专利名称：蚕微孢子虫、核型多角体病毒和浓核病毒的三重荧光pcr检测方法及试剂盒和引物、探针的制作方法
技术领域：
本发明属于生物检测技术领域,涉及家蚕微孢子虫(Ab1Seaa bombycis, Nb)、家蚕核型多角体病毒(及mori Nuclear Polyhedrosis Virus, BmNPV)和家香浓核病毒 (.Bombyx mori Densovirus, BmDNV)的三重突光定量PCR检测方法及试剂盒和引物、探针。
背景技术：
家香微抱子虫iNosema bombyci s, Nb)、家香核型多角体病毒iBombyx mori Nuclear Polyhedrosis Virus,BmNPV)和家香浓核病毒麗xri Densovirus,BmDNV), 分别是引起家蚕的微粒子病、核型多角体病和家蚕浓核病的病原体，均可造成世界蚕业巨大经济损失，甚至有可能同时混合感染。由于对上述蚕病缺少有效的控制手段，因此对病原微生物的早期检测鉴定非常重要，准确灵敏的检测方法能有效的防止疾病的传播，减少经济损失。蚕微孢子虫属原生动物界微孢子虫门、微孢子虫纲、微孢子虫目、微孢子虫科、微孢子虫属。家蚕核型多角体病毒属杆状病毒科，真杆状病毒亚科，核型多角体病毒属，是双链DNA病毒。家蚕浓核病毒属细小病毒科，浓核病毒亚科，相同病毒属，是单链DNA病毒。显微镜被广泛用于家蚕孢子虫的检测，但其特异性和灵敏度不高，检测速度和效率较低；而对家蚕核型多角体病毒和家蚕浓核病毒的检测，更加需要电子显微镜，检测速度和效率较低，也不能同时鉴别诊断。血清学鉴别法具有特异性强、灵敏度高的特点，但是存在比较高的交叉反应与非特异性反应，而且家蚕孢子虫是颗粒性抗原，血清学检测不稳定。随着分子生物技术的发展，上述3种病原体都可以通过在保守区域设计特异性引物，进行PCR检测。荧光实时定量PCR (Real-time PCR)是在PCR反应体系中加入荧光基团标记的探针，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过扩增曲线对结果进行分析。 TaqMan探针是常用的一种荧光标记方法，PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的TaqMan荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的 5’ 一3’外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。多重荧光定量PCR技术是指在同一个荧光定量PCR扩增试验中同时扩增多个目的基因，而每个目的基因采用不同波长的荧光探针进行检测，根据该原理设计特异性多重荧光探针，常用的荧光基团有FAM、TET、VIC、HEX、ROX等，可通过不同的荧光检测通道，同时检测多种荧光信号。
发明内容
为了实现同步检测家蚕微孢子虫、家蚕核型多角体病毒和家蚕浓核病毒，本发明的第一个目的是提供蚕微孢子虫、家蚕核型多角体病毒和家蚕浓核病毒的三重荧光定量PCR检测用试剂盒；本发明的第二个目的是提供蚕微孢子虫、家蚕核型多角体病毒和家蚕浓核病毒的检测引物和探针；本发明的第三个目的是提供蚕微孢子虫、家蚕核型多角体病毒和家蚕浓核病毒的三重荧光定量PCR检测方法。本发明实现在家蚕中对上述3种病原微生物的快速早期鉴别诊断，由于引物和探针具有很高的特异性和灵敏度，提高了早期鉴别检测效率，并简化了检测方法。为了实现上述的第一个目的，本发明采用了以下的技术方案
蚕微孢子虫、家蚕核型多角体病毒和家蚕浓核病毒的三重荧光定量PCR检测试剂盒， 该试剂盒包括Premix Ex Taq试剂、引物和探针,其中
1)家蚕微孢子虫的引物和探针
引物的序列如下上游引物AGTGCCATCGTTGCTGGTT,
下游引物TGGGCCTTTCTTCTTTCCTAT ；
探针的序列如下FAM-ACCGCTAAGGAAACCCGCAAGGA-Eclipse ；
2)家蚕核型多角体病毒的引物和探针
