专利名称：蚕微孢子虫SYBR Green荧光定量PCR检测方法及其试剂盒和特异性引物的制作方法
技术领域：
本发明涉及家蚕微孢子虫(Nosema bombycis,Nb)的检测方法，尤其涉及蚕微孢子 虫SYBR Green荧光定量PCR检测方法及其试剂盒和特异性引物。
背景技术：
家蚕微粒子病(Pebrine)是蚕业生产的毁灭性疫病，引起该病害的病原微生物为 家蚕微孢子虫(Nosema bombycis，简称Nb)。由于其特殊的经卵传染方式，对蚕业生产，尤 其是蚕种生产造成严重危害且长期得不到根治。法国、意大利等欧洲主要养蚕国家曾因该 病的暴发而导致蚕丝业的毁灭，我国近几年每年因微粒子病而淘汰的各级种达数百万张之 多，直接经济损失达数亿元之巨。该病害的广泛流行不但给蚕种生产单位造成严重的经济 损失，而且极易导致丝茧育蚕茧质量的下降和蚕农的歉收，严重影响蚕丝产业链下游经济 的发展，甚至给社会带来不稳定因素。鉴于此，家蚕微粒子病始终是蚕丝业国家蚕病防治和 进出口检疫的难点和重点。家蚕微粒子病的病原是蚕微孢子虫，蚕微粒子虫属原生动物界微孢子虫门、微 孢子虫纲、微孢子虫目、微孢子虫科、微孢子虫属。除了微孢子虫属，在家蚕体中还发现 有变形孢子虫属(Vairimorpha，Pilly，1976 ；佐藤令一和渡部仁，1985)具褶孢子虫属 (Pleistophora, Gy rley, 1893 ；藤原公，1985)、泰罗汉孢子虫属(Thelohania，Hennegy y, 1892)(早坂昭二，1985)、内网虫属(Endoretic μ Iat μ s，Beenel & Kennedy, 1988)以及与 Nb同属异种(田中茂男等，1972;万国富等，1995)的微孢子虫等寄生。到目前为止，已发现 上百种Nosema属的微孢子虫，它们大都是鳞翅目昆虫的典型寄生虫。据检查发现，包括家 蚕在内的大多数昆虫种类至少都受到一种以上的微孢子虫寄生，且从昆虫的卵到成虫的每 一阶段都可能被微孢子虫感染，家蚕微孢子虫可在蚕、蛹、蛾体内寄生，并能经蚕卵遗传给 下一代。该病在全国各蚕区不同季节都有不同程度的发生，对种茧育和丝茧育都有影响，给 农业生产带来巨大的损失。因此为了及早发现和剔除病蚕，有效避免该病的蔓延和传播，建 立一种针对家蚕微粒子病病原的快速准确检测方法是非常必要的。综观家蚕微孢子虫检测技术发展史，其采用了肉眼鉴定、显微镜检查、血清学检测 和分子生物学检测等几种方法。1865 1870年，法国的Pasteur创立的通过母蛾镜检制 造无毒蚕种的方法为家蚕微粒子病的防治奠定了基础，后来发展到集团袋蛾和集团磨蛾镜 检。目前蚕业生产中一般采用光学显微镜(明视野，或位相差)的方法，对所检样本是否存 在病原微孢子虫进行确认，该技术在大规模生产中为控制家蚕微粒子病的流行起到重要作 用。但该技术存在一些缺陷，其一是速度和效率问题；其二是检测技术的特异性和灵敏度方 面的问题；其三是无法区别和鉴定不同微孢子虫的种和属；其四是很难实现早期检测。血 清学鉴别法具有特异性强、灵敏度高的特点，但是存在比较高的交叉反应与非特异性反应。随着分子生物技术的发展，蚕微粒子病的分子生物学检测技术也开展探索研究。 有学者曾用PCR技术，利用家蚕微孢子DNA的高度保守序列，设计引物，对蚕微孢子虫进行定性PCR检测；也有学者为了将家蚕微孢子虫(Nb)从蚕业生产中流行的多种病原微孢子虫 中鉴定出来，用PCR技术合成了一段317bp的DNA片段，将其克隆到大肠杆菌E. coli DH5 α 中，并大量制备该片段，用地高辛(DIG)标记成特异性检测探针，用于蚕业生产上对带毒蚕 蛾和蚕卵的模拟检测。该种方法是有一定的创新性，但这仅仅是一个尝试，尚有许多需要完 善的地方。因此建立一种快速、特异、灵敏、简便、实用的家蚕微粒子病的检测方法，对提高 家蚕微粒子病监控技术，加强检疫能力，保证进出口蚕种的安全，提升养蚕的产业水平非常 迫切，具有十分重要的现实意义。SYBR Green荧光定量PCR技术的原理是在常规PCR扩增系统中加入SYBR Green I染料。SYBR Green I是一种结合于双链DNA小沟中的染料，与双链DNA结合后，其荧光大 大增强。SYBR Green I的最大吸收波长约为497nm，最大发射波长约为520nm。