专利名称：吡咯喹啉醌的提取方法
技术领域：
本发明涉及吡咯喹啉醌的一种提取方法。
吡咯喹啉醌(Pyrroloquinoline Quinone，简称PQQ)是一种小分子化合物。PQQ能刺激一些微生物和植物生长，促进雌鼠生长繁殖，加速胞外基质成熟，强化机体免疫力，清除和调节体内自由基，提高神经细胞和神经生长因子(NGF)生成，防止酒精、乙醛对肝脏的损害等[Van kleef.M.A.G&Duine J A，Factors relevant inbacterial PQQ.Appl.Envirom Microbiol.1989.55.1209-1213]，因此PQQ可作为保健品、新药物开发的一种有用的原材料。
PQQ可以通过化学合成法或生物合成法[Ameyama.M，Hayashi.M et al.，Microbial production of PQQ Agric.Biol.Chem.1984，48561-565；Van.Kleef.M.A.G&Duine.JA.，L-Tyr is the precursor of PQQ biosynthesis in HyphomicrobiumX. FEBS 1988，23791-97；JP.昭63-267287 C12P 17/18]获得，由于前者有工艺复杂，异构体难以分离、成本高等弊端。因此，目前PQQ主要采用生物合成法进行。其提取方法为PQQ发酵液→亲水性离子交换剂吸附→低盐溶液洗涤→高盐溶液洗脱→调pH≈2→反相吸附柱(0.75cm3)→70％甲醇洗脱→直空干燥。但该方法仅适合于少量发酵液(数十立升)制备PQQ，且仍处在实验室小规模试制阶段，产品价格极其昂贵(德国39美元/mg，日本150人民币/mg)，因此极大地限制了PQQ的开发应用。
本发明的目的在于提供一种吡咯喹啉醌(PQQ)的提取方法，该方法应具有工艺操作简单、成本低廉，产品回收率和纯度均高等特点，可用于PQQ大规模生产的后处理过程。
为实现上述目的，本发明所采用的技术方案如下一种吡咯喹啉醌(PQQ)的提取方法，将PQQ发酵液用DEAE-葡聚凝胶(亲水性阴离子交换剂)吸附后，用含0.6mol/L KCl的20mmol/L Tris-HCl溶液洗涤，再用含0.6～1.2mol/L KCl的20mmol/L Tris-HCl溶液洗脱，真空浓缩干燥得到PQQ粗品；将此粗品溶解达到KCl饱和度，溶液调pH≈3.5，在＜10℃下结晶，离心得晶体PQQ；将此加水溶解，调pH≈3.5，用柱体积为20cm3的Seppak C18柱进行反相吸附，用pH≈2.5的Tris溶液洗涤，用含5％吡啶的乙醇流过一倍柱体积，再用70％甲醇溶液洗脱，真空浓缩干燥得到产品PQQ。用上述方法提取的PQQ经HPLC和毛细管电泳检测，结果表明其纯度分别为98.3％和95％。从实验室收集的培养液，制备的PQQ经毛细管电泳检测其纯度达100％。
本发明的提取方法中，经高浓度盐溶液洗脱后，从吸附剂上解离的PQQ溶液体积大，经真空浓缩得到含高盐的PQQ制品，再采用重结晶方法能除去粗PQQ制品中70％以上的盐份。同时，反相吸附柱改0.75cm3小柱为20cm3柱，前者适用于纯化含10余毫克PQQ发酵液，而后一柱则能纯化含数百毫克PQQ发酵液。PQQ能有效地被反相层析柱吸附，若仅用70％甲醇溶液洗脱，即使减慢洗脱速度，延长洗脱时间，也难于将PQQ完全洗脱出来。本发明中先采用用含5％吡啶的乙醇洗涤反相吸附柱一倍柱体积，再用70％甲醇溶液洗脱，不仅使回收率提高30％左右(由原来的1mg/L回收率提高到1.3mg/L左右)，并且该反向柱可反复使用，从而降低成本30-40％。因此，本方法具有工艺操作简单、成本低廉，产品回收率和纯度高等特点，而且可用于PQQ大规模生产的后处理过程。
以下结合具体的实施例对本发明的技术方案作进一步的说明实施例将收集的PQQ发酵液用DEAE-葡聚凝胶吸附后，用含0.6mol/L KCl的20mmol/L Tris-HCl溶液洗涤，接着用0.6～1.2mol/L KCl的20mmol/L Tris-HCl溶液洗脱，真空浓缩干燥得到PQQ粗品；将此粗品溶解达到KCl饱和度溶液(调pH≈3.5)，在＜10℃下结晶，离心得晶体PQQ；将此加水溶解调pH≈3.5，用SeppakC18柱反相吸附，pH≈2.5溶液洗涤，用含5％吡啶的乙醇流过一倍柱体积，再用70％甲醇洗脱，真空浓缩干燥得到产品PQQ。经毛细管电泳检测其纯度可达95％～100％。PQQ的回收率提高30％。
权利要求
1.一种吡咯喹啉醌的提取方法，将吡咯喹啉醌发酵液用亲水性阴离子交换剂吸附后，经洗涤、洗脱，再用反相吸附柱吸附、甲醇洗脱，真空浓缩干燥后得到吡咯喹啉醌，其特征在于经洗涤、洗脱后，进行真空浓缩干燥，得到吡咯喹啉醌粗品，溶解达到KCl饱和度，调pH值至3.5，在10℃以下结晶；反相吸附柱为20cm3柱；甲醇洗脱前用含5％吡啶的乙醇洗涤反相吸附柱一倍柱体积。
全文摘要
本发明公开了一种提取PQQ的方法,它是将PQQ发酵液用亲水性阴离子交换剂吸附后,经洗涤、洗脱,真空浓缩干燥得到PQQ粗品,再经重结晶,除去粗品中70%以上的盐份;接着上用Seppak C
文档编号C07D471/00GK1329004SQ00114639
公开日2002年1月2日 申请日期2000年6月20日 优先权日2000年6月20日
发明者赵永芳, 王银善, 吴波, 成汇, 徐宁, 闵向荣 申请人:武汉大学