化大肠杆菌DH5 α感受态细胞，含100mg/ml青霉素的LB平板筛选阳性克隆，阳性克隆进一步经T载体引物的菌落PCR鉴定后，37°C培养12h，采用质粒DNA提取试剂盒(Omigal 公司)提取质粒DNA,送北京诺赛基因公司测序。利用NCBI (www. ncbi. nih. gov)的BLAST 在线分析工具进行序列比对分析。蛋白质的翻译采用ExPASy网站的tool (http//expasy. org/tools/dna. html)进行。( 二)实验结果1、三轮PCR反应产物经1. 5%琼脂糖凝胶电泳检测，大小约210bp (图2)。2、PCR 扩增得到的TBTI基因5’端序列连T载体，转化到大肠杆菌DH5 α，送北京诺赛基因公司测序结果(SEQ ID NO 3)及翻译成蛋白质(SEQ ID NO 4)。实施例3 :3，RACE克隆TBTI 3，端基因序列3，RACE cDNA第一链合成按TaKaRa公司试剂盒的说明书操作，参照TaKaRa公司 3'RACE试剂盒说明书，根据已克隆的保守序列设计2条特异引物外部引物GSPl (SEQ ID NO 16)和内部引物GSP2(SEQ ID NO 17)，利用试剂盒自带的2个兼并引物(外部引物APl 和内部引物AP》分别进行2次PCR，PCR产物经琼脂糖凝胶电泳，采用琼脂糖凝胶回收试剂盒(Omigal公司)回收后，与pGEMT Easy vector (ftOmega，美国)连接，转化大肠杆菌 DH5 α感受态细胞，含100mg/ml青霉素的LB平板筛选阳性克隆，阳性克隆进一步经T载体引物的菌落PCR鉴定后，37°C培养12h，采用质粒DNA提取试剂盒(Omigal公司)提取质粒DNA，送北京诺赛基因公司测序。利用NCBI (www. ncbi. nih. gov)的BLAST在线分析工具进行序列比对分析。蛋白质的翻译采用ExPASy网站的tool (http //expasy. org/tools/dna. html)进行。( 二)实验结果1、两轮PCR反应产物经1. 5%琼脂糖凝胶电泳检测，大小约^Obp (图3)。2、PCR扩增得到的TBTI基因3’端序列连T载体，转化到大肠杆菌DH5 α，送北京诺赛基因公司测序结果(SEQ ID NO 5)及翻译成蛋白质(SEQ ID NO :6)。实施例4 苦荞麦胰蛋白酶抑制剂基因TBTI全长序列的真核表达以苦荞麦基因组DNA为模板，采用合成的上游引物(SEQ ID NO :7)和下游引物 (SEQ ID NO :8)，通过PCR获得目的片段。用EcoR I和Not I对PCR产物及pPIC9K真核表达载体分别进行双酶切，连接。将鉴定的重组质粒转化至表达菌株GS115中构建GS115/ Ppic9k/TBTL·将获得的重组载体pPIC9k-TBTI质粒用Mc I酶切，回收片段后电击转化巴斯德毕赤酵母。毕赤酵母感受态准备、电击转化均参照Invitrogen公司毕赤酵母操作手册。将获得的转化子分别点种到匪和MD平板，并设阳性对照GS115 β -gal (Hi s+Mut+)和阴性对照GSl 15Albumin (His+Muts)，在匪平板和MD平板均能正常生长的菌落为阳性菌落。随机挑选30个阳性菌落接种5ml BMGY中，30°C剧烈振荡培养Mh，离心收集菌体，加:3ml BMMY 诱导培养基，30°C继续培养48h。筛选出酶活性较高的菌株，命名GS115-pPIC-TBTIX(X为菌株编号)。将GSl 15-pPIC-TBTIX接种于50mLBMGY中，30°C，220r/min振荡培养，离心收集菌体，加入诱导培养基(利用1. 2. 4优化的条件)，30°C，220r/min继续培养，分别在O、12、24、 36、48、60、72、84、96、108和12011收集上清，通过对上清液进行抑制活性测定和SDS-PAGE分析，检测重组蛋白的表达情况。1、质粒载体pPIC9K的准备培养含有pPIC9K质粒的大肠杆菌DH5 α于IOmL卡那抗性LB液体培养基中37°C 培养过夜，使用质粒提取试剂盒按说明书提取PPIC9K质粒。2) PCR产物、pPIC9K质粒的双酶切处理分别取上述PCR产物、pPIC9K质粒进行EcoR I、Not I双酶切，酶切方法如下
权利要求
1.一种苦荞麦胰蛋白酶抑制剂基因TBTI的克隆和表达方法，其特征在于，包含以下步骤Al，TBTI基因保守区序列的获得根据其它植物胰蛋白酶抑制剂的蛋白质氨基酸序列利用DNAMAN和ClustalW2. 