和正常家蚕中肠组织中的相对转录水 平。结果如图1所示。bm0-miR-274-3p在感染BmCPV的家蚕中肠组织中的表达水平显著低于 正常中肠组织中的表达水平。
[0042] 实施例2
[0043]bm〇-miR-274_3p的革巴基因生物学预测和实验室验证：
[0044]步骤一，用RNAHybrid生物学软件预测bm〇-miR-274_3p的革E基因。设定种子区域完 全配对及最小自由能为_20kcal/mol为筛选标准，预测得到bm〇-miR-274-3p的革E1基因为 NS5,如图2所示。
[0045]步骤二，双荧光素酶报告基因系统验证靶基因，具体流程如下：
[0046] (1)化学合成靶基因（NS5，GenBank:AF061200;SEQIDN0.2)3'UTR片段，合成时在 目的片段两端加上NheI(GCTAGC)/SalI(GTCGAC)酶切位点。合成的基因片段平端克隆到 PUC57载体，然后测序验证。
[0047] (2)目的片段载体双酶切：37°C用SalI和NheI酶切目的载体片断2h，l%琼脂糖 凝胶电泳，使用QIAquickGelExtractionKit(QIAGEN)回收酶切产物。
[0048] (3)pmirGL0载体双酶切：37°C双酶切过夜；1 %琼脂糖凝胶电泳，使用QIAquick GelExtractionKit(QIAGEN)回收线性化的载体片段。
[0049] (4)目的片段与pmirGLO载体连接:在无菌的0.5mL试管配制以下20yL反应体系：线 性化的pmirGLO载体，2yL(约lOOng);目的DNA片段，5yL(约 300ng);10X T4DNALigaseBuffer，2yL;T4DNALigase，lyL;ddH20，10yL。16°C连接过夜。
[0050] (5)连接产物的转化
[0051 ] 1)冰浴中将5yL连接产物分别加入至100yLDH5a感受态细胞中。轻轻旋转混匀，冰 浴30min。
[0052]2)42°C水浴热击 90s。
[0053]3)快速将管转移至冰浴中，冰浴3min。
[0054] 4)分别加入200yLLB培养基，混匀，37°C，200rpm振荡培养lh。
[0055]5)将菌液涂布于含氨苄青霉素的LB平板表面，室温下放置，至液体吸收。倒置平 板，转移入37°C生化培养箱过夜培养。
[0056] (6)阳性克隆的筛选及测序验证
[0057]挑取单菌落克隆经并Sall+Nhel双酶切电泳鉴定，同时接种含氨苄青霉素的LB液 体培养基培养8h。克隆经双酶切电泳鉴定后测序，与预期序列一致的克隆保留，接种含氨苄 青霉素的LB液体培养基20mL培养12h后提取质粒DNA。
[0058] (7)细胞转染
[0059]化学合成bm〇-miR-274-3p模拟物（274)及阴性对照物 0〇。13111〇-1^1?-274-3?模拟 物核苷酸序列为双链RNA(SEQIDN0.8~9):
[0062]NC核苷酸序列为双链RNA(SEQIDN0·10~11):
[0065]以lipofectamineTM2000(简称lipo2000)转染48孔板。转染前一天，接种适当数 量的293T细胞于48孔培养板中，每孔加入不含抗生素的1640培养基，使转染时的细胞密度 能够达到70 %~80 %。共设置以下组别，每组3个平行孔$111化61^0-4?061200 4111化61^0-AF061200+274、pmirGL0-AF061200+NC、pmirGL0-AF061200-mut、pmirGL0-AF061200-mut+ 274、pmirGL0-AF061200-mut+NC。对于每个转染样品，按如下步骤准备质粒-lipo2000混合 液：
[0066] 1)稀释质粒：用25yL不含血清培养基稀释100ngpmirGL0-AF061200等载体(VI)及 miR-274模拟物等(V2)，轻轻混匀；
[0067] 2)稀释lipo2000:用25yL不含血清培养基稀释lipo2000(V3)，轻轻混匀并室温孵 育5min;
[0068] 3)将V1+V2与V3轻轻混匀，室温孵育20min;
[0069] 4)将质粒-lipo2000混合液加入含有细胞和培养基的48孔板中，轻轻摇匀；
[0070] 5)将培养板置于37°C的C02培养箱中培养4~6h后，将孔里含有质粒-lipo2000混 合液的培养液移去，更换新鲜培养基培养到48h。
[0071] (8)荧光素酶活性测定
[0072] 1)将细胞用细胞裂解液裂解后，取5yL细胞裂解液与海肾荧光素酶缓冲液及底物5 yL(按Promega双荧光报告系统测量试剂盒说明）混匀测量荧光强度，然后加入萤火虫荧光 素酶反应缓冲液及腔肠素底物5yL，混匀再次测得萤火虫荧光素酶活性。
