专利名称：食甲基菌吡咯喹啉醌合成相关基因簇及其编码蛋白系统的制作方法
技术领域：
本发明属于微生物生物技术领域，具体涉及一种新的食甲基菌吡咯喹啉醌合成基因簇及其编码蛋白系统。
背景技术：
吡咯喹啉醌(Pyrroloquinoline quinone，PQQ)继吡啶核苷酸和核黄素后，于二十世纪七十年代发现的第三种氧化还原酶的辅酶，被认为是一种新的B族维生素。迄今为止， 已知能够合成PQQ的生物均为革兰氏阴性菌，其中以甲基营养菌的产量最高。研究表明， PQQ具有刺激某些微生物和动植物生长、防治肝损伤、促进神经生长因子生成、调节体内自由基水平和调节免疫等多种生理功能，可能用于阿尔茨海默氏症、心血管疾病和糖尿病等疾病的防治。已知能够合成PQQ的生物包括有乙酸钙不动杆菌 (Acinetobactercalcoaceticus)、月市炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)、焚光假单胞菌(Pseudomonas fluo—rescens)、扭月兑甲基杆菌(Methylobacteriumextorquens)、B誉有机甲基杆菌(Methylobacterium organophilum)、氧化葡||杆菌(Glu-conobacter oxydans)、 中 1、司肠细菌(Enterobacterintermedium)、耐$高身寸球菌(Deinococuus radiodurans)、草生欧文氏菌(Erwinia her-bicola)、鞭毛甲基菌(Methylobacteriu flagellatum)、绿脓假单 1 |if (Pseudomonas aeruginosa)等。PQQ的生物合成涉及4-7个基因(pqqA，B, C，D，Ε, F，G)，这些基因在染色体上一般成簇排列。有的Pqq基因连续排列成1个基因簇，如肺炎克雷伯氏菌为pqqABCDEF ；而有的则分布在2个基因簇中，如在扭脱甲基杆菌中有2个簇，一个为pqqAB⑶E，另一个为pqqFG。 有的Pqq基因与依赖PQQ的脱氢酶基因相邻。不同细菌的PQQ合成基因序列具有一定的保守性。除了已经确证pqqA编码多肽为PQQ合成前体以及pqqC是催化PQQ合成反应中最后一步反应的酶以外，其他基因的功能目前还不是很清楚。
发明内容
本发明的目的是提供一种食甲基菌吡咯喹啉醌合成基因簇及其编码蛋白系统。本发明的菌株MP688通过⑶H酶法从土壤中分离得到，食甲基菌(Methylovorus sp.)新菌株，已于2010年8月20日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址北京市朝阳区大屯路甲3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏编号为 CGMCC No. 4096。本发明所提供的吡咯喹啉醌合成蛋白系统，来源于食甲基菌MP688 (CGMCC No. 4096)，包括1)由 SEQ ID No. 3、SEQ ID No. 5、SEQ ID No. 7、SEQ ID No. 9 和 SEQ ID No. 11 所
示的氨基酸组成的蛋白质；或2)在 SEQ ID No. 3、SEQ ID No. 5、SEQ ID No. 7、SEQ ID No. 9 和 SEQ ID No. 11所示的氨基酸序列中经取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有同等活性的由1)衍生的蛋白质。 本发明还提供编码上述蛋白系统的基因簇，其为pqqAB⑶E基因簇。pqqAB⑶E基因簇的核苷酸序列如SEQ ID No. 1所示，全长3416bp，包括5个PQQ合成基因pqqA、pqqB、 pqqC、pqqD、pqqE。自 SEQ ID No. 15，端第 1 72 位碱基为 pqqA 基因序列(SEQ ID No. 2)， 编码蛋白序列为SEQ ID No. 3。自SEQ ID No. 15，端第235-1152位碱基为pqqB基因序列 (SEQ ID No. 4)，编码蛋白序列为 SEQ ID No. 5。自 SEQ ID No. 15，端第 1193-1924 位碱基为pqqC基因序列(SEQ IDNo. 6)，编码蛋白序列为SEQ ID No. 7。自SEQ ID No. 15，端第 1899-2183位碱基为pqqD基因序列(SEQ ID No. 8)，编码蛋白序列为SEQ ID No. 9。