BBTI4-pYES2转化酿酒酵母并置于添加半乳糖的生长选 择合成培养基（SelectiveGrowthSyntheticMedium，SDmedium)上生长，即可诱导 0sBBTI4在酵母中异源超量表达。
[0067]酵母转化采用的方法为醋酸锂转化法，具体步骤如下：
[0068] 1)接种待转化的酵母菌株Δycfl的单菌落于5mLYPD液体培养基中，于30°C恒温 摇床(200rpm)，培养过夜达到饱和。
[0069] 2)按照1: 100比例转移上述培养物到20mLYPD液体培养基中于30°C恒温摇床 (200rpm)继续培养，摇3-5h至菌液0D_值达0· 4-0 · 6 ·
[0070] 3)培养液在室温条件下4000g离心5min，收集细胞。细胞用10mL无菌超纯水重悬， 再于室温下5000-6000g离心5min，沉淀细胞。
[0071] 4)细胞用2mL锂盐溶液重悬，锂盐溶液按照下表配制(现配现用）：
[0072]
[0073] 5)将2yL待转化质粒和10yL变性鲑鱼精一起加入1.5mL离心管中混匀。
[0074] 6)往每个离心管中加入200yL用锂盐溶液重悬的细胞悬液，再加入lmL新鲜配制的 PEG溶液。PEG溶液的配方为：
[0075]
[0076] 30°C摇荡温育30min。
[0077] 7)于42°C热激15min，室温下离心5s，细胞沉淀用200yL-lmL1XTE缓冲液(从10X 储液新鲜配制）重悬，并取其中200yL涂布在添加了半乳糖的SD固体培养基平板上。30°C培 养2-5天，直到出现转化子。
[0078] 在超净台中用无菌牙签挑取两种酵母转化子(转化pYES2和0sBBTI-pYES2)到2mL 添加了半乳糖的生长选择合成培养基（SelectiveGrowthSyntheticMedium,SDmedium) 液体培养基中，30°C恒温摇床(200rpm)培养至菌液0D6Q()值达2。之后将两种酵母按照1:500 的体积比接种于600ml添加了半乳糖的SD液体培养基中，30°C摇床(200-250rpm)培养12-24 小时至OD600值达2,之后分别添加CdCl2至终浓度ΙΟμΜ和30μΜ。继续培养24小时后离心收集 菌体。采用双蒸水清洗菌体3遍后，将菌体65°C干燥3-5天，干燥的酵母块进行微波消解后， 采用火焰法原子吸收光谱测定酵母细胞中镉的积累。
[0079]在本发明中，转化0sBBTI4-pYES2的酵母菌株在添加有ΙΟμΜ和30μΜ的CdCl2的培养 基中，体内积累的镉均显著低于转化PYES2空载体的酵母菌株(见图2所示），这表明0sBBTI4 基因在酵母体内的表达降低了酵母细胞对重金属镉的富集，0sBBTI4蛋白能够促进酵母体 内镉的外排。
[0080]实施例2:0sBBTI4基因的转基因超表达载体和RNAi载体的构建及水稻遗传转化 [0081 ] 取100ng的水稻基因组DNA为模板，采用引物0sBBTI40EF:5'_ CGGGATCCATGAGCAACACCACCATGGC-3 ' 和0sBBTI40ER:5 '-CGGGATCCCTAGTTCTCCGCTCGGGGTT-3'（SEQIDN0.3和SEQID勵.4)扩增用于构建0成81'14基因转基因超表达载体的片段;采 用引物0sBBTI4RIF: 5 ' -GGGGTACCACTAGTATGAGCAACACCACCATGGC-3 ' 和〇8881'141?11?:5'-CGGGATCCGAGCTCCTAGTTCTCCGCTCGGGGTT-3'（SEQIDN0.5和SEQIDN0.6)扩增用于构建 0sBBTI4基因转基因RNAi载体的片段。本发明所用的水稻转基因超表达载体为pCU1301 [ChenR,ZhaoX,ShaoZ,ffeiZ,ffangY,ZhuL,ZhaoJ,SunM,HeR,HeG(2007)RiceUDP-glucosepyrophosphorylase1isessentialforpollencallosedepositionandits cosuppressionresultsinanewtypeofthermosensitivegenicmale sterility.PlantCell19(3) :847-861]，并在此基础上构建0sBBTI4基因的水稻转基因超 表达载体0sBBTI4-pCU1301(见图3所示）。