引物的序列如下上游引物ATCGCCATCGGACAACGCGG，
下游引物GTGGCCGTCCGAATGCGTCT ；
探针的序列如下HEX-TTATGTCGGTGGATCGACAA-Eclipse ；
3)家蚕浓核病毒的引物和探针
引物的序列如下上游引物GGTGGAAGTGGAAGTGGAAA，
下游引物TTTCCACTCGATTGGCTTGT ；
探针的序列如下ROX-GGTGCAAGTAGAGGAGGTGC-Ec Iipse0为了实现上述的第二个目的，本发明采用了以下的技术方案
蚕微孢子虫荧光定量PCR检测用引物，该引物的序列如下
上游引物AGTGCCATCGTTGCTGGTT，
下游引物TGGGCCTTTCTTCTTTCCTAT。蚕微孢子虫荧光定量PCR检测用探针，该探针针对上述的引物扩增的基因片段， 探针的序列如下FAM-ACCGCTAAGGAAACCCGCAAGGA-Ec Iipse0家蚕核型多角体病毒荧光定量PCR检测用引物，该引物的序列如下
上游引物ATCGCCATCGGACAACGCGG，
下游引物GTGGCCGTCCGAATGCGTCT。家蚕核型多角体病毒荧光定量PCR检测用探针，该探针针对上述的引物扩增的基因片段，探针的序列如下HEX-TTATGTCGGTGGATCGACAA-Eclipse。家蚕浓核病毒荧光定量PCR检测用引物，该引物的序列如下
引物的序列如下上游引物GGTGGAAGTGGAAGTGGAAA，
下游引物TTTCCACTCGATTGGCTTGT。家蚕浓核病毒荧光定量PCR检测用探针，该探针针对上述的引物扩增的基因片段，探针的序列如下探针的序列如下ROX-GGTGCAAGTAGAGGAGGTGC-Eclipse。为了实现上述的第三个目的，本发明采用了以下的技术方案
蚕微孢子虫、家蚕核型多角体病毒和家蚕浓核病毒的三重荧光定量PCR检测方法，该方法包括以下的步骤1)样本DNA提取选取感染上述病原体的家蚕材料O.2g，经玻璃珠破碎法破碎，6000 r/min, 20 s X 6次，使用DNA抽提试剂盒进行DNA抽提，抽提后的DNA溶解在20 μ I水中；
2)三重荧光PCR扩增法对3种样本的同步检测
蚕微孢子虫、家蚕核型多角体病毒和家蚕浓核病毒的引物和探针的序列如上所述；
三重荧光PCR反应体系如下10μ I Premix Ex Taq，各引物10 pmol/μ I均O. 13 μ 1， 各探针10 pmol/μ I均0.27 μ 1，取上述提取的DNA液4μ 1，蚕微孢子虫、家蚕核型多角体病毒和家蚕浓核病毒的DNA浓度分别为2. 5 ng/ μ 1，用水补足体积至20 μ I ;
应用荧光定量PCR仪Iightcycle 480进行反应，反应程序为(I) 95°C, 10 sec ； (2) 95°C,5 sec ；60°C,23 sec ；40 个循环；
3)调用相应荧光补偿程序，进行荧光补偿，对结果进行判定；一般认为Ct值小于等于 35时，结果为阳性，Ct值大于等于40时，结果为阴性，Ct值介于35-40时，需要进行重复检测，若仍介于35-40，则判断为阳性，若大于等于40则判断为阴性。上述的荧光补偿反应程序参照Roche说明书，S卩⑴95°C，10 sec ； (2) 95°C，5 sec ；60°C,23 sec ；40 个循环；(3)95°C，10 sec ；40°C,30 sec ；95°C, continous ；40°C,1 sec。补偿反应时进行单重突光反应,单重突光反应体系如下10μ1 Premix Ex Taq,上述的上游、下游引物10 pmol/μ I各O. 4μ 1，上述的探针10 pmol/μ 1，O. 8 μ 1，取DNA 1μ 1， 蚕微孢子虫、家蚕核型多角体病毒和家蚕浓核病毒的的DNA含量分别为2. 