专利名称：一种茶尺蠖核型多角体病毒的定性检测方法
技术领域：
本发明属生物制剂检测技术领域，具体涉及一种病毒制剂的定性检测方法。
背景技术：
^K^MM^MW'M^ (Ectropis obliqua nucleopolyhedrovirus,EoNPV) Mff 状病毒科，核型多角体病毒属，该病毒于1977年在我国首次发现。EoNPV是茶尺蠖的病原性 天敌，通过幼虫取食后在虫体内迅速增殖，致使其感染发病而死亡。目前这种病毒已可以通 过室内大量增殖，经配制形成产品，进行商业化生产，近年来，EoNPV作为一种高效病毒杀虫 剂在各省茶区广泛推广使用，对茶尺蠖进行有效的生物防治，产生了良好的社会、经济和生 态效益。因为这种病毒产品不同于一般的农药，它是一个活体，目前只有通过生物测定的方 法进行检测。也就是说，用病毒产品喂饲茶尺蠖幼虫，看是否发病来确定该生物农药产品是 否有效，这是因为核型多角体病毒是寄主专一性的，因而茶尺蠖病毒只能感染茶尺蠖幼虫。 这种传统的生物测定的方法使得目前在EoNPV病毒制剂的生产、使用过程中存在毒力指标 检测粗放、评价周期过长、制剂质量难以有效监控等问题。
发明内容
鉴于现有技术中存在的上述问题，本发明发明利用免疫学原理，通过制备茶尺蠖 核型多角体病毒多角体蛋白单克隆抗体，再借助ELISA手段来定性检测未知样品中是否有 茶尺蠖核型多角体病毒。所述的一种茶尺蠖核型多角体病毒的定性检测方法，其特征在于包括以下步骤1)制备茶尺蠖核型多角体病毒单克隆抗体；2)样品检测；所述的步骤1)主要包括以下步骤a.茶尺蠖核型多角体病毒的分离纯化；b.将纯化的茶尺蠖核型多角体病毒作为抗原对小鼠进行免疫；c.细胞融合和克隆在加强免疫3天后取小鼠脾细胞和正处于对数生长期的骨髓 瘤细胞在PEG6000的作用下进行细胞融合，每次融合后，将细胞接种于96孔培养板，用含 HAT的1640完全培养基选择培养10天，然后将HAT改为HT培养1周；待细胞长至显微镜 视野的1/4，取培养上清用ELISA法检测抗体，以茶尺蠖核型多角体病毒作为包被原对所选 阳性细胞进行再筛选，选择最终的阳性细胞以有限稀释法进行克隆；d.对检测为阳性单克隆细胞株进行传代培养，筛选出阳性单克隆抗体细胞株；e.杂交瘤细胞腹水效价测定；f.单抗对病毒蛋白特异性识别；所述的步骤2)主要包括以下步骤a.将待检样品置于包被液中，按每孔100iiL加入酶联板的小孔中，设置对照， 37°C下包被3-4h或4°C冰箱包被过夜；
b.用 1 XPBST 洗涤 3 次，每次 5min ；c.加150μ L重量百分浓度为2% _5 %的脱脂奶粉，37°C下封闭Ih ；d.配制茶尺蠖核型多角体病毒单克隆抗体于2wt% _5衬％脱脂奶粉中，体积配比 为1 1000，每孔加100 μ L，37°C下温浴Ih ；e.用 1 XPBST 洗 涤 3 次，每次 5min ；f.用1 XPBST将辣根过氧化物酶标记的山羊抗鼠稀释5000倍，每孔加100 μ L稀 释后的抗体，37°C下温育Ih; g.用 1 X PBST 洗涤 3 次，每次 5min ；h.力卩 100 μ L 显色液，37°C下温育 3_5min ；i.力口 50 μ L 终止液；j.用酶标仪测读各孔在λ = 492nm处的光密度值0D，计算P/N =样品OD值/对 照OD值，若P/N彡2.1，即为阳性。所述的一种茶尺蠖核型多角体病毒的定性检测方法，其特征在于步骤1)步骤a所 述的茶尺蠖核型多角体病毒分离纯化方法为以茶尺蠖核型多角体病毒感染茶尺蠖幼虫， 收集被感染的茶尺蠖虫尸，用研钵将虫尸磨碎，用5层粗棉布过滤其中较大颗粒后，使用新 配制的裂解液裂解 l_2h，裂解液为 0. lmol/L Na2CO3,0. 