因。
[0040] 上述的0SBBTI4基因、水稻超表达载体和/或RNAi表达载体，可以制备成生物制剂， 用于降低水稻中重金属镉积累，用于水稻的低镉遗传育种。
[0041]在前期的研究中，我们通过构建水稻幼苗cDNA的酵母表达文库，通将该文库质粒 转化于酵母对镉敏感的突变株Aycf!，获得了能够提高酵母对镉耐受性的水稻cDNA克隆 0sBBTI4(Bowman_Birktrypsininhibitor4)。由于酵母是单细胞生物，酵母对锦的耐受 可以分为两种情况：（1)通过解除重金属镉胁迫产生的富裕活性氧，间接地降低镉对酵母细 胞氧化胁迫的伤害，从而提高酵母的活力;或通过螯合酵母细胞质中游离的毒性镉离子，直 接地降低活性镉离子对酵母细胞的毒害。如一些抗氧化蛋白谷胱甘肽转移酶GST和金属离 子结合蛋白如金属硫蛋白MT等，即通过上述方式提高酵母细胞对镉的耐受性。（2)通过直接 介导镉离子的外排，降低细胞内镉离子的积累，从而降低镉对酵母细胞的伤害。如金属离子 转运蛋白（金属耐受蛋白MTP等）。由此可见，酵母对镉的耐受与调控镉在酵母或其他细胞中 的积累并不完全相关。而本发明的发明人却发现，公开的0sBBTI4蛋白则通过介导重金属镉 离子的外排从而调控镉的积累，并构建了水稻超表达载体和RNAi表达载体，从而真正实现 将0sBBTI4基因应用于降低水稻中的镉积累。
[0042]本发明的有益效果如下：（l)0sBBTI4基因在酿酒酵母中的超量表达能够降低酵母 细胞对重金属镉的积累，促进酵母体内镉的外排；（2)0sBBTI4基因在水稻植株中的超量表 达或下调表达能够影响水稻种子对重金属镉的积累发生变化。本发明沟通构建插入有核苷 酸序列如SEQIDNO. 1所示的0sBBTI4基因的水稻超表达载体和RNAi表达载体，应用到水稻 中，发现转基因水稻种子中的重金属镉含量明显低于野生型对照的种子，表明对0sBBTI4基 因的表达调控能够降低水稻种子对重金属镉的富集量，从而证实本发明的0sBBTI4基因是 影响水稻镉积累的关键基因，可以调控水稻植株对镉的吸收和转运，该基因的表达能够调 控水稻对重金属镉的积累方式，从而实现了将0sBBTI4基因应用于降低水稻中的镉积累。
【附图说明】
[0043] 图1示构建完成的酿酒酵母重组表达载体0sBBTI4-pYES2示意图。
[0044]图2示转化0sBBTI4-pYES2的转基因酵母在含镉培养基中生长后镉积累降低。
[0045]图3示构建完成的水稻转基因超表达重组载体0sBBTI4-p⑶1301示意图。
[0046] 图4示构建完成的水稻转基因RNA干涉载体0sBBTI4-pTCK303示意图。
[0047]图5示水稻0sBBTI4转基因超表达和RNAi植株的qRT-PCR检测。
[0048] 图6示野生型水稻种子和0sBBTI4转基因超表达及RNAi水稻种子中镉含量的比较。
【具体实施方式】
[0049]本发明以前期构建的水稻幼苗的cDNA表达文库在酵母中的筛选结果为基础(该成 果已发表，不在本专利保护范围之内），获得了能够提高酵母对镉的耐受性的水稻cDNA，通 过测序分析，该基因编码一个水稻胰蛋白酶抑制剂基因，该基因在水稻基因组数据库(MSU RiceGenomeAnnotationProjectDatabaseandResource,http:// rice·plantbiology.msu·edu/index·shtml)中的编号为L0C_0s01g03340，命名为0sBBTI4 (Qryza兰ativa互owman-互irk^rypsin丄nhibitor4)。该基因不含内含子，编码一个包含 756个核苷酸的开放阅读框，其序列如SEQIDNO. 1所示。其编码蛋白具有251个氨基酸残 基，其序列如SEQIDN0.2所示。
[0050] 本发明以水稻幼苗叶片为材料，提取其基因组DNA，由于该基因没有内含子，可用 基因组DNA为模板扩增该基因的阅读框全长。
