株系。
[0091] 在本发明中，qRT-PCR主要为了检测转基因水稻株系中0sBBTI4的表达变化。主要 实施步骤如下：1)待到水稻开花期分别收集成熟叶片，RNA的提取依照Magen公司HiPure PlantRNAKits(R4151)的说明书进行；
[0092] 2)cDNA链的合成依照全式金公司TransScriptOne-StepgDNARemovaland cDNASynthesisSuperMix的说明书进行；
[0093] 3)通过网站QuantPrime(http://www.quantprime·de/)在线设计qRT-PCR引物。水 稻内参基因 0sUBQ5 引物为 0sUBQ5F:5'-CGCCGTGCTCCAGTTCTA-3'和 0sUBQ5R: 5'-CGATTTCCTCCTCCTTCCTT-3(SEQIDN0·7和SEQIDN0·8)。0sBBTI4的引物为BBTI4qRTF:5'-TTGTCCCTGTTCGCTTGTGTGG-3'和BBTI4qRTR:5'-ACATGGGTGCATGCTTGCGTTG-3'（SEQIDN0.9 和SEQIDΝ0· 10)。4)参考BI0-RAD公司iTaq?UniversalSYBRGreenSupermix的说明书配 制qRT-PCR反应体系，采用两步法进行PCR检测。所有检测均采用两个生物学样本重复，每个 生物学样本进行三次重复检测反应。引物第一次使用时添加程序Stage3检测溶解曲线，确 认引物的特异性。qRT-PCR检测转基因水稻株系中0sBBTI4的表达情况如图5所示。在3个 0sBBTI4 转基因超表达株系（0sBBTI40X18,0sBBTI40X21，0sBBTI40X22)中，与对照（野生型 WT水稻)相比，0sBBTI4的表达量分别达到6倍，2倍和7倍，表明0sBBTI4转基因超表达效果很 好。同样，在 3个0sBBTI4转基因RNAi株系（0sBBTI4RIl，0sBBTI4RI2,0sBBTI4RI5)中，与对照 (野生型WT水稻)相比，0sBBTI4的表达量被大大降低了，表明0sBBTI4转基因RNAi效果很好。
[0094]实施例3:采用原子吸收光谱法测定转基因水稻种子中的重金属镉含量
[0095]将上述纯合株系的种子播种到直径9cm培养皿中37°C萌发，7d后将幼苗分别移至 营养液（对照）和附加〇 . 〇 1mΜ的Cd的营养液中栽培生长。营养液组成为：母液1: 91.4g NH4N03,32.4gMgS〇4 · 7H20,加水定容至 1L;母液2:88.6gCaCl2,加水定容至 1L;母液3: 40.3gNaH2P〇4,71.4gK2S〇4,加水定容至 1L;母液4:0.943gH3B〇4，1.5gMnCl2.4H20， 0.074g(NH4)6M〇7〇24 · 4H20,0.031gCuS〇4 · 5H20,0.035gZnS〇4 · 7H20,加水定容至 1L;母液 5:6.9gFeS〇4 · 7H20,9.3gNa2EDTA· 2H20,加水定容至0.5L。使用时，每4L营养液加 1-5号 母液各5mL，余量为水。为使水稻生长健壮，可另加偏硅酸钠50-100ppm，调节pH至5-5.1。待 水稻生长至完熟期后，将水稻从营养液中移出，用流水洗净根部营养液后再用蒸馏水冲洗 两次。水稻根、茎叶和种子分别收获，115°C高温杀青15min，65°C烘箱中烘至恒重。万能粉碎 机将种子磨碎，储存。称取约0.3g水稻种子材料于玻璃瓶中，HN〇3:H2〇2 = 4:1 (体积比）的溶 液浸泡过夜，密封玻璃瓶，80°C水浴加热至消解液澄清，打开玻璃瓶盖，100°C挥酸，再用原 子吸收分光光度计（型号:GBC932AA)测定不同样本中重金属Cd离子的含量。以野生型水稻 作为对照。
[0096]结果如图6显示，从图6中可以看出0sBBTI4基因的3个转基因超表达 (0sBBTI40X18,0sBBTI40X21，0sBBTI40X22)和 3个转基因RNAi(0sBBTI4RIl，0sBBTI4RI2, 0sBBTI4RI5)株系中种子的Cd含量均低于水稻野生型植株（WT)，由此表明，本发明的 0sBBTI4基因是调控稻米镉含量的关键基因，伴随基因0sBBTI4表达量的变化，水稻种子对 重金属镉的富集量也有改变。该基因可应用于水稻的低镉遗传育种，也可应用于其他植物 中针对体内重金属镉含量的基因工程育种。