自SEQ ID No. 15，端第2232-3416位碱基为pqqE基因序列(SEQ ID No. 10)，编码蛋白序列为SEQ ID No. 11。 在pqqAB⑶E基因簇中，pqqA基因由单独的启动子控制，pqqB⑶E组成一个操纵子， pqqC和pqqD基因编码区有沈个碱基的重叠。MP688的PQQ合成基因与扭脱甲基杆菌AMl 的PQQ合成基因排列方式相同，两者pqqABCDE基因序列核苷酸相同性为53. 0%。本发明另一个目的在于提供另一个吡咯喹啉醌合成蛋白系统，包括1)由SEQ ID No. 14和SEQ ID No. 16所示的氨基酸组成的蛋白质；或2)在SEQ ID No. 14和SEQ ID No. 16所示的氨基酸序列中经取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有同等活性的由1)衍生的蛋白质。本发明还提供编码上述蛋白系统的基因簇，其为pqqAB⑶E基因簇和pqqFG基因簇。所述的PqqFG基因簇的核苷酸序列如SEQ IDNo. 12所示，全长2735bp，包括2个PQQ合成基因 pqqF、pqqG。自 SEQ ID No. 12 5，端第 1-1350 位碱基为 pqqF基因序列(SEQ IDNo. 13)， 编码蛋白序列为SEQ ID No. 14。自SEQ ID No. 12 5，端第1419_27；35位碱基为pqqG基因序列(SEQ ID No. 15)，编码蛋白序列为(SEQ ID No. 16)。食甲基菌MP688与扭脱甲基杆菌 AMl的pqqFG基因序列核苷酸相同性为49. 9%。本领域技术人员可以理解的是，上述的分离的蛋白质也包括那些氨基酸序列与 SEQ ID No. 3、SEQ ID No. 5、SEQ ID No. 7、SEQ IDNo. 9、SEQ ID No. 11、SEQ ID No. 14 和 SEQ ID No. 16所示的序列具有较高同源性的蛋白质，例如氨基酸序列同源性大于90%、甚至95 %、甚至98 %的各自蛋白的衍生蛋白。此外，本领域技术人员应当了解，考虑到密码子的简并性以及不同物种密码子的偏爱性，本领域技术人员可以根据需要使用适合特定物种表达的密码子。大肠杆菌DH5a自身不能合成PQQ，也没有PQQ合成基因。通过PCR扩增得到食甲基菌MP688的pqqAB⑶E基因簇，pqqFG基因簇，将上述两个基因组簇分别连入载体，导入大肠杆菌DH5 α中，表达得到吡咯喹啉醌合成相关蛋白，通过醌酶SDH活性DCIP法检测，能够检测到宿主菌有PQQ的合成。将带自身调控序列的pqqABCDE基因簇、带自身调控序列的pqqFG基因簇和 pqqAB⑶E基因簇+pqqFG基因簇连入广宿主质粒pBBRlMCS2，通过结合转移导入食甲基菌 MP688，能不同程度提高MP688的PQQ产量，并且两者有协同效应。含有PQQ合成基因簇的载体、细胞系及宿主菌均属于本发明的保护范围。本发明提供的pqqAB⑶E和/或pqqFG基因簇可应用于生产吡咯喹啉醌。
本发明的吡咯喹啉醌合成相关基因簇及其编码蛋白将在研究PQQ生物合成、改良和构建PQQ生产菌株和生产PQQ中起到重要作用。通过提高吡咯喹啉醌合成相关基因的基因剂量可以有效提高吡咯喹啉醌的产量。
图1为MP688基因组DNA琼脂糖凝胶电泳。其中M λ -Hindi11分子量标准；1 MP688基因组DNA。图2为食甲基菌MP688的染色体环状图谱。其中，从外圈到内圈依次代表1 正链上的编码序列；2 负链上的编码序列；3 :G+C含量，外凸代表大于基因组平均G+C含量，内凹代表小于基因组平均G+C含量；4 =GC skew曲线外凸代表大于0，内凹代表小于0。图3为MP688基因组中PQQ合成相关基因簇。其中A为pqqAB⑶E基因簇；B为 pqqR；基因簇。图4为pqqABCDE基因簇PCR扩增。其中M λ -HindIII分子量标准；1 :pqqABCDE
扩增产物。图5为pqqFG基因簇PCR扩增。M :Trans2K plusll分子量标准；1 :pqqFG扩增产物。图6 为 p0K12_pqqABCDE 的活性检测。1 阴性对照 p0K12/DH5 α ；2 :SDH+PQQ ；3 SDH ；4 =PQQ ；5 :SDH+p0K12-pqqABCDE/DH5 α 裂解液；6 :SDH+p0K12_pqqABCDE/DH5 α 上清液；7 :p0K12-pqqABCDE/DH5 α 裂解液；8 :p0K12_pqqABCDE/DH5 α 上清液。图7为导入PQQ合成基因簇对食甲基菌MP688PQQ产量的影响。