[0073] 2)将每个样品按照海肾荧光素酶活性进行均一化处理，比较萤火虫荧光素酶活性 并绘制图表。实验结果见图3。结果表明，bm〇-miR-274-3p对pmirGL0-AF061200(p<0.05)的 荧光活性有显著抑制作用。
[0074] 实施例3
[0075]bm〇-miR-274-3p在家蚕体内过表达显著抑制BmCPV增殖：
[0076] 步骤一，将人工合成的bm〇-miR-274_3p模拟物注入家蚕体内，方法如下：
[0077] 将感染BmCPV4h的家蚕分为两组，每组5头蚕。处理组用10yL注射器经家蚕节间膜 注射bm〇-miR-274-3p模拟物，每头蚕注射300pmol。对照组注射等量的NC。感染BmCPV48h后 再注射一次。感染72h后解剖家蚕提取中肠组织。
[0078] 步骤二，中肠组织RNA的提取同实施例1中的步骤一。
[0079] 步骤三，RNA的反转录。莖环引物改为Primerscript?RTreagentkit(购自 TaKaRa公司）中的OligodTPrimerlyL，Random6merslyL。其它同实施例1中的步骤二。
[0080] 步骤四，实时荧光定量PCR反应。设计和合成NS5特异引物，正向引物序列为（SEQ IDN0·12):5'-CGCACGCTAAAGTTACGA-3'；反向引物序列为（SEQIDN0·13):5'-CATACGCTGGATGAGACG-3'。内参基因（β-actin)正向引物（SEQIDΝ0·14):5'_ AATGGCTCCGGTATGTGC-3'；内参基因（β-actin)反向引物（SEQIDΝ0·15):5'_ TTGCTCTGTGCCTCGTCT-3 '。用NS5特异引物及内参基因（β-actin)替代实施例1步骤三中的引 物，其它步骤同实施例1中的步骤三。实验结果见图4,家蚕体内过表达miR-274-3p后可显著 抑制BmCPV的增殖。
【主权项】
1. 调控家蚕质型多角体病毒编码的NS5基因的miRNA，命名为bm〇-miR-274-3p，其特征 在于核苷酸序列如SEQIDNO. 1所示。2. 权利要求1所述miRNA在抑制家蚕质型多角体病毒增殖中的应用。3. 权利要求1所述miRNA在抑制家蚕质型多角体病毒编码的NS5基因中的应用。4. 抑制家蚕质型多角体病毒增殖的药物，其特征在于有效成分为权利要求1所述的 miRNA〇5. 检测权利要求1所述miRNA表达水平的茎环荧光定量PCR试剂盒，其特征在于包括反 转录系统、扩增系统和引物系统；所述反转录系统由gDNAEraser、5XgDNAEraser Buffer'PrimeScriptRTEnzymeMixI、5XPrimeScriptBuffer2、莖环引物、RNase-freeddH2〇组成；所述扩增系统由2XSYBRPremixExTaq、bm〇-miR-274_3p正向引物、 bm〇-miR-274_3p反向引物、ddH2〇组成;所述引物系统由莖环引物、bm〇-miR-274_3p正向引 物、bm〇-miR-274-3p反向引物、snU6内参正向引物，snU6内参反向引物组成，引物浓度均为 lOuM;序列如下： 茎环引物： 5 '-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGACTGCCCG-3 '； 正向引物： 5，-ACACTCCAGCTGGGGTTTGTGACCGTCACTAA-3，； 反向引物： 5，-TGGTGTCGTGGAGTCG-3，。 snU6内参正向引物： 5 '-CGTATACTAAAATTGGAACGATACAG-3 '；snU6内参反向引物： 5 '-ATTTTGCGTGTCATCCTTGC-3 '。
【专利摘要】调控家蚕质型多角体病毒编码的NS5基因的miRNA及其应用，命名为bmo-miR-274-3p，其特征在于核苷酸序列如SEQ？ID？NO.1所示。本发明通过茎环荧光定量PCR技术检测得到在家蚕感染BmCPV中肠组织中表达下调的bmo-miR-274-3p。发现BmCPV基因组编码的NS5基因为bmo-miR-274-3p的靶基因。将人工合成的bmo-miR-274-3p模拟物注入家蚕体内，可显著抑制BmCPV的增殖。本发明还公开了用于检测所述miRNA分子的荧光定量试剂盒，具有重要的实际应用价值。
【IPC分类】C12N15/113, A61K31/7088, A61P31/14, A61K48/00
【公开号】CN105462981
【申请号】CN201610012365
【发明人】吴萍, 郭锡杰, 陈涛, 李龙
【申请人】江苏科技大学
【公开日】2016年4月6日
【申请日】2016年1月8日