水稻胰蛋白酶抑制剂OsBBTI4基因的新应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物基因工程领域，具体涉及水稻胰蛋白酶抑制剂〇SBBTI4@ryZa ptivagowman-girk^rypsininhibitor4)及其编码基因和在调控水稻锦积累方面的应 用。
【背景技术】
[0002] 重金属镉是一种生物体非必需的毒性元素。随着现代社会的发展，环境污染越来 越严重，由地壳释放到水、大气和土壤中的具有毒性的活性镉离子也越来越多。这些镉离子 进入生物圈，并通过食物链进入人体，严重危害人体健康。
[0003] 水稻是一种重金属镉富集的农作物。2014年4月，国土资源部和环境保护部公布数 据表明，我国土地的重金属污染十分严重，按照点位超标率计算，我国土壤中镉超标的土地 已达我国国土总面积的7%。按照污染发生的地区来看，重金属污染则主要分布于我国的华 中华南地区、泛珠三角地区、长三角地区及东北地区，这些地区均为我国水稻的主要产区， 严重影响我国的水稻粮食安全。近年来，由媒体报道的稻米镉超标事件层出不穷，引起了民 众巨大的恐慌。
[0004] 蛋白酶抑制剂在植物中普遍存在，通过调控蛋白酶活性应答多种细胞生理反应， 包括植物生长发育、抗病性及逆境胁迫应答。BBI(B〇Wman-BirkInhibitor)是植物中的蛋 白酶抑制剂的一种，其抑制的蛋白酶包括胰蛋白酶，糜蛋白酶和弹性蛋白酶等丝氨酸蛋白 酶。BBI蛋白富含半胱氨酸，含有1-3个BBI的结构域，该结构域的分子量约为7-8kD，有两个 独立的活性位点，可以同时抑制两个不同的蛋白酶分子，通过充当蛋白酶的假底物而抑制 蛋白酶活性。根据含有BBI结构域的数目，BBI蛋白的分子量分别为8kD，16kD和24kD左右。目 前已在豆科和禾本科植物中均克隆到了编码BBI蛋白的基因，其中豆科植物中的BBI蛋白因 具有明显的抑癌特征而得以广泛的研究。
[0005] 植物中的BBI蛋白是由多基因的基因家族编码的，根据其BBI结构域中两个活性位 点抑制底物的特异性，大豆中的BBI蛋白可分为三类:BBI-A、BBI-C和BBI-D3BI-A的两个活 性位点分别抑制胰蛋白酶和糜蛋白酶活性，BBI-C的两个活性位点分别抑制胰蛋白酶和弹 性蛋白酶活性，而BBI-D则分别抑制胰蛋白酶和糜蛋白酶活性。研究表明，大豆中BBI蛋白的 生物学功能包括:调节种子萌发过程中内源蛋白酶活性;在种子休眠期储藏还原性的硫氨 基酸(如半胱氨酸）;保护植物免受昆虫和其他病原微生物的侵害等。
[0006] BBI基因也参与应答多种逆境胁迫，其表达可以受到生物逆境、非生物逆境及激素 的诱导。水稻OsBBPI基因是单子叶植物中克隆的第一个BBI基因（U76004)，研究表明，该基 因表达受光调节，且在叶片中的表达受到切割伤害、茉莉酸和乙烯的诱导。水稻BBI基因的 表达受到褐飞虱的诱导，表明该基因可能参与应答水稻对褐飞虱的伤害胁迫反应。绞股蓝 CjBBI基因在酵母中表达可以提高酵母对重金属Cd和药物的耐受性，并且其表达受Cd胁迫 的诱导。小麦BBI基因wali3，wali5和wali6的表达受伤害、铝毒的诱导，而另一个小麦BBI基 因--WRSI5的表达受盐胁迫、铝毒和PEG胁迫的诱导，且在拟南芥转基因超表达WRSI5基因 会提尚转基因拟南芥的耐盐性。
[0007] 在我们的前期研究中，我们一直致力于分离水稻中应答重金属镉胁迫及参与调控 镉积累的水稻基因。我们通过构建水稻幼苗cDNA的酵母表达文库，通将该文库质粒转化于 酵母对镉敏感的突变株Aycf!，获得了能够提高酵母镉耐受性的水稻cDNA克隆0sBBTI4 (Bowman-Birktrypsininhibitor4)。然而，即使知道0sBBTI4基因锦耐受性，因其是两种 机制，并不能推知0sBBTI4基因对水稻镉积累的作用。在本发明中，我们描述了该基因的表 达能够影响重金属镉在生物体内的积累，提供了将该基因应用于重要粮食作物一一水稻的 低镉遗传育种技术，本发明也可应用于工程菌一一酿酒酵母的低镉遗传改造。
