一株产吡咯喹啉醌的生丝微菌及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一株产吡咯喹啉醌的生丝微菌及其应用，属于生物技术领域。
【背景技术】
[0002]吡略喹啉醌（pyrroloquinolinequinone，PQQ)是一种红褐色的见光易分解、热 稳定的水溶性邻位醌类化合物，是继NAD/NADP和FMN/FAD之后发现的第3种氧化还原酶 (oxidordeuctase)的辅酶，参与呼吸链电子传递。PQQ的研宄最早可追溯到1959年Hauge 发现醋酸妈不动杆菌（Acinetobactercalcoaceticus)的葡萄糖脱氢酶活性不依赖于P比啶 核苷酸和黄素核苷酸，而是依赖一种新的可分离的辅酶。1979年，Duine等采用电子自旋共 振、核磁共振和质谱发现这种辅酶为邻位醌类化合物。随后，SaliSbury(1979年）采用X射 线晶体衍射技术阐明了该辅酶的化学结构，并正式命名为吡咯喹啉醌。
[0003] PQQ广泛存在于革兰氏阴性菌中，在人和动、植物体内也均有微量存在，具有促进 机体生长、防护肝损伤、促进神经生长因子合成、调节机体自由基水平、提高细菌对毒性和 辐射等极端条件的耐受性等功能，是一种独特的生理活性物质，在食品和医药保健领域具 有重要的开发前景。PQQ的早期生产方法以化学合成法为主，但其合成步骤繁杂，产率低， 副产物多，纯化成本高。微生物发酵法以无机培养基为主，成本低，产率较高且利于纯化，是 PQQ的主要产业化方向。
[0004] 迄今为止，能够产生PQQ的生物仅限于某些革兰氏阴性细菌，哺乳动物自身不能 合成只能从外界摄入。不同细菌的PQQ合成量差距十分明显，有的细菌只生成微量的PQQ， 以满足自身正常的生理代谢需求，如假单胞菌属（Pseudomonas)、微环菌属（Microcyclus) 和枝动杆菌属（Mycoplana)等；有的细菌能产生过量PQQ，如交替单胞菌属（Alteromonas)、 嗜甲基菌属（Methylophilus)和生丝微菌属（Hyphomicrobium)等，其中甲基营养型细菌 的PQQ生物合成水平最高，且能分泌至细胞外。目前已报道的野生菌株，其PQQ产量较低， 均在10mg/L以下。食甲基菌Methylovorussp.MP688经过培养体系优化，在7. 5L发酵罐 上的PQQ产量可达2g/L，是目前已报道的产量最高的野生菌株。生丝微菌Hyphomicrobium denitrificansFJNU-6培养88h发酵液中PQQ产量达到121mg/L，而蛋白含量只有32mg/ L(杨诗颖，陈佳，柯崇榕，黄建忠.吡咯喹啉醌产生菌的筛选及其培养基优化.药物生物技 术，2014, 21 (5) : 429~432)。而PQQ的具体合成途径尚未彻底阐明，代谢调控机制不清，通 过基因工程改造存在较大难度。MethylobacteriumextorquensAM1经过基因改造后的产 量也只有114mg/L，是已报道的产量最高的基因工程菌株。此外，PQQ作为辅酶易与培养液 中的氨基酸发生不可逆的反应形成稳定的无活性恶唑类化合物，会造成产量急剧下降。因 此，筛选胞外蛋白含量低且产量较高的菌株是微生物发酵生产PQQ进行工业化的关键。
【发明内容】
[0005] 本发明所要解决的技术问题是如何提高微生物发酵生产吡咯喹啉醌的产量和/ 或降低发酵液中的蛋白含量。
[0006] 为了解决以上技术问题，本发明提供一株脱氮生丝微菌（Hyphomicrobium denitrificans)，其保藏编号为CGMCCNo. 10620。
[0007] 为了解决以上技术问题，本发明还提供一种菌剂，该菌剂的活性成分为所述的脱 氮生丝微菌；
[0008] 所述菌剂为用于产生吡咯喹啉醌的菌剂。