05mol/L NaCl，pH = 10. 3 ；用 50% 的HCl中和碱液，3000g离心5min，去除其中未裂解的多角体；再160000g、1.5h超速离心， 沉淀茶尺蠖核型多角体病毒；最后用PBS溶解纯化的病毒粒子，存于4°C冰箱待用。所述的一种茶尺蠖核型多角体病毒的定性检测方法，其特征在于步骤1)步骤b所 述的小鼠免疫具体方法如下将分离纯化后的茶尺蠖核型多角体病毒粒子作为抗原与等量 福氏完全佐剂充分混合，经皮下多点注射BALB/c小鼠，每只80-100 μ g，间隔14d用含等量 的福氏不完全佐剂的蛋白抗原相同剂量作第2、3、4次免疫，14d后，腹腔注射不加佐剂的蛋 白抗原，每只100 μ g，3d后取脾细胞用于细胞融合。所述的一种茶尺蠖核型多角体病毒的定性检测方法，其特征在于步骤1)步骤e 所述的杂交瘤细胞腹水效价测定方法为将筛选出的阳性单克隆杂交瘤细胞株进行扩大培 养，并向小鼠腹部注射降植烧，一周后，使用生理盐水将细胞沉淀悬浮，接种于小鼠腹腔，待 小鼠腹腔明显鼓胀，抽取腹水测定其抗体效价并保存于4°C备检；培养上清或腹水，经稀释 后加到包被原包被的酶标板中，孵育、洗涤后，再加入HRP标记的羊抗鼠IgG，底物显色；阳 性对照为小鼠阳性血清，同时分别以同等稀释的Sp2/0培养上清，或无免疫小鼠血清为阴 性对照，空白对照为PBS。所述的一种茶尺蠖核型多角体病毒的定性检测方法，其特征在于步骤1)步骤 f所述的单抗对病毒蛋白特异性识别方法为首先是克隆表达茶尺蠖核型多角体病毒蛋 白基因，根据茶尺蠖核型多角体病毒基因组的多角体蛋白基因序列，采用DNAStar软件， 设计了 一对特异性引物如下EoNPV ph F :5，-atgtatactcgttaca-3，和 EoNPV ph R 5’ -ttaatacgcaggtcct-3’，扩增多角体蛋白基因，PCR反应采用25 μ L体系，PCR扩增程序 如下先94°C预变性3min ；然后94°C 30s, 62°C 30s, 72°C 30s ；循环30次，最后72°C延伸 IOmin ；PCR产物用琼脂糖凝胶电泳鉴定；将扩增的基因片段克隆连接至pMDIS-T克隆载体，连接产物转化至TG1，提取质 粒，用BamH I和Xho I双酶切切下ph基因片段，并连接到经BamH I和Xho I双酶切的表达载体质粒PGEX-4T2，提取质粒并用BamH I和Xho I双酶切鉴定，得到表达载体质粒 pGEX-4T2-ph ；将构建的pGEX-4T2_ph表达载体转化表达菌E. coli BL21，挑取单菌落并在37°C、 200rpm/min条件下对其进行培养8_10h ；第二天用5%菌液转接于5mLLB液体培养基中，培 养2-3h，直至0D600为0. 4-0. 6，随后加入0. lmmol/L的IPTG，在37°C对其诱导培养6_8h， 收集菌体，用PBS稀释，然后加入SDS-PAGE上样缓冲液，进行沸水浴5min，使用12000g转速 离心lOmin去除不溶物质， 取10 u L样品进行SDS-PAGE检测及Western-blot分析；在此过 程中，同时以BL21菌液和转化PGEX-4T2的诱导菌液作为参照；利用Western-blot对两株单抗的特异性进行鉴定，按常规方法进行；将茶尺蠖病 毒粒子、多角体表达蛋白、载体PEGX-4T2表达蛋白进行SDS-PAGE，用小鼠腹水作为一抗。上述的一种茶尺蠖核型多角体病毒的定性检测方法，突破了传统的生物测定技 术，解决了茶尺蠖核型多角体病毒的准确定性问题。本发明的优点是借助免疫学手段，制 备了茶尺蠖核型多角体病毒单克隆抗体，建立了茶尺蠖核型多角体病毒的准确定性检测方 法，与传统生物测定方法相比，本方法毒力指标检测更为精细，毒力评价周期大大缩短，可 广泛用于病毒制剂质量的评定，规范茶尺蠖病毒的生产应用。