在PCR反应 体系中，加入过量SYBR荧光染料，SYBR荧光染料特异性地掺入DNA双链后，发射荧光信号， 而不掺入链中的SYBR染料分子不会发射任何荧光信号，从而随着PCR循环扩增的进行，保 证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步。信号增强到某一阈值时的循环次数(用循 环阈值Ct表示)被记录下来。Ct值和PCR体系中起始模板的对数之间有着严格的线性关 系，利用阳性定量标准品扩增的Ct和标准曲线，再根据待测样品的Ct值就可以准确定出起 始模板中某核酸的存在及其数量。利用该技术的原理，我们发明了一种用于家蚕微孢子虫检测的SYBR Green荧光定 量PCR方法，并研发了 “蚕微孢子虫SYBR Green荧光定量PCR检测方法及其试剂盒”，实现 了对蚕微孢子虫的快速准确检测的目的。由于该方法引入了特异性扩增引物和SYBR Green Buffer体系，使得微孢子虫检测的灵敏度和特异性得到很大程度的增强，并避免了漏检和 误检。
发明内容
本发明为了解决蚕微孢子虫检测中遇到的技术问题，本发明的第一个目的是提供 蚕微孢子虫SYBR Green荧光定量PCR检测方法，该方法使得微孢子虫检测的灵敏度和特异 性得到很大程度的增强，并避免了漏检和误检。本发明的第二个目的是提供用于蚕微孢子虫SYBR Green荧光定量PCR检测的特 异性引物序列。本发明的第三个目的是提供用于蚕微孢子虫SYBR Green荧光定量PCR检测的试剂盒。为了实现上述的第一个目的，本发明采用了以下的技术方案蚕微孢子虫SYBR Green荧光定量PCR检测方法，其特征在于该方法通过从样本 中提取蚕微孢子虫DNA，采用SYBR Green荧光定量PCR扩增法对样本进行检测，扩增反应结 束后根据每个扩增反应的荧光强度对相应样本进行分析，从而判断所采集的样本中蚕微孢 子虫的存在，并根据阳性标准品对其进行定量；所述的SYBR Green荧光定量PCR扩增法利 用SYBR Green I荧光染料，检测的特异性基因为小亚单位核糖体RNA，SEQ ID NO. 1所示的 基因；设计的特异性引物序列为上游引物5，-GGAAAGAAGAAAGGCCCAAG-3，；下游引物5，-ATCTTCCAGCGTCGTTGATT-3，。
上述的方法适用仪器包括ABI PRISM 7000/7700/7900HT, 7300/7500Real-Time PCR System, ABI PRISM 7500 Fast Real-Time PCR System 和 LightCycler 等。使用ABI PRISM 7000/7700/7900HT 或 7300/7500Real_Time PCR System 仪器时， 扩增条件为95°C— 30秒，然后95°C 5秒一45°C 33秒，采集荧光信号，40个循环，融解曲线 制作 95°C— 15 秒，60°C 1 分钟，95°C— 15 秒。使用ABIPRISM 7500 Fast Real-Time PCR System仪器时，扩增条件为95°C—30 秒，然后95°C 3秒一45°C 25秒，采集荧光信号，40个循环，融解曲线制作95°C— 15秒， 600C 1 分钟，95°C— 15 秒。使用LightCycler等毛细管的仪器时，扩增条件为95°C— 30秒，然后95 V 5秒 -450C 20秒，检测荧光信号，共40个循环，最后融解曲线制作95°C— 1秒，65°C 15秒， 95°C— 1秒，以0. 20C /秒速率降至40°C。作为优选，上述的微孢子虫DNA的提取方法如下取样品加适量生理盐水研磨， 勻浆液用纱网过滤，收集滤液，以差速离心法，500rpm，离心2分钟，弃沉淀，然后上清液以 5000rpm, 10分钟离心，弃上清，差速离心至沉淀呈灰白色，用适量生理盐水悬浮，得到Nb孢 子粗提液；取0. 5ml, IO8个/ml微孢子虫悬浮液，5000rmp,离心5分钟，去上清，保留孢子， 同时加入0. 2mol/L Κ0Η0. 25ml，充分混合，27°C诱导1小时后5000rpm，离心5分钟，去上 清；用0. 5ml生理盐水重悬，25°C放置30分钟；5000rpm，离心5分钟，沉淀加50 μ 1核酸提 取液充分混勻后100°C沸水浴10分钟，13，OOOrpm离心3分钟，上清液即为提取的微孢子虫 DNA。