5 ng/ μ I,用水补足体积至20 μ I0本发明基于具有高度物种特异性的家蚕微孢子虫小亚单位核糖体RNA基因序观 iNosema bombycis small subunit ribosomal RNA, FJ854545 (基因序列号))、家香核型多角体病毒DNA聚合酶基因序列mori nucleopolyhedrovirus gene for DNA polymerase, D16231)和家蚕浓核病毒镇江株假设结构蛋白基因序列mori densovirus isolate Zhenjiang putative structural protein gene, AY236978),分别设计了各自的引物和探针，并在3个探针上标记了不同的荧光信号，在优化了 PCR反应体系的条件下，实现三重荧光定量PCR同步检测蚕微孢子虫、家蚕核型多角体病毒和家蚕浓核病毒。由于该3种病原体的核酸均为DNA，因此，不仅可实现DNA同步提取，也可以进行荧光 PCR同步检测，大大简化了检测方法，并通过荧光补偿的程序，有效地消除了因荧光信号的交集而引起的假阳性。由于该方法引入了高特异性扩增引物和不同荧光标记的探针，确保了本方法能快速、特异和灵敏的一次性鉴别检测蚕微孢子虫、家蚕核型多角体病毒和家蚕浓核病毒，可提高早期检出率，有效防止疾病的传播，减少经济损失。
具体实施例方式实施例I引物和探针的设计
基于具有高度物种特异性的家蚕微孢子虫小亚单位核糖体RNA基因序列iNoserm bombycis small subunit ribosomal RNA, FJ854545 (基因序列号))、家香核型多角体病毒DNA聚合酶基因序列{Bombyx mori nucleopolyhedrovirus gene for DNA polymerase, D16231)和家香浓核病毒镇江株假设结构蛋白基因序列mori densovirus isolate Zhenjiang putative structural protein gene，AY236978)，用生物信息学方法根据引物设计原则，并利用Primer Express设计软件，设计出扩增上述基因片段的特异性引物和荧光探针若干组。将设计得到的引物和探针--进行BLAST验证(http://blast. ncbi. nlm.
nih. gov/),以保证引物的高特异性。并进一步利用DNAStar软件,验证各引物探针间是否会产生引物二聚体等。经过上述验证，最后选择了如表I所示的引物和探针，并在探针上分别标记不同的荧光信号，以实现3通道同步检测。表I家蚕微孢子虫、核型多角体病毒和浓核病毒检测的引物和探针
权利要求
1.蚕微孢子虫、家蚕核型多角体病毒和家蚕浓核病毒的三重荧光定量PCR检测试剂盒，该试剂盒包括Premix Ex Taq试剂、引物和探针,其特征在于1)家蚕微孢子虫的引物和探针引物的序列如下上游引物AGTGCCATCGTTGCTGGTT,下游引物TGGGCCTTTCTTCTTTCCTAT ；探针的序列如下FAM-ACCGCTAAGGAAACCCGCAAGGA-Eclipse ；2)家蚕核型多角体病毒的引物和探针引物的序列如下上游引物ATCGCCATCGGACAACGCGG，下游引物GTGGCCGTCCGAATGCGTCT ；探针的序列如下HEX-TTATGTCGGTGGATCGACAA-Eclipse ；3)家蚕浓核病毒的引物和探针引物的序列如下上游引物GGTGGAAGTGGAAGTGGAAA，下游引物TTTCCACTCGATTGGCTTGT ；探针的序列如下ROX-GGTGCAAGTAGAGGAGGTGC-Ec Iipse0
2.蚕微孢子虫荧光定量PCR检测用引物，其特征在于该引物的序列如下上游引物AGTGCCATCGTTGCTGGTT，下游引物TGGGCCTTTCTTCTTTCCTAT。
3.蚕微孢子虫荧光定量PCR检测用探针，其特征在于该探针针对权利要求2所述引物扩增的基因片段，探针的序列如下FAM-ACCGCTAAGGAAACCCGCAAGGA-Eclipse。
4.家蚕核型多角体病毒荧光定量PCR检测用引物，其特征在于该引物的序列如下 上游引物ATCGCCATCGGACAACGCGG，下游引物GTGGCCGTCCGAATGCGTCT。