图 1 为 EoNPV Western-blot 分析结果；图 2 为 SDS-PAGE 和 Western-blot 分析结果；图2中M 蛋白质分子质量标准；1 :GST_Ph融合蛋白；2 :PGEX_4T_2载体；3 :ph融 合蛋白；4 :PGEX-4T-2o
具体实施例方式现结合本发明的实施例对本发明作进一步说明。实施例1、茶尺蠖核型多角体病毒多角体蛋白单克隆抗体的制备1. EoNPV病毒粒子的分离纯化以茶尺蠖核型多角体病毒EoNPV(浙江杭州株)感染适龄幼虫，收集并磨碎染病 死亡虫尸；用5层粗棉布过滤其中较大颗粒后，使用适量新配制的裂解液0. lmol/L Na2C03, 0. 05mol/L NaCl (pH = 10. 3)裂解多角体 l_2h ；用 50% 的 HC1 中和碱液，3000g 离心 5min， 去除其中未裂解的多角体；在160000g、l. 5h超速离心，沉淀EoNPV病毒粒子；最后用PBS溶 解纯化的病毒粒子，存于4°C冰箱待用。2.小鼠免疫将分离纯化后的茶尺蠖核型多角体病毒粒子作为抗原与等量福氏完全佐剂充分 混合，经皮下多点注射BALB/c小鼠，每只80-100 u g，间隔14d用含等量的福氏不完全佐 剂的蛋白抗原相同剂量作第2、3、4次免疫，14d后，腹腔注射不加佐剂的蛋白抗原，每只 100 u g，3d后取脾细胞用于细胞融合。3.细胞融合和克隆在加强免疫后3天左右取小鼠脾细胞和正处于对数生长期的骨髓瘤细胞在 PEG6000的作用下进行融合，每次融合后，将细胞接种于96孔培养板，用含HAT的1640完全培养基选择培养10天左右，然后将HAT改为HT培养1周。待细胞长至显微镜视野的1/4，取培养上清用ELISA法检测抗体，以EoNPV病毒粒 子作为包被原对所选阳性细胞进行再筛选，选择最终的阳性细胞以有限稀释法进行克隆。4.阳性单克隆抗体细胞株的筛选对检测为阳性的单克隆细胞株进行规律传代培养，并且每一代检测它们的抗体分 泌情况，最终获得稳定分泌抗体的EoNPV单克隆抗体细胞株。目的初筛选所得细胞株不一 定是单个杂交瘤细胞株，里面可能混有其它细胞，因此必须进行3次以上的亚克隆，直至所 有细胞孔都为阳性方可。5.小鼠腹水制备及鉴定将最后筛选出的阳性单克隆杂交瘤细胞株进行扩大培养，并向小鼠腹部注射降植 烷，一周后，使用生理盐水将细胞沉淀悬浮，接种于小鼠腹腔，待小鼠腹腔明显鼓胀，抽取腹 水测定其抗体效价并保存于4°C备检。6. McAb效价测定培养上清或腹水，经稀释后加到包被原包被的酶标板中，孵育、洗涤后，再加入HRP 标记的羊抗鼠IgG，底物显色。阳性对照为小鼠阳性血清，同时分别以同等稀释的Sp2/0培 养上清，或无免疫小鼠血清为阴性对照，空白对照为PBS。7.单抗对病毒蛋白特异性识别首先是克隆表达茶尺蠖核型多角体病毒蛋白基因，根据茶尺蠖核型多角体病毒 基因组(NC_008586. 1)的多角体蛋白基因序列，采用DNAStar软件，设计了一对特异性引 物，EoNPV ph F:5，-GGATCCatgtatactcgttaca-3，(见序列表 SEQ No. 1)禾口 EoNPV ph R 5，-CTCGAGttaatacgcaggtcct-3，(见序列表 SEQ No. 2)扩增多角体蛋白基因(GGATCC 和 CTCGAG为酶切位点)。