为了完成本发明的检测方法首先采集标本，适用标本类型有家蚕、蚕卵和蚕粪等。为了实现上述的第二个目的，本发明采用了以下的技术方案用于蚕微孢子虫SYBR Green荧光定量PCR检测的特异性引物序列，该序列为上 游引物5’ -GGAAAGAAGAAAGGCCCAAG-3，；下游引物5’ -ATCTTCCAGCGTCGTTGATT-3，。为了实现上述的第三个目的，本发明采用了以下的技术方案用于蚕微孢子虫SYBR Green荧光定量PCR检测的试剂盒，该试剂盒包括 核酸提取液、Nb-PCR MIX、阳性标准品和阴性标准品；所述的Nb-PCR MIX是蚕微孢 子虫检测的扩增反应液，其包括上游引物5 ’ -GGAAAGAAGAAAGGCCCAAG-3 ’，下游引物 5’ -ATCTTCCAGCGTCGTTGATT-3’。作为优选，上述的每个Nb-PCR MIX检测单位由10μ1 2 X SYBR Premix Ex Taq、
0.4μ 1 ROX Reference Dye II，0. 4 μ 1 上游引物(10 μ Μ)、0· 4 μ 1 下游引物(10 μ Μ)、 6.8μ 1 ddH20组成；一个检测单位中，取Nb-PCR ΜΙΧ18 μ 1，加入DNA模板2 μ 1，检测体积为 20μ 1。上述用于检测微孢子虫的反应体系中的2XSYBR Premix Ex Taq和ROX Reference Dye II由TaKaRa宝生物工程(大连)有限公司提供。作为优选，上述的核酸提取液由25mM NaOH、5OmMTris-HCl (pH8. 0)、0. 1 % TritonX-100,0. 05mM EDTA(pH8. 0)组成。作为优选，上述的阳性标准品为蚕微孢子虫小亚单位核糖体RNA基因特异性扩增 片段，经过克隆连接到T载体上，构成的重组质粒。稀释阳性标准品(107copies/ml)，浓度梯度为每ml 1.0X IO6、1.0X 105、
1.OX 104、1. OX 103、1. OX 102、1. OX IO1c0Pies,进行灵敏度实验，结果证实本试剂盒检测灵敏度为1. OX 102COpieS/ml，该荧光定量PCR的方法敏感性和精确性优于普通PCR方法。本发明利用了 SYBR Green荧光技术的原理，实现了对蚕微孢子虫的快速准确检测 的目的。由于该方法引入了特异性扩增引物和SYBR Green Buffer体系，使得微孢子虫检 测的灵敏度和特异性得到很大程度的增强，并避免了漏检和误检。用大量已知家蚕微孢子 虫感染的阳性标本和未感染的阴性标本进行比对实验并对产物进行测序验证，结果证实， 本试剂盒特异性较好，吻合度为100%。本发明的试剂盒经过多次不同的重复实验证实，具 有良好的重复性和稳定性。在-20°C条件下试剂盒的有效期可以达12个月。
图1显示常规PCR扩增特异性片段，2%的琼脂糖凝胶电泳，经PCR扩增后，其扩增 产物经2%的琼脂糖凝胶电泳在紫外灯下观察，可看到与目的片段大小一致的电泳条带，从 左到右依次是DNA分子量Marker (IOObp DNA Ladder Marker)、蚕微孢子小亚单位核糖体 RNA的特异性扩增片段和阴性对照普通PCR的扩增的结果。图2显示阳性标准品扩增动力曲线，梯度稀释。图3为阳性标准品标准曲线。
具体实施例方式实施例1 标本采集适用标本类型包括家蚕、蚕卵及粪便等样本。从现场取适量家蚕、蚕卵或粪便等疑 似病料，密闭、标记、尽快或短期冷藏保存后送检。实施例2 蚕微孢子虫DNA的提取取上述标本加适量生理盐水研磨，勻浆液用纱网过滤，收集滤液，以差速离心法 (500rpm,离心2分钟，弃沉淀，然后上清液以5000rpm，10分钟离心)弃上清，差速离心至 沉淀呈灰白色，用适量生理盐水悬浮，得到Nb孢子粗提液。取0. 5ml (IO8个/ml)微孢子 虫悬浮液，5000rmp，离心5分钟，去上清，保留孢子，同时加入0. 2mol/L KOH 0. 25ml，充分 混合，27°C诱导1小时后5000rpm，离心5分钟，去上清。用0. 5ml生理盐水重悬，25°C放置 30分钟。5000rpm，离心5分钟，沉淀加50 μ 1核酸提取液充分混勻后100°C沸水浴10分 钟，13，OOOrpm离心3分钟，上清液即为提取的微孢子虫DNA。核酸提取液由25mM NaOH, 50mMTris-HCl (PH8. 