5.家蚕核型多角体病毒荧光定量PCR检测用探针，其特征在于该探针针对权利要求4 所述弓I物扩增的基因片段，探针的序列如下HEX-TTATGTCGGTGGATCGACAA-Eclipse。
6.家蚕浓核病毒荧光定量PCR检测用引物，其特征在于该引物的序列如下上游引物GGTGGAAGTGGAAGTGGAAA，下游引物TTTCCACTCGATTGGCTTGT。
7.家蚕浓核病毒荧光定量PCR检测用探针，其特征在于该探针针对权利要求6所述引物扩增的基因片段，探针的序列如下ROX-GGTGCAAGTAGAGGAGGTGC-Eclipse。
8.蚕微孢子虫、家蚕核型多角体病毒和家蚕浓核病毒的三重荧光定量PCR检测方法， 其特征在于该方法包括以下的步骤1)样本DNA提取选取感染病原体的家蚕材料O.2g，经玻璃珠破碎法破碎，6000 r/ min, 20 s X 6次，使用DNA抽提试剂盒进行DNA抽提，抽提后的DNA溶解在20 μ I水中；2)三重荧光PCR扩增法对3种样本的同步检测蚕微孢子虫、家蚕核型多角体病毒和家蚕浓核病毒的引物和探针的序列如权利要求I 所示；三重荧光PCR反应体系如下10μ I Premix Ex Taq，各引物10 pmol/μ I均O. 13 μ 1， 各探针10 pmol/μ I均O. 27 μ 1，取上述提取的DNA液4 μ 1，蚕微孢子虫、家蚕核型多角体病毒和家蚕浓核病毒的DNA浓度分别为2. 5 ng/ μ 1，用水补足体积至20 μ I ;应用荧光定量PCR仪Iightcycle 480进行反应，反应程序为(I) 95°C, 10 sec ； (2) 95°C,5 sec ；60°C,23 sec ；40 个循环；3)调用相应荧光补偿程序，进行荧光补偿，对结果进行判定；一般认为Ct值小于等于 35时，结果为阳性，Ct值大于等于40时，结果为阴性，Ct值介于35-40时，需要进行重复检测，若仍介于35-40，则判断为阳性，若大于等于40则判断为阴性。
9.根据权利要求8所述的蚕微孢子虫、家蚕核型多角体病毒和家蚕浓核病毒的三重荧光定量PCR检测方法，其特征在于荧光补偿反应程序参照Roche说明书，即(I) 95°C， 10 sec; (2) 95°C,5 sec ；60°C,23 sec ；40 个循环；(3) 95°C，10 sec ；40°C,30 sec ；95°C, continous ；40°C, I sec。
10.根据权利要求8所述的蚕微孢子虫、家蚕核型多角体病毒和家蚕浓核病毒的三重荧光定量PCR检测方法，其特征在于补偿反应时进行单重荧光反应，单重荧光反应体系如下10 μ I Premix Ex Taq,权利要求I所述的上游、下游引物10 pmol/ μ I各O. 4 μ I,权利要求I所述的探针10 pmol/μ 1，0.8 μ 1，取DNA I μ 1，蚕微孢子虫、家蚕核型多角体病毒和家蚕浓核病毒的的DNA含量分别为2. 5 ng/μ 1，用水补足体积至20 μ I。
全文摘要
本发明属于生物检测技术领域，涉及家蚕微孢子虫、家蚕核型多角体病毒和家蚕浓核病毒的三重荧光PCR检测方法及试剂盒和引物、探针。本发明分别设计了各自的引物和探针，并在3个探针上标记了不同的荧光信号，在优化了PCR反应体系的条件下，实现三重荧光定量PCR同步检测蚕微孢子虫、家蚕核型多角体病毒和家蚕浓核病毒。不仅可实现DNA同步提取，也可以进行荧光PCR同步检测，大大简化了检测方法，并通过荧光补偿的程序，有效地消除了因荧光信号的交集而引起的假阳性。该方法能快速、特异和灵敏的一次性鉴别检测蚕微孢子虫、家蚕核型多角体病毒和家蚕浓核病毒，可提高早期检出率，有效防止疾病的传播，减少经济损失。
文档编号G01N21/64GK102605106SQ20121008728
公开日2012年7月25日 申请日期2012年3月29日 优先权日2012年3月29日
发明者何永强, 余招锋, 吴珊, 帅江冰, 张晓峰, 戴云通, 李孝军, 王素华, 许赢升, 鲁兴萌, 黎昊雁 申请人:浙江省检验检疫科学技术研究院