PCR反应采用25 ii L体系，PCR扩增程序如下先94°C预变性3min ； 然后94°C 30s,62°C 30s,72°C 30s ；循环30次，最后72°C延伸lOmin。PCR产物用琼脂糖凝 胶电泳鉴定，预测片段大小约741bp。(测序结果为ATGTATACTCGTTACAGTTACAACCCGTCGTT GGGTCGCACCTACGTCTACGACAATAAGTATTTCAAGAATCTCGGCGCCGTAATCAAAAACGCCAAACGCAAGAAGC ATCAACTTGAACATGAAGTCGAAGAACACGCTCTCGACCCTCTGGACAGGTATCTTGTTGCCGAGGACCCTTTCATG GGGCCGGGCAAGAATCAAAAACTAACTTTGTTCAAAGAGATTCGCAACGTCAAGCCCGACACGATGAAACTGATCGT TAATTGGAGCGGCAAAGAATTTCTCAGAGAAACTTGGACTCGTTTCATGGAAGACAGTTTCCCCATTGTCAACGACC AAGAAGTGATGGACGTGTTTTTGGTGATTAACATGCGTCCCACCAGGCCCAACCGTTGTTACAAATTCTTAGCTCAA CACGCGCTGCGTTGCGATCCCGATTACGTGCCGCACGAGGTGATCAGAATCGTTGAGCCCAGCTACGTGGGCAGCAA CAACGAATATCGCATCAGTCTGGCTAAACGCGGAGGCGGTTGCCCCGTTATGAACCTGCACGCCGAGTACACCAACT CTTTCGAGGAATTCATCAACCGCGTGATTTGGGAGAATTTCTACAAGCCCATCGTGTATGTGGGCACCGATTCCGCC GAAGAGGAGGAAATCCTACTTGAAGTTTCGCTTGTCTTCAAAATCAAAGAATTCGCCCCTGACGCACCTTTGTATTC AGGACCTGCGTATTAA (见序列表 SEQ No. 3)。将扩增的基因片段克隆连接至pMD18-T克隆载体，连接产物转化至TG1，提取质 粒，用BamH I和Xho I双酶切切下ph基因片段，并连接到经BamH I和Xho I双酶切的 表达载体质粒PGEX-4T2，提取质粒并用BamH I和Xho I双酶切鉴定，得到表达载体质粒 pGEX-4T2-ph。将构建的pGEX-4T2_ph表达载体转化表达菌E. coli BL21，挑取单菌落并在37°C、200rpm/min条件下对其进行培养8-10h。第二天用5%菌液转接于5mLLB液体培养基中，培 养2-3h，直至0D600为0. 4-0. 6，随后加入0. lmmol/L的IPTG，在37°C对其诱导培养6_8h， 收集菌体，用PBS稀释，然后加入SDS-PAGE上样缓冲液，进行沸水浴5min，使用12000rpm转 速离心lOmin去除不溶物质，取10 ii L左右样品进行SDS-PAGE检测及Western-blot分析。 在此过程中，同时以BL21菌液和转化pGEX-4T2的诱导菌液作为参照。利用Western-blot对两株单抗的特异性进行鉴定，按常规方法进行。将茶尺蠖 病毒粒子、多角体表达蛋白、载体PEGX-4T2表达蛋白进行SDS-PAGE，用小鼠腹水作为一抗。 通过Western-blot实验，以确定与EoNPV单抗特异性结合的蛋白是否是该病毒的多角体蛋 白。分析结果见图1和图2。其中图1中，制备的单抗与茶尺蠖核型多角体病毒蛋白结 合，证明该单抗为茶尺蠖核型多角体病毒的单抗，即此单抗可以用于茶尺蠖核型多角体病 毒的定性检测。