具体实施例方式以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。实施例1ΜΡ688菌株基因组DNA的提取挑取食甲基菌ΜΡ688单菌落，接种到MPQ液体培养基(1L MPQ培养基中0.2g MgSO4 · 7H20，3g (NH4)2SO4,1. 4g KH2PO4, 3gNa2HP04,, JKM 12rC，20min。再加入维生素溶液 ImL,金属离子溶液lmL，甲醇9. 5mL。金属离子溶液柠檬酸铁30g、氯化钙30g、氯化锰5g、 硫酸锌5g、硫酸铜0. 5g，用H2O定容至1L，待溶液完全溶解后，过滤灭菌。维生素溶液2mg 生物素、400mg泛酸钙、AOOmgVB1JOOmg VB6、200mg对氨基苯甲酸、2mg叶酸、2g肌醇、400mg 烟酸、200mg核黄素，用H2O定容至1L，过滤灭菌)试管中，200r/min，30°C培养活化48h。1% 的体积比例接种到500mLMPQ培养基中，200r/min, 30°C培养48h。根据文献进行微生物基因组提取(《精编分子生物学实验指南》F.奥斯伯、R.布伦特、R.E.金斯顿著，颜子颍、王海林译。2. 4(39 40))，提取的DNA的效果如图1所示。实施例2MP688菌株基因组测序MP688经SOLEX测序，总读长369Mbp，基因组的覆盖率达到了 1 倍。MP688基因组DNA由一条环形染色体组成，全长2，862，39Ibp，G+C含量为55. 44%。使用Glimmer 3.0 进行细菌基因组的基因预测，预测有2730个编码框，编码区百分比为90. 41 %。基因组中发现有46个tRNA和2个rRNA操纵元(图2)。实施例3MP688菌株基因组注释中的PQQ合成基因
根据MP688全基因组测定序列，经Glimmer 3. 0软件基因预测，同COG、KEGG, SWISSPROT、TrEMBL数据库比对并进行基因注释，并进行人工校正。发现MP688基因组中PQQ 合成相关基因序列包括1个pqqAB⑶E，1个pqqFG基因簇(图3)。实施例4pqqAB⑶E基因簇导入大肠杆菌中指导PQQ合成以MP688基因组为模板，以SEQ ID No. 17和18为引物扩增pqqABCDE基因(图4)。 PCR条件94°C变性lmin，5(TC复性lmin，72°C延伸90s，反应进行30个循环。琼脂糖凝胶电泳后回收目的片段。将上述经)(ba I/Nde I双酶切的两个基因分别插入经)(ba I/Nde I双酶切的载体p0K12 (GenBank登录号AF223639)，转化大肠杆菌DH5 α感受态细胞，获得携带完整结构基因的重组表达质粒p0K12_pqqABCDE和p0K12-pqqre。挑p0K12_pqqABCDE单菌落于LB液体培养基，37 °C、220r/min培养1 后，转接于LB液体培养基；37°C、220r/min培养12h,收集ImL菌体，重悬于600L 20mmol/L pH = 8. OTris-HCl缓冲液中，冰浴超声处理，低温离心，上清液用于酶活性检测。利用DCIP法检测活性，取20L菌体超声裂解液、IOL SDH(60mg/L)、500L DCIP检测液、混合后观察颜色变化。将p0K12-pqqAB⑶E/Dffia菌体裂解后，检测样品的PQQ活性，出现了特异性的检测液褪色。阳性对照及表达样品加入检测液后，检测液立即由绿色变为黄色(图6)，说明 p0K12-pqqAB⑶E质粒转入大肠杆菌DH5 α后，能够指导PQQ的合成。实施例5pqqAB⑶E基因簇、pqqFG基因簇转入MP688菌株提高PQQ产量以MP688基因组为模板，SEQ ID No. 19和20为引物扩增pqqABCDE基因，以SEQ ID No. 21 和 22 为引物扩增 pqqFG (图 5)。PCR 条件94°C变性 lmin，50°C 复性 lmin，72°C 延伸90s，反应进行30个循环。琼脂糖凝胶电泳后回收目的片段。PBBR1MCS2是一种广宿主质粒，能够在食甲基菌MP688中自主复制。pqqAB⑶E 的PCR产物回收片度与载体PBBR1MCS2分别经Bio I/HindiII双酶切，回收酶切片段，通过T4DNA连接酶连接，连接产物转化大肠杆菌DH5 α感受态细胞，构建重组质粒 pBBRlMCS2-pqqABCDE。