【发明内容】
[0008] 本发明的第一个目的是提供一种水稻蛋白酶抑制剂0SBBTI4及其编码基因 0sBBTI4的新应用。
[0009] 实现上述目的的技术方案如下。
[0010] 氨基酸序列如SEQID如.2的水稻蛋白酶抑制剂〇8881'14和/或〇888114基因在水 稻中降低重金属镉积累的应用，所述0sBBTI4基因的cDNA为如SEQIDNO. 1所示的核苷酸序 列，或为与SEQIDNO. 1互补配对的核苷酸序列，或为编码序列氨基酸序列如SEQIDN0.2 的核苷酸序列。
[0011]本发明的水稻胰蛋白酶抑制剂0sBBTI4，其氨基酸序列如SEQIDN0.2所示，其编 码基因0sBBTI4的核苷酸序列如SEQIDN0.1所示。应当理解，考虑到密码子的简并性，在不 改变氨基酸序列的前提下，对上述编码基因的核苷酸序列进行修改，也属于本发明的保护 范围内。
[0012] 本发明的另一目的是提供一种0sBBTI4的水稻超表达载体，该表达载体克隆有上 述水稻0sBBTI4基因，能够使0sBBTI4在水稻体内超量表达，并使水稻降低转基因种子中的 重金属锦的含量。
[0013]实现上述目的的技术方案如下。
[0014] 水稻超表达载体核苷酸序列如SEQIDN0.1所示的0SBBTI4基因的水稻超表达载 体。
[0015] 优选地，所述超表达载体为P⑶1301，基因插入位点为BamHI。
[0016] 本发明的另一目的是提供上述水稻超表达载体的制备方法。
[0017]实现该目的的技术方案如下。
[0018] -种上述水稻超表达载体的制备方法，包括以下步骤：
[0019] ⑴以水稻基因组DNA为模板，以SEQIDN0.3和SEQIDN0.4为引物，进行扩增，回 收扩增产物；
[0020] (2)对水稻转基因超表达载体p⑶1301进行BamHI酶切处理，回收线性化p⑶1301载 体；
[0021] (3)将扩增产物与线性化的p⑶1301载体连接，鉴定阳性克隆并提取质粒0SBBTI4-PCU1301，即得。
[0022] 本发明的另一目的是提供上述水稻超表达载体的应用。
[0023] 上述水稻超表达载体在水稻中降低重金属镉积累的应用。
[0024]本发明的另一目的是提供一种RNAi表达载体，该表达载体克隆有上述针对水稻胰 蛋白酶抑制剂基因0sBBTI4的RNA干涉片段。
[0025]实现该目的的技术方案如下。
[0026] 插入有核苷酸序列如SEQIDN0.1所示的0sBBTI4基因的RNAi表达载体。
[0027] 优选地，所述表达载体为pTCK303。
[0028]本发明的另一目的是提供上述RNAi表达载体的制备方法。
[0029]实现该目的的技术方案如下。
[0030] RNAi表达载体的制备方法，包括有以下步骤：
[0031] (1)以水稻基因组DNA为模板，以SEQIDN0.5和SEQIDN0.6为引物，进行扩增，回 收扩增产物；
[0032] (2)将扩增产物连接于pGEMT-Vector上形成pGEMT-BBTI4RI;
[0033] (3)用SacI和Spel双酶切pGEMT-BBTI4RI，回收得到片段F1，同时用SacI和Spel双 酶切载体PTCK303,将回收后的F1片段与经SacI和Spel双酶切处理后的pTCK303载体连接， 形成PTCK303-BBTI4RI-F1;
[0034] (4)用BamHI和ΚρηΙ双酶切pGEMT-BBTI4RI并回收得到片段F2,然后将片段F2与 BamHI和ΚρηΙ双酶切处理后pTCK303-BBTI4RI-Fl载体连接，即得。
[0035]本发明的另一目的是提供上述RNAi表达载体的应用。
[0036]上述RNAi表达载体在水稻中降低重金属镉积累的应用。
[0037]本发明的另一目的是提供一种降低稻米中重金属镉积累的生物制剂。
[0038]实现上述目的的技术方案如下。
[0039] -种降低水稻中重金属镉积累的生物制剂，其活性成份为上述的水稻超表达载体 和/或RNAi表达载体，或含有0sBBTI4基