[0009] 为了解决以上技术问题，本发明还提供所述的脱氮生丝微菌或所述的菌剂在生产 吡咯喹啉醌中的应用。
[0010] 为了解决以上技术问题，本发明还提供一种生产吡咯喹啉醌的方法，包括将所述 的脱氮生丝微菌进行发酵培养，得到吡咯喹啉醌。
[0011] 上述方法中，所述发酵培养中使用的发酵培养基由溶质和溶剂组成，溶质为甲醇、 无机氮源、磷酸二氢钾、磷酸氢二钠、硫酸镁、微量元素液、维生素辅液，溶剂为水；所述甲 醇在所述发酵培养基中的浓度为10-15g/L、所述无机氮源在所述发酵培养基中的浓度为 2_6g/L、所述磷酸二氢钾在所述发酵培养基中的浓度为1. 2-3. 5g/L、所述磷酸氢二钠在所 述发酵培养基中的浓度为4-8g/L、所述硫酸镁在所述发酵培养基中的浓度为l-3g/L、所述 微量元素液在所述发酵培养基中的浓度为l_5mL/L、所述维生素辅液在所述发酵培养基中 的浓度为l_3mL/L，pH6. 8-7. 0 ;
[0012] 所述微量元素液由溶质和溶剂组成，溶质为硫酸亚铁、硫酸锌、硫酸锰、硫酸铜、氯 化钠、钼酸钠、氯化钾、氯化钴、硼酸和氯化钙，溶剂为水；所述硫酸亚铁在所述微量元素液 中的浓度为80g/L，所述硫酸锌在所述微量元素液中的浓度为22. 5g/L，所述硫酸锰在所述 微量元素液中的浓度为40g/L，所述硫酸铜在所述微量元素液中的浓度为5g/L，所述氯化 钠在所述微量元素液中的浓度为15g/L，所述钼酸钠在所述微量元素液中的浓度为0. 3g/ L，所述氯化钾在所述微量元素液中的浓度为0. 3g/L，所述氯化钴在所述微量元素液中的浓 度为0. 03g/L，所述硼酸在所述微量元素液中的浓度为3g/L，所述氯化钙在所述微量元素 液中的浓度为300g/L;
[0013] 所述维生素辅液由溶质和溶剂组成，溶质为核黄素、盐酸吡哆素、盐酸硫胺素、叶 酸、烟酸、对氨基苯甲酸、泛酸钙、生物素和肌醇，溶剂为水；所述核黄素在所述维生素辅液 中的浓度为200g/L，所述盐酸吡哆素在所述维生素辅液中的浓度为400g/L，所述盐酸硫胺 素在所述维生素辅液中的浓度为400g/L，所述叶酸在所述维生素辅液中的浓度为2g/L，所 述烟酸在所述维生素辅液中的浓度为400g/L，所述对氨基苯甲酸在所述维生素辅液中的浓 度为200g/L，所述泛酸钙在所述维生素辅液中的浓度为400g/L，所述生物素在所述维生素 辅液中的浓度为2g/L，所述肌醇在所述维生素辅液中的浓度为2000g/L;
[0014] 所述无机氮源具体为硫酸铵；
[0015] 所述发酵培养基具体由溶质和溶剂组成，溶质为甲醇、硫酸铵、磷酸二氢钾、磷酸 氢二钠、硫酸镁、微量元素液、维生素辅液，溶剂为水；所述甲醇在所述发酵培养基中的浓 度为10g/L、所述硫酸铵在所述发酵培养基中的浓度为2g/L、所述磷酸二氢钾在所述发酵 培养基中的浓度为3. 5g/L、所述磷酸氢二钠在所述发酵培养基中的浓度为5g/L、所述硫酸 镁在所述发酵培养基中的浓度为1. 5g/L、所述微量元素液在所述发酵培养基中的浓度为 1. 2mL/L、所述维生素辅液在所述发酵培养基中的浓度为2mL/L，pH6. 8。
[0016] 上述任一所述的方法中，所述发酵培养的条件如下：温度25-32°C、溶氧多20%、 pH为6. 7-7. 2、当发酵液中的甲醇浓度降到lg/L时添加甲醇，使甲醇浓度为3-5g/L;
[0017] 所述发酵液包含所述脱氮生丝微菌和所述发酵培养基；
[0018] 所述发酵培养基占所述发酵时所用发酵罐装液量的2/3-3/4,具体为7/10 ;
[0019] 所述温度具体为30°C;
[0020] 所述发酵培养的转速为150-600rpm，具体为250rpm;
[0021] 所述发酵培养的通气量为0? 3-0. 6vvm;
[0022] 所述pH具体是通过氨水进行调节的。
[0023] 上述任一所述的方法中，所述发酵培养的时间为4-6天。
