调控家蚕质型多角体病毒编码的NS5基因的miRNA及其应用
【技术领域】
[0001]本发明属于基因工程领域，涉及到一种调控家蚕质型多角体病毒编码的NS5基因 的microRNA及其应用。
【背景技术】
[0002] 家香质型多角体病毒(Bombyxmoricytoplasmicpolyhedrosisvirus，BmCPV)属 呼肠孤病毒科(Reoviridae)，是危害养蚕业的主要病原物之一，给生产上造成了巨大经济 损失。BmCPV病毒粒子直径约为50-65nm，形状呈正二十面体，具有独特的单层衣壳结构。基 因组由10节段双链RNA分子组成，其中Η株第9片断（661^&1^^?061200)和1株第9片断 (GenBank:AF061199)均为1186bp，编码36kD的NS5，该蛋白具有dsRNA结合活性。目前把质型 多角体病毒按照电泳迀移率的不同分成14个电泳型，BmCPV属I型。其宿主域主要是鳞翅目， 双翅目，膜翅目和鞘翅目等昆虫。BmCPV专一性感染家蚕中肠上皮细胞，感染了BmCPV的家蚕 中肠上皮细胞发生显著病变。感染家蚕表现为发育不良、体形瘦弱、行动呆滞。随着病程的 推进，在中肠后部可看到白色的褶皱，这是家蚕质型多角体病的典型病症之一。
[0003] MicroRNA(miRNA)是一类由18-25个核苷酸组成的小的非编码RNA^iRNA广泛存在 于动物、植物和病毒等生物中，在物种进化中高度保守，并具有时空表达特异性，参与包括 生长发育、细胞凋亡、肿瘤、抗病毒等一系列重要的生命过程。研究表明，宿主编码的miRNA 在受到病毒感染后，其表达水平会发生显著变化。Fullaondo等预测在果蝇中，有超过70个 miRNAs参与果蝇免疫系统相关的Toll信号通路、Imd信号通路以及JNK和JAK/STAT信号通路 的调控，推测由miRNA介导的RNA干扰途径可能是果蝇先天的广谱型免疫机制。miR-8是经实 验室验证的和昆虫免疫应答相关的miRNA。它可负调控果绳中编码Drosomycin以及 Diptericin等抗菌肽(AMP)基因的表达，使得AMP在非感染情况下维持较低水平从而确保免 疫反应维持内稳态。果蝇中若缺失miR-8，体内的AMP将显著升高。miR-8对AMP的负调控也在 小菜蛾(Piute11axyloshe11a)的幼虫实验中得到证实。该研究还发现，miR-8可正向调控 36印;[11-27的表达，56印;[11-27可抑制1'011通路的激活。当感染病原菌时，由于11111?-8表达下 调从而抑制Serpin-27表达，进而激活Toll通路。研究表明，宿主基因组编码的miRNA既可调 控宿主的基因也可作用于病毒的基因，从而调控病毒的增殖。Zhu等研究发现，AcMNPV-miR-1可下调0DV-E25基因的表达，导致芽殖类病毒粒子复制减少，加快有包涵体病毒粒子的成 形。
【发明内容】
[0004] 解决的技术问题:本发明提供一种可调控家蚕质型多角体病毒编码的NS5基因表 达的microRNA分子及其应用。
[0005] 技术方案：调控家蚕质型多角体病毒编码的NS5基因的miRNA，命名为bmo-miR-274-3p，其特征在于核苷酸序列如SEQIDN0.1所示：
[0006] 5，-GUUUGUGACCGUCACUAACGGGCAGU-3，
[0007]所述miRNA在抑制家蚕质型多角体病毒增殖中的应用。
[0008]所述miRNA在抑制家蚕质型多角体病毒编码的NS5基因中的应用。
[0009] 抑制家蚕质型多角体病毒增殖的药物，有效成分为权利要求1所述的miRNA。
[0010] 检测所述miRNA表达水平的茎环荧光定量PCR试剂盒，包括反转录系统、扩增系统 和引物系统；所述反转录系统由gDNAEraser、5XgDNAEraserBuffer、PrimeScriptRT EnzymeMixI、5XPrimeScriptBuffer2、莖环引物、RNase-freeddH2〇组成；所述扩增系 统由2XSYBRPremixExTaq、bm〇-miR-274-3p正向引物、bm〇-miR-274-3p反向引物、ddH20 组成；所述引物系统由莖环引物、bm〇-miR-274-3p正向引物、bm〇-miR-274-3p反向引物、 snU6内参正向引物，snU6内参反向引物组成，引物浓度均为ΙΟμΜ;序列如下：
[0021 ]有益效果:本发明通过茎环荧光定量PCR技术检测得到在家蚕感染BmCPV中肠组织 中表达下调的bm〇-miR-274-3p。发现BmCPV基因组编码的NS5基因为bm〇-miR-274-3p的靶基 因。将人工合成的bm〇-miR-274-3p模拟物注入家蚕体内，可显著抑制BmCPV的增殖。本发明 还公开了用于检测所述miRNA分子的荧光定量试剂盒，具有重要的实际应用价值。
【附图说明】