采用三亲本杂交方法，分别以含有载体pBBRlMCS2-pqqABCDE的大肠杆菌DH5a为供体菌，MP688为受体菌，含有质粒pRK2013的Ε. coli HBlOl为辅助菌，将对数生长期的供体菌、辅助菌、受体菌按1 1 2体积比混合，涂布于无抗性的MPQ平板， 30°C过夜培养。从MPQ平板上挑取重组菌株及对照菌株，分别接种于5mL相应抗性的液体 MPQ培养基中过夜培养，按1 100体积比分别转接相同OD值的菌落于IOOmL相应抗性的液体MPQ培养基，300C同步培养，每隔24h取样测定PQQ含量。按照同样流程，将pqqFG基因，插入载体PBBR1MCS2的Xhol/Hindlll位点，构建载体pBBRlMCS2-pqqFG。通过三亲本结合转移将构建载体分别导入受体菌MP688，观察它们对 MP688PQQ合成的影响。以MP688基因组DNA为模板，以SEQ ID似.23和对为引物扩增pqqFG基因。PCR 程序同前。将扩增得到的pqqFG基因经HindIII酶切后，插入载体pBBRl MCS2_pqqAB⑶E 的HindIII位点，构建载体pBBRlMCS2-pqqAB⑶E-pqqR；。通过三亲本结合转移将构建载体分别导入受体菌MP688，观察其对MP688PQQ合成的影响。结果如图7所示。结果表明，在食甲基菌MP688中分别导入带有自身调控序列的 pqqABCDE基因簇、pqqTO基因簇能够不同程度的提高菌株PQQ产量，两者共同导入较单独导入某一个基因簇更能提高菌株PQQ产量，显示两个基因簇在提高菌株PQQ产量方面有一定的协同效应。从图7中可以看出，导入两个基因簇增加的PQQ产量的增加量，大于单独导入 pqqABCDE的增加量和pqqFG的增加量之和。 以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
权利要求
1.食甲基菌吡咯喹啉醌合成的蛋白系统，包括1)由SEQ ID No. 3、SEQ ID No. 5、SEQ ID No. 7、SEQ ID No. 9 和 SEQ ID No. 11 所示的氨基酸组成的蛋白质；或2)在SEQ ID No. 3、SEQ ID No. 5、SEQ ID No. 7、SEQ ID No. 9 和 SEQ ID No. 11 所示的氨基酸序列中经取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有同等活性的由1)衍生的蛋白质。
2.食甲基菌吡咯喹啉醌合成的蛋白系统，包括1)由SEQID No. 14和SEQ ID No. 16所示的氨基酸组成的蛋白质；或2)在SEQID No. 14和SEQ ID No. 16所示的氨基酸序列中经取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有同等活性的由1)衍生的蛋白质。
3.编码权利要求1所述蛋白系统的基因簇。
4.根据权利要求3所述的基因簇，其核苷酸序列如SEQID No. 1所示，共有5个基因， 具体为pqqA、pqqB、pqqC、pqqD、pqqE。
5.编码权利要求2所述蛋白系统的基因簇。
6.根据权利要求5所述的基因簇，其核苷酸序列如SEQID No. 12所示，共有2个基因， 具体为pqqF、pqqG。
7.含有权利要求3和/或权利要求6所述的基因簇的细胞系。
8.含有权利要求3和/或权利要求6所述的基因簇的表达载体。
9.含有权利要求8所述的表达载体的宿主细胞。
10.权利要求3和/或权利要求6所述的基因簇在生产吡咯喹啉醌中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种食甲基菌吡咯喹啉醌合成基因簇及其编码蛋白系统，分别为pqqABCDE和pqqFG。本发明还公开了编码上述吡咯喹啉醌合成基因簇，其核苷酸序列如SEQ ID No.1和SEQ ID No.12所示。本发明提供的基因簇均能促进食甲基菌吡咯喹啉醌的合成量，共同导入上述两个基因簇具有在促进吡咯喹啉醌的合成上具有协同增效的作用。
文档编号C07K14/195GK102219836SQ20111004971
公开日2011年10月19日 申请日期2011年3月1日 优先权日2011年3月1日
发明者安佳佳, 张惟材, 智静娟, 李淼鑫, 杨延新, 杨璐, 汪建华, 熊向华, 韦娜 申请人:中国人民解放军军事医学科学院生物工程研究所