[0024] 上述任一所述的方法中，所述脱氮生丝微菌是通过种子液接入所述发酵培养基进 行所述发酵培养的。
[0025] 上述任一所述的方法中，所述种子液是将所述的脱氮生丝微菌在种子培养基中培 养得到的：
[0026] 所述种子培养基由溶质和溶剂组成，溶质为甲醇、无机氮源、磷酸二氢钾、磷酸 氢二钠、硫酸镁，溶剂为水；所述甲醇在所述种子培养基中的浓度为5-10g/L，所述无机氮 源在所述种子培养基中的浓度为2_4g/L，所述磷酸二氢钾在所述种子培养基中的浓度为 0. 8-2. 4g/L，所述磷酸氢二钠在所述种子培养基中的浓度为3-6g/L，所述硫酸镁在所述种 子培养基中的浓度为l_3g/L，pH6. 8-7. 0;
[0027] 所述种子液是按照体积比1% -5%接种到所述发酵培养基中的，具体是按照体积 比5%接种到所述发酵培养基中的；
[0028] 所述无机氮源具体为硫酸铵；
[0029] 所述种子培养基具体由溶质和溶剂组成，溶质为甲醇、硫酸铵、磷酸二氢钾、磷酸 氢二钠、硫酸镁，溶剂为水；所述甲醇在所述种子培养基中的浓度为6g/L，所述硫酸铵在所 述种子培养基中的浓度为2. 5g/L，所述磷酸二氢钾在所述种子培养基中的浓度为1. 4g/L， 所述磷酸氢二钠在所述种子培养基中的浓度为3g/L，所述硫酸镁在所述种子培养基中的浓 度为lg/L，pH6.8-7.2。
[0030] 上述任一所述的方法中，所述种子液为将所述的脱氮生丝微菌在所述种子培养基 中进行一级培养，得到一级种子液；再将所述一级种子液在所述种子培养基中进行二级培 养，得到的二级种子液；
[0031] 所述一级培养的条件为25-32°C培养24-36小时，具体为32°C培养24-36小时；
[0032] 所述一级培养的转速为150-220rpm，具体为220rpm;
[0033] 所述一级种子液的0065(|在2. 5-3. 0之间，以所述种子培养基调零；
[0034] 所述二级培养的条件为25-32°C培养24-36小时、空气流量4-7L/min，具体为30°C 培养24-36小时，空气流量5L/min;
[0035] 所述二级培养的转速为400-600rpm，具体为500rpm;
[0036] 所述二级种子液的(?65(|在4. 0-5. 0之间，以所述种子培养基调零；
[0037] 所述一级种子液是按照体积比1% -3%接种到所述种子培养基中进行所述二级 培养的，具体是按照体积比1%接种到所述种子培养基中进行所述二级培养的；
[0038] 所述二级培养中，所述种子培养基占所述二级培养时所用发酵罐装液量的 1/3-3/4,具体为 1/2。
[0039] 上述任一所述的无机氮源为硫酸铵、氯化铵和氨水中至少一种。
[0040] 本发明提供的一株产吡咯喹啉醌的生丝微菌FJNU-R8,其培养液中吡咯喹啉醌产 量较高，该菌株在以甲醇为碳源、硫酸铵为氮源的培养基中培养4-6天，吡咯喹啉醌的产量 为150-350mg/L，且分泌的胞外蛋白含量较低，有利于吡咯喹啉醌的纯化，发酵性能稳定。本 发明提供的生丝微菌可以应用于微生物发酵生产吡咯喹啉醌中。
[0041] 保藏说明
[0042] 菌种名称：脱氮生丝微菌
[0043]拉丁名：Hyphomicrobiumdenitrificans
[0044]菌株编号：FJNU-R8
[0045] 保藏机构：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心
[0046] 保藏机构简称：CGMCC
[0047] 地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号
[0048] 保藏日期：2015年3月13日
[0049] 保藏中心登记入册编号：CGMCCNo. 106