图2中SDS-PAGE的样品1和2分别为表达的GST_Ph融合蛋白，ph代表茶 尺蠖核型多角体病毒的多角体蛋白、PGEX-4T-2载体；Western-blot的样品3和4分别为 ph 蛋白、PGEX-4T-2。实施例2、ELISA检测取EoNPV生物制剂和化学农药，使用0.9%的生理盐水将样品按1 10、1 100、 1 1000,1 10000稀释，用移液枪将其混勻，为稀释后的样品设置3个重复，并设置阴 性对照，用1XPBS作为阴性对照。将上述配置稀释后的样品随后向酶标板小孔分别加入 100 u L/孔。在4°C冰箱包被过夜或者37°C下包被2-3h。A.使用1 X PBST连续洗涤酶标板3次，每次洗涤5min ；B.配制2%-4%的脱脂奶粉，向小孔中分别加150 iiL 2%-5%脱脂奶粉，在37°C 下封闭lh。 C.使用1 X PBST连续洗涤酶标板3次，每次洗涤5min ；D.将制备的EoNPV单克隆抗体溶于2% 脱脂奶粉中，按1 1000稀释，每孔 加 lOOil L，在 37°C下温浴 l_2h。E.使用1 X PBST连续洗涤酶标板3次，每次洗涤5min ；F.将辣根过氧化物酶标记的山羊抗鼠按1 5000用1XPBST稀释，在酶标板中每 孔加入100 uL 37°C下温育lh。G.使用1 XPBST连续洗涤酶标板3次，每次洗涤5min ；加显色液100 u L/孔，在 37°C下温育10-15min。显色液为24. 3mL 0. 1M柠檬酸和25. 7mL 0. 2MNa2HP04等体积混合， 并在临用前加入20mg邻苯二胺和75 ii L双氧水。H.向每孔加入2mol/L H2S04终止液50 u L，终止该反应。I.使用酶标仪测读酶标板各孔在入=492nm处的光密度值0D，然后计算P/N = 样品0D值/对照0D值。如果P/N彡2. 1，则为阳性。试验结果应用上述所制备的抗体对样品进行ELISA检测，结果显示，阳性EoNPV 生物制剂样品均显色，且颜色较深，阴性对照无显色反应，且化学农药和1XPBS阴性对照 的0D492值均较小，另外EoNPV生物制剂样品与阴性对照0D492值之比大于2. 1。
序列表
<110>中国农业科学院茶叶研究所<120> 一种茶尺蠖核型多角体病毒的定性检测方法
<130>案卷参考号
<160>3
<170>PatentIn version 3.3
<210>1
<211>16
<212>DNA
<213>人工序列
<400>1
atgtatactc gttaca <210>2 <211>16 <212>DNA <213>人工序列 <400>2
ttaatacgca ggtcct
<210>3
<211>741
<212>DNA
<213>人工序列
<400>3
16
16
atgtatactcgttacagttacaacccgtcgttgggtcgcacctacgtctacgacaataag60tatttcaagaatctcggcgccgtaatcaaaaacgccaaacgcaagaagcatcaacttgaa120catgaagtcgaagaacacgctctcgaccctctggacaggtatcttgttgccgaggaccct180ttcatggggccgggcaagaatcaaaaactaactttgttcaaagagattcgcaacgtcaag240cccgacacgatgaaactgatcgttaattggagcggcaaagaatttctcagagaaacttgg300actcgtttcatggaagacagtttccccattgtcaacgaccaagaagtgatggacgtgttt360ttggtgattaacatgcgtcccaccaggcccaaccgttgttacaaattcttagctcaacac420gcgctgcgttgcgatcccgattacgtgccgcacgaggtgatcagaatcgttgagcccagc480tacgtgggcagcaacaacgaatatcgcatcagtctggctaaacgcggaggcggttgcccc540gttatgaacctgcacgccgagtacaccaactctttcgaggccgcgtgatt600tgggagaatttctacaagcccatcgtgtatgtgggcaccgattccgccgaagaggaggaa660atcctacttgaagtttcgcttgtcttcaaaatcaaagaattcgcccctgacgcacctttg720tattcaggacctgcgtattaa74权利要求
一种茶尺蠖核型多角体病毒的定性检测方法，其特征在于包括以下步骤1)制备茶尺蠖核型多角体病毒单克隆抗体；2)样品检测；所述的步骤1)主要包括以下步骤a.茶尺蠖核型多角体病毒的分离纯化；b.将纯化的茶尺蠖核型多角体病毒作为抗原对小鼠进行免疫；c.细胞融合和克隆在加强免疫3天后取小鼠脾细胞和正处于对数生长期的骨髓瘤细胞在PEG6000的作用下进行细胞融合，每次融合后，将细胞接种于96孔培养板，用含HAT的1640完全培养基选择培养10天，然后将HAT改为HT培养1周；待细胞长至显微镜视野的1/4，取培养上清用ELISA法检测抗体，以茶尺蠖核型多角体病毒作为包被原对所选阳性细胞进行再筛选，选择最终的阳性细胞以有限稀释法进行克隆；d.对检测为阳性单克隆细胞株进行传代培养，筛选出阳性单克隆抗体细胞株；e.杂交瘤细胞腹水效价测定；f.单抗对病毒蛋白特异性识别；所述的步骤2)主要包括以下步骤a.将待检样品置于包被液中，按每孔100μL加入酶联板的小孔中，设置对照，37℃下包被3-4h或4℃冰箱包被过夜；b.用1×PBST洗涤3次，每次5min；c.加150μL重量百分浓度为2％-5％的脱脂奶粉，37℃下封闭1h；d.配制茶尺蠖核型多角体病毒单克隆抗体于2wt％-5wt％脱脂奶粉中，体积配比为1∶1000，每孔加100μL，37℃下温浴1h；e.用1×PBST洗涤3次，每次5min；f.用1×PBST将辣根过氧化物酶标记的山羊抗鼠稀释5000倍，每孔加100μL稀释后的抗体，37℃下温育1h；g.用1×PBST洗涤3次，每次5min；h.加100μL显色液，37℃下温育3-5min；i.加50μL终止液；j.用酶标仪测读各孔在λ＝492nm处的光密度值OD，计算P/N＝样品OD值/对照OD值，若P/N≥2.1，即为阳性。
2.根据权利要求1所述的一种茶尺蠖核型多角体病毒的定性检测方法，其特征在于 步骤1)步骤a所述的茶尺蠖核型多角体病毒分离纯化方法为以茶尺蠖核型多角体病毒 感染茶尺蠖幼虫，收集被感染的茶尺蠖虫尸，用研钵将虫尸磨碎，用5层粗棉布过滤其中较 大颗粒后，使用新配制的裂解液裂解l_2h，裂解液为0. lmol/L Na2C03,0. 05mol/L NaCl, pH =10. 3 ；用50%的HC1中和碱液，3000g离心5min，去除其中未裂解的多角体；再160000g、 1. 5h超速离心，沉淀茶尺蠖核型多角体病毒；最后用PBS溶解纯化的病毒粒子，存于4°C冰 箱待用。
3.根据权利要求1所述的一种茶尺蠖核型多角体病毒的定性检测方法，其特征在于步 骤1)步骤b所述的小鼠免疫具体方法如下将分离纯化后的茶尺蠖核型多角体病毒粒子作 为抗原与等量福氏完全佐剂充分混合，经皮下多点注射BALB/c小鼠，每只80-100 u g，间隔14d用含等量的福氏不完全佐剂的蛋白抗原相同剂量作第2、3、4次免疫，14d后，腹腔注射 不加佐剂的蛋白抗原，每只100 μ g，3d后取脾细胞用于细胞融合。