0两种生物信息学软件进行多重序列比对找出两个保守区的氨基酸序列=WPELVG和RCDRV，利用已经测得的苦荞麦胰蛋白酶抑制剂N-端氨基酸序列和甜荞的胰蛋白酶抑制剂基因序列设计兼并引物Pl =SEQ ID NO 11和P2 =SEQ IDNO :12，送 Invitrogen公司合成引物，进行PCR扩增；A2,TBTI基因5’末端序列的获得参照Takara公司Genome-Walking试剂盒说明书，根据已克隆的保守序列设计3条特异引物SPl =SEQ ID NO :13、SP2 =SEQ ID NO :14、SP3 =SEQ ID N0:15，利用试剂盒自带的3个兼并引物分别进行3次PCR，PCR产物经1 %琼脂糖凝胶电泳，采用琼脂糖凝胶回收试剂盒回收后，与pGEMT Easy vector连接，转化大肠杆菌DH5 α 感受态细胞，含100mg/ml青霉素的LB平板筛选阳性克隆，阳性克隆进一步经T载体引物的菌落PCR鉴定后，37°C培养12h，采用质粒DNA提取试剂盒提取质粒DNA，送北京诺赛基因公司测序；A3，TBTI基因3，末端序列的获得3，RACE cDNA第一链合成按TaKaRa公司试剂盒的说明书操作，参照TaKaRa公司3’ RACE试剂盒说明书，根据步骤Al已克隆的保守区序列设计2条特异引物外部引物GSPl :SEQ ID NO :16和内部引物GSP2 :SEQ ID N0:17，利用试剂盒自带的2个兼并引物，分别进行2次PCR，PCR产物经琼脂糖凝胶电泳，采用琼脂糖凝胶回收试剂盒回收后，与pGEMT Easy vector连接，转化大肠杆菌DH5 α感受态细胞，含 100mg/ml青霉素的LB平板筛选阳性克隆，阳性克隆进一步经T载体引物的菌落PCR鉴定后，37°C培养12h，采用质粒DNA提取试剂盒提取质粒DNA，送北京诺赛基因公司测序；A4.TBTI全长基因的获得及在毕赤酵母中的高效表达设计带酶切位点的引物P1、P2， 将回收的PCR产物经EcoR I, Not I双酶切后，连入同样经过双酶切的含有AOXl启动子和氨苄青霉素、卡那霉素抗性基因的表达载体PPIC9K中；使用电击转化的方法，将含有TBTI 基因的表达载体质粒转入毕赤酵母GSl 15感受态细胞中，通过MD平板筛选出阳性转化子；
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤Al中的PCR反应参数为 IOXPCR buffer 2. 5μ L,2. 5mmol/L dNTPs 2. O μ L, 25mmol/L MgCl2L 5 μ L，10 μ mol/L 引物各 1. O μ L，5U/M1 Taq 聚合酶 0. 2 μ L，50ng/ μ L DNA 模板 2. 5 μ L,加 ddH20 至 25 μ L。反应条件为94°C预变性^iin ；94°C变性lmin，47°C退火lmin，72°C延伸lmin，35个循环；最后 72°C 延伸 10min，4°C 保存。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤A4中的酶切方法如下
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤A4中的毕赤酵母GSl15感受态细胞的制备方法为将毕赤酵母GS115划线接种YPD平板，28-30°C培养直至长出单菌落； 挑取一个单菌落，接种至含有5mL YPD培养基的50mL三角瓶中，28-30°C、250-300rpm培养过夜；取300 μ L的培养物接种至含有500ml YPD液体培养基中，28-30°C >250-300rpm培养过夜，至0D600达到1. 3左右；将细胞培养物于4°C，1500g离心5min，用500ml的冰预冷的无菌去离子水重悬菌体；4°C，1500g离心5min，用250mL的冰预冷的无菌水重悬菌体；4°C， 1500g离心5min，用20mL的冰预冷的lmol/L的山梨醇溶液重悬菌体；4°C，1500g离心5min， 用2mL的冰预冷的lmol/L的山梨醇溶液重悬菌体，等分细胞悬液为100 μ L/管。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤Α4中所述电击转化的方法为 吸取20 μ L的线性化DNA加入100 μ L酵母感受态细胞中，边加入边搅拌混勻，然后转入 0. 2cm冰预冷的电转化杯中，将电转化杯冰浴5min，在Bio-Rad电穿孔仪上选择毕赤酵母电击参数，进行电击并同时进行电击条件的优化，电击完毕后，立即加入Iml冰预冷的lmol/L 的山梨醇溶液将菌体混勻，转至1. 5mL离心管中，28-30°C温育30min，将菌体悬液涂布于MD 平板上，每400 μ L涂布一块平板，将平板置于培养，直至单个菌落出现，即为含有苦荞麦胰蛋白酶抑制剂基因TBTI的转化子。
全文摘要
本发明公开了一种苦荞麦胰蛋白酶抑制剂基因TBTI的克隆和表达方法，包含以下步骤A1，TBTI基因保守区序列的获得；A2，TBTI基因5’末端序列的获得；A3，TBTI基因3’末端序列的获得；A4，TBTI全长基因的获得；实现了苦荞麦胰蛋白酶抑制剂基因在毕赤酵母中的高效表达。
文档编号C07K14/81GK102191240SQ20111005076
公开日2011年9月21日 申请日期2011年3月3日 优先权日2011年3月3日
发明者吴琦, 廖 燕, 李成磊, 苟君波, 阮景军, 陈惠 , 韩学易 申请人:四川农业大学