[0082]本发明所用的转基因RNAi载体是pTCK303[WangZ,ChenC,XuY,JiangR,HanY, XuZ,ChongK(2004).APracticalVectorforEfficientKnockdownofGene ExpressioninRice(0ryzasativaL.).PlantMolecualrBiologyReporter22:409-417]，并在此基础上构建0sBBTI4基因的水稻转基因RNAi载体0sBBTI4-pTCK303(见图4所 示)。
[0083] 构建水稻转基因超表达载体0sBBTI4-pCU1301仍采用TaKaRa(Clontech)公司的 In-Fusi〇n?HDCloningKit进行DNA片段和载体的同源重组连接，包括以下步骤：
[0084] (1)以水稻基因组DNA为模板，以0sBBTI40EF:
[0085] 5 '-CGGGATCCATGAGCAACACCACCATGGC-3' 和0sBBTI40ER:
[0086] 5 ' -CGGGATCCCTAGTTCTCCGCTCGGGGTT-3 ' 为引物，PCR扩增，回收扩增产物；
[0087] (2)对水稻转基因超表达载体p⑶1301进行BamHI酶切处理，回收线性化p⑶1301载 体；
[0088] (3)将扩增产物与线性化的p⑶1301载体连接，鉴定阳性克隆并提取质粒0sBBTI4- PCU1301，鉴定，即得。
[0089] 构建RNAi载体0sBBTI4-pTCK303则采用限制性内切酶酶切及连接的方式，该载体 的构建步骤如下：采用引物对0sBBTI4RIF和0sBBTI4RIR，PCR扩增用于构建RNAi载体的 0sBBTI4基因片段，采用琼脂糖凝胶电泳回收该片段后，将该片段连接于pGEMT-Vector上 形成pGEMT-BBTI4RI，经测序分析，插入的0sBBTI4为阅读框全长，序列正确，SEQIDN0.1 所示。用SacI和Spel双酶切pGEMT-BBTI4RI，回收750bp片段F1，同时用SacI和Spel双酶切 载体PTCK303,将回收后的F1片段与经SacI和Spel双酶切处理后的pTCK303载体连接，形成 PTCK303-BBTI4RI-F1，经测序正确后，用BamHI和ΚρηΙ双酶切处理pTCK303-BBTI4RI-Fl载 体。同时用BamHI和ΚρηΙ双酶切pGEMT-BBTI4RI并回收750bp片段F2,然后将F2片段与BamHI 和ΚρηΙ双酶切处理pTCK303-BBTI4RI-Fl载体连接，经测序鉴定正确后，形成0sBBTI4-PTCK303转基因RNAi载体。该转基因RNAi载体0sBBTI4-pTCK303如图4所示。该转基因干涉载 体是将如SEQIDNO. 1所示的序列，分别正反向插入表达载体pTCK303的酶切位点SacI与 Spel之间，和酶切位点ΚρηΙ与BamHI之间，在宿主细胞中，该转基因干涉载体在MaizeUbil pro启动子的启动下，正、反向插入序列转录，并互补形成dsRNA，而对0sBBTI4基因进行干 扰。
[0090] 米用农杆菌EHA105介导的遗传转化方法(Hiei等，Efficienttransformationof rice(0ryzasativaL.)mediatedbyAgrobacteriumandsequenceanalysisofthe boundariesoftheT_DNA，1994，PlantJournal6:271-282)将转基因超表达载体 0sBBTI4-pCU1301和RNAi载体0sBBTI4-pTCK303导入正常粳稻中花11水稻品种，通过⑶S染 色检测，染色为蓝色的则为转基因阳性植株。在本发明中，我们采用qRT-PCR检测了3株转基 因超表达株系和3株转基因RNAi株系，经田间播种后，获得纯合