4.根据权利要求1所述的一种茶尺蠖核型多角体病毒的定性检测方法，其特征在于步 骤1)步骤e所述的杂交瘤细胞腹水效价测定方法为将筛选出的阳性单克隆杂交瘤细胞株 进行扩大培养，并向小鼠腹部注射降植烷，一周后，使用生理盐水将细胞沉淀悬浮，接种于 小鼠腹腔，待小鼠腹腔明显鼓胀，抽取腹水测定其抗体效价并保存于4°C备检；培养上清或 腹水，经稀释后加到包被原包被的酶标板中，孵育、洗涤后，再加入HRP标记的羊抗鼠IgG， 底物显色；阳性对照为小鼠阳性血清，同时分别以同等稀释的Sp2/0培养上清，或无免疫小 鼠血清为阴性对照，空白对照为PBS。
5.根据权利要求1所述的一种茶尺蠖核型多角体病毒的定性检测方法，其特征在于步 骤1)步骤f所述的单抗对病毒蛋白特异性识别方法为首先是克隆表达茶尺蠖核型多角 体病毒蛋白基因，根据茶尺蠖核型多角体病毒基因组的多角体蛋白基因序列，采用DNAStar 软件，设计了一对特异性引物如下EoNPV ph F 5' -atgtatactcgttaca-3，和EoNPV ph R 5' -ttaatacgcaggtcct-3，，扩增多角体蛋白基因，PCR反应采用25 μ L体 系，PCR扩增程序如下先94°C预变性3min ；然后94°C 30s, 62°C 30s, 72°C 30s ；循环30次， 最后72°C延伸IOmin ；PCR产物用琼脂糖凝胶电泳鉴定；将扩增的基因片段克隆连接至PMD18-T克隆载体，连接产物转化至TG1，提取质粒，用 BamH I和Xho I双酶切切下ph基因片段，并连接到经BamH I和Xho I双酶切的表达载体质 粒PGEX-4T2，提取质粒并用BamH I和Xho I双酶切鉴定，得到表达载体质粒pGEX_4T2-ph ； 将构建的pGEX-4T2-ph表达载体转化表达菌E. coli BL21,挑取单菌落并在37°C、 200rpm/min条件下对其进行培养8_10h ；第二天用5%菌液转接于5mLLB液体培养基中，培 养2-3h，直至0D600为0. 4-0. 6，随后加入0. lmmol/L的IPTG，在37°C对其诱导培养6_8h， 收集菌体，用PBS稀释，然后加入SDS-PAGE上样缓冲液，进行沸水浴5min，使用12000g转速 离心IOmin去除不溶物质，取10 μ L样品进行SDS-PAGE检测及Western-blot分析；在此过 程中，同时以BL21菌液和转化PGEX-4T2的诱导菌液作为参照；利用Western-blot对两株单抗的特异性进行鉴定，按常规方法进行；将茶尺蠖病毒粒 子、多角体表达蛋白、载体PEGX-4T2表达蛋白进行SDS-PAGE，用小鼠腹水作为一抗。
全文摘要
一种茶尺蠖核型多角体病毒的定性检测方法，属生物制剂检测技术领域，其特征在于先制备茶尺蠖核型多角体病毒多角体蛋白单克隆抗体，然后将待检样品进行包被，使用间接Elisa方法进行检测。本发明借助免疫学手段，突破了传统的生物测定技术，解决了茶尺蠖核型多角体病毒的准确定性问题。与传统生物测定方法相比，本方法毒力指标检测更为精细，毒力评价周期大大缩短，可广泛用于病毒制剂质量的评定，规范茶尺蠖病毒的生产应用。
文档编号G01N33/577GK101871944SQ20101019002
公开日2010年10月27日 申请日期2010年6月2日 优先权日2010年6月2日
发明者付建玉, 唐美君, 杜军利, 肖强 申请人:中国农业科学院茶叶研究所