[00511用于构建水稻转基因超表达载体为PCU1301，该载体来源于pCAMBIA1301。基因插 入位点为BamHI，在玉米泛素启动子调控下超量表达。用于构建0sBBTI4转基因超表达载体 的引物为0sBBTI40EF: 5 ' -CGGGATCCATGAGCAACACCACCATGGC-3 ' 和0sBBTI40ER: 5 ' -CGGGATCCCTAGTTCTCCGCTCGGGGTT-3 '，该对引物携带有BamHI酶切位点，并与水稻转基因超 表达载体为PCU1301的BamM酶切位点上下游各有15个碱基的重叠，以水稻基因组DNA为模 板PCR扩增片段后，回收该片段。将水稻转基因超表达载体pCU1301进行BamHI酶切处理，回 收线性化质粒。采用In-fusion技术将回收的DNA片段和线性化的p⑶1301载体连接，鉴定阳 性克隆并提取质粒0sBBTI4-pCU1301，测序。
[0052]用于构建水稻转基因RNA干涉载体为pTCK303，该载体同样改造于pCAMBIA1301。以 水稻基因组DNA为模板进行PCR扩增。设计引物为0sBBTI4RIF: 5 ' -GGGGTACCACTAGTATGAGCAACACCACCATGGC-S' 和OsBBTHRm-CGGGATCCGAGCTCCTAGTTCTCCGCTCGGGGTT-3'，扩增获得0sBBTI4的基因阅读框片段。将该片 段连接于pGEMT-Vector上，经限制性酶切处理，分别正反向连接于表达载体pTCK303的酶 切位点SacI与Spel之间，和酶切位点ΚρηΙ与BamHI之间，由此而构建干涉载体0sBBTI4- PTCK303。采用农杆菌EHA105介导的遗传转化方法，将干涉载体导入正常粳稻品种中花11。 经RT-PCR鉴定0sBBTI4基因的转录受到超量表达或抑制之后植株为阳性植株，将其播种于 大田，获得纯合株系。将野生型水稻和转基因基因0sBBTI4超量表达和RNAi的水稻经一定浓 度的重金属胁迫处理，完成一个生长周期之后，采用原子吸收光谱的方法测量水稻种子和 其他组织中的重金属镉含量。结果发现，转基因水稻种子中的重金属镉含量明显低于野生 型对照的种子，表明对0sBBTI4基因的表达调控能够降低水稻种子对重金属镉的富集量，从 而证实本发明的0sBBTI4基因是影响水稻镉积累的关键基因，可以调控水稻植株对镉的吸 收和转运，该基因的表达能够调控水稻对重金属镉的积累方式。
[0053] SEQ ID N0.1
[0054] cDNA和基因组DNA序列
[0055] >〇sBBTI4
[0057] SEQ ID NO.2
[0058] 氨基酸序列
[0059] >0sBBTI4protein
[0061]为了便于理解本发明，下面将对本发明进行更全面的描述。本发明可以以许多不 同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本 发明的公开内容的理解更加透彻全面。
[0062]下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等 人，分子克隆：实验室手册(NewYork:ColdSpringHarborLaboratoryPress,1989)中所 述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所用到的各种常用化学试剂，均为市售 产品。
[0063]除非另有定义，本发明所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域 的技术人员通常理解的含义相同。本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实 施例的目的，不用于限制本发明。本发明所使用的术语"和/或"包括一个或多个相关的所列 项目的任意的和所有的组合。
[0064]实施例1:0sBBTI4基因在酿酒酵母中的表达降低酵母体内镉的积累 [0065] 按照常规方法，构建酿酒酵母重组表达载体0sBBTI4-pYES2，如图1所示。
[0066] 培养酿酒酵母菌株Δycfl(购自欧洲酵母研究中心Euroscarf， http://web.uni-frankfurt.de/fbl5/mikro/euroscarf/，菌株编号Y04069)，用pYES2质粒和重组的 0sBBTI4-pYES2对上述酵母进行转化。由于OsBBTI基因是置于酵母半乳糖诱导的启动子 PGAL1调控之下（见图1所示），将0s