[0097]以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并 不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员 来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保 护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
【主权项】
1. 氨基酸序列如SEQID如.2的水稻蛋白酶抑制剂〇8881'14和/或〇888114基因在水稻 中降低重金属镉积累的应用，所述0sBBTI4基因的cDNA为如SEQIDN0.1所示的核苷酸序 列，或为与SEQIDNO. 1互补配对的核苷酸序列，或为编码序列氨基酸序列如SEQIDNO. 2 的核苷酸序列。2. 插入有核苷酸序列如SEQIDN0.1所示的0sBBTI4基因的水稻超表达载体。3. 根据权利要求2所述的水稻超表达载体，其特征是，所述超表达载体为pCU1301，基因 插入位点为BamHI。4. 权利要求2所述的水稻超表达载体的制备方法，其特征是，包括以下步骤： (1) 以水稻基因组DNA为模板，以SEQIDNO.3和SEQIDNO.4为引物，进行扩增，回收扩 增产物； (2) 对水稻转基因超表达载体p⑶1301进行BamHI酶切处理，回收线性化p⑶1301载体； (3) 将扩增产物与线性化的？〇]1301载体连接，鉴定阳性克隆并提取质粒〇5^81'14_ PCU1301，即得。5. 权利要求2所述水稻超表达载体在水稻中降低重金属镉积累的应用。6. 插入有核苷酸序列如SEQIDN0.1所示的0sBBTI4基因的RNAi表达载体。7. 根据权利要求6所述的RNAi表达载体，其特征是，所述表达载体为pTCK303。8. 权利要求6所述的RNAi表达载体的制备方法，其特征是，包括有以下步骤： (1) 以水稻基因组DNA为模板，以SEQIDNO.5和SEQIDNO.6为引物，进行扩增，回收扩 增产物； (2)将扩增产物连接于pGEM T-Vector上形成pGEM T-BBTI4RI; (3)用SacI和Spel双酶切pGEM T-BBTI4RI，回收得到片段FI，同时用SacI和Spel双酶切 载体PTCK303,将回收后的F1片段与经SacI和Spel双酶切处理后的pTCK303载体连接，形成 PTCK303-BBTI4RI-F1； (4)用BamHI和ΚρηΙ双酶切pGEM T-BBTI4RI并回收得到片段F2,然后将片段F2与BamHI 和ΚρηΙ双酶切处理后pTCK303-BBTI4RI-Fl载体连接，即得。9.权利要求6所述的RNAi表达载体在水稻中降低重金属镉积累的应用。10. -种降低水稻中重金属镉积累的生物制剂，其特征在于，其活性成份包括有权利要 求2所述的水稻超表达载体和/或权利要求6所述的RNAi表达载体。
【专利摘要】本发明涉及工程菌酿酒酵母和植物基因工程领域。本发明提供了水稻胰蛋白酶抑制剂OsBBTI4基因在水稻中降低重金属镉积累的应用，其cDNA全长序列如SEQ？ID？NO.1所示，其编码的氨基酸序列如SEQ？ID？NO.2所示。本发明OsBBTI4基因编码的蛋白质OsBBTI4与水稻对重金属镉的积累相关。通过将OsBBTI4基因在水稻中转基因超表达或RNAi，调控转基因水稻株系中OsBBTI4基因的表达量，可以影响转基因水稻种子中镉含量，得到低镉富集的转基因水稻品系。OsBBTI4基因可应用于工程菌及水稻针对体内镉含量改变的遗传工程育种，也可应用于其他植物的针对体内镉富集的遗传工程育种。
【IPC分类】C12N15/82, A01H5/00, C07K14/81, C12N15/15
【公开号】CN105462987
【申请号】CN201610065123
【发明人】张美 , 孙雯, 王晶, 郭艳
【申请人】中国科学院华南植物园
【公开日】2016年4月6日
【申请日】2016年1月29日