[0022] 图1为茎环荧光定量PCR技术检测家蚕中肠组织中bm〇-miR-274-3p的相对表达量 示意图；
[0023] 图2为bm〇-miR-274-3p与NS5基因3'UTR的靶点结合示意图；
[0024]图3为双荧光素酶报告基因系统检测bm〇-miR-274-3p对NS5基因抑制作用实验结 果图。构建pmirGL0-AF061200及pmirGL0-AF061200-mut重组质粒。合成bm〇-miR-274-3p 1^1^(3(274)及阴性对照物（叱）。在2931'细胞中分别转染口111化61^0-厶卩061200 4111化61^0-AF061200+274、pmirGL0-AF061200+NC、pmirGL0-AF061200-mut、pmirGL0-AF061200-mut+ 274、pmirGL0-AF061200-mut+NC。转染48h后收集细胞。每个样品按照海肾荧光素酶活性进 行均一化处理，比较萤火虫荧光素酶活性。实验设3次重复。（数值表示为Mean土STDVE。**，P <0.01)；
[0025] 图4为实时荧光定量PCR技术检测NS5的相对表达量图。
【具体实施方式】
[0026] 下面结合附图和实施例对本发明作进一步的详细说明，所述是对本发明的解释而 不是限定。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法或按照制造厂商 所建议的条件;所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。
[0027]实施例1
[0028] 应用茎环荧光定量PCR试剂盒检测bm〇-miR-274-3p在BmCPV感染家蚕中肠组织和 正常中肠组织中的表达水平：
[0029]步骤一，采用Trizol法提取待检样本的RNA。具体流程如下：
[0030] (1)将BmCPV感染家蚕中肠组织和正常中肠组织分别放入加有液氮的研钵中，用研 件迅速将样品砸碎并磨成粉末，分装到RNase-free的1.5mLEppendorf管中，每0.lg组织加lmLTrizol，样品体积应小于Trizol体积的10%;
[0031] (2)振荡混匀，室温温育约1Omin，12000g，4°C离心1Omin;
[0032] (3)将上清转移到另一个新的离心管中，每lmL加入0.2mL氯仿（1/5体积），剧烈摇 动15s，室温放置5min，12000g，4°C离心15min;混合物分成下层的红色苯酸-氯仿相，中间的 蛋白质沉淀和上层无色水相。RNA即位于上清液；
[0033] (4)将上清液转移到另一个干净离心管中，等体积加入预冷的异丙醇，颠倒混匀， 室温静置l〇min，12000g，4°C离心10min，留下RNA沉淀，弃上清；
[0034] (5)加入 75% 乙醇，lmLTrizol加lmL75% 乙醇，涡旋混匀，7500g，4°C离心 5min， 弃上清；
[0035] (6)自然控干RNA沉淀约5-10min，用30-40yL的RNase-free水室温溶解RNA;
[0036] (7)取lyL稀释100倍后，5yL用于琼脂糖凝胶电泳检测RNA质量，剩余用于分光光度 计检测总RNA浓度和纯度，一80°C保存备用。
[0037]步骤二，样品RNA的反转录
[0038]以步骤一中提取的RNA为模板，应用试剂盒中提供的反转录系统反转录合成cDNA。
[0039] 首先去除RNA中基因组DNA污染，反应体系共10yL，其中，5XgDNAEraserBuffer 2yL，gDNAEraserlyL，totalRNA0.5-1 .Oyg，补加RNase-free水至 10yL。反应条件为：42 °C2min，反应结束后，反应液置于4°C保存，用于下一步的反转录。反转录反应体系共20yL， 其中，5XPrimerscriptBuffer4yL，PrimerscriptRTEnzymeMixIlyL，莖环引物（10μ M)lyL，上述反应液10yL，RNase-free水4yL。反应条件为:42°C15min，85°C5s。反应结束后的 cDNA置于-20°C保存备用。
[0040] 步骤三，实时荧光定量PCR反应
[00411将步骤二中的cDNA用ddH20稀释8倍后用于实时荧光定量PCR反应中的模板。应用 试剂盒中提供的扩增系统及引物系统进行荧光定量PCR反应，每个反应作3个重复。反应体 系为：2XSYBRPremixExTaq10yL，bm0-miR-274_3p正向引物（10ymol/L)0.4yL，bmo_ miR-274-3p反向引物（ΙΟμπιο1/L)0.4yL，模板lyL，ddH20 8.2yL，终体积20yL。反应条件为： 95°C预变性lmin; 95°C15s，60°Clmin，40个循环。以家蚕snU6基因为内参，用对定量 法分析bm0-miR-274-3p在感染BmCPV的家蚕中肠组织