0)、0· 1% TritonX_100、0· 05mM EDTA(PH8. 0)组成。实施例3 蚕微孢子虫DNA的扩增从试剂盒取出Nb-PCR MIX,室温融化并振荡混勻后，10，OOOrpm离心10 秒。每个 Nb-PCR MIX 检测单位由 10μ1 2 X SYBR Premix Ex Taq,0. 4 μ 1 ROX ReferenceDyeII, 0. 4 μ 1 上游引物(10μΜ)、0·4μ 1 下游弓丨物(10μΜ)、6·8μ 1 ddH20 组成。上游引物的序列如下5 ’ -GGAAAGAAGAAAGGCCCAAG-3 ’，下游引物的序列如下 5’ -ATCTTCCAGCGTCGTTGATT-3’。上述用于检测微孢子虫的反应体系中的2XSYBR Premix Ex Taq和ROX Reference Dye II由TaKaRa宝生物工程(大连)有限公司提供。每个测试反应体系配制如下，Nb-PCR MIX 18 μ 1放入洁净0. 2mlPCR管中，向 设定的PCR反应管中分别加入处理后样品(提取的DNA)或阳性标准品或阴性标准品 2 μ 1，10，OOOrpm瞬时离心10秒。其中所说的阳性标准品是蚕微孢子虫小亚单位核糖体RNA (Nosema sp. small subunit ribosomal RNA, ssUr RNA)基因特异性扩增片段，经过克 隆连接到T载体上，构成的重组质粒，经过绝对定量，其浓度为107COpieS/ml。ssUr RNA普 通PCR的扩增结果见图1。对阳性标准品进行梯度稀释，其扩增的标准曲线和动力学曲线如 图2禾口 3。将各反应管放入定量PCR仪器的反应槽内，设置各检测的名称、荧光种类(SYBR Green)和循环条件使用ABI PRISM 7000/7700/7900HT, 7300/7500Real-Time PCR System时，扩增条 件为95°C— 30秒，然后95°C 5秒一45°C 33秒，采集荧光信号，40个循环，增加融解曲线 制作；使用 ABI PRISM 7500 Fast Real-Time PCR System 时，扩增条件为 95°C—30 秒，然 后95°C3秒一45°C25秒，采集荧光信号，40个循环，增加融解曲线制作；使用LightCycler 等毛细管的仪器扩增条件为95°C— 30秒，然后95°C 5秒一45°C 20秒，检测荧光信号，共 40个循环，最后融解曲线制作95°C— 1秒，65°C 15秒，95°C— 1秒，以0. 2V /秒速率降至 40 "C。实施例4 结果分析和判定反应结束后，计算融解温度，并使用手动调整阈值使阴性标准品扩增反应的Ct值 在40以上；样品Ct值小于35个循环，呈S型扩增曲线且融解温度和阳性对照一致的为阳 性；Ct值在35-40个循环之间为灰区，需要进行重复试验。重复试验之后，如果Ct值仍然 在35-40个循环之间且融解温度和阳性对照一致的判断为阳性，没有荧光值增长或有荧光 值增长但融解温度和阳性对照不一致的为阴性。判断结果时需要满足阴性标准品应全部 为阴性；Nb阳性标准品的Ct值均应小于30，且呈标准S型扩增曲线。否则此次试验视为无 效，全部试验应重新进行。
权利要求
蚕微孢子虫SYBR Green荧光定量PCR检测方法，其特征在于该方法通过从样本中提取蚕微孢子虫DNA，采用SYBR Green荧光定量PCR扩增法对样本进行检测，扩增反应结束后根据每个扩增反应的荧光强度对相应样本进行分析，从而判断所采集的样本中蚕微孢子虫的存在，并根据阳性标准品对其进行定量；所述的SYBR Green荧光定量PCR扩增法利用SYBR Green I荧光染料，检测的特异性基因为小亚单位核糖体RNA，SEQ ID N0.1所示的基因；设计的特异性引物序列为上游引物5’ GGAAAGAAGAAAGGCCCAAG 3’；下游引物5’ ATCTTCCAGCGTCGTTGATT 3’。
2.根据权利要求1所述的蚕微孢子虫SYBRGreen荧光定量PCR检测方法，其特征在 于使用 ABI PRISM 7000/7700/7900HT 或 7300/7500Real-Time PCRSystem 仪器时，扩增 条件为95°C— 30秒，然后95°C 5秒一45°C 33秒，采集荧光信号，40个循环，融解曲线制作 95°C— 15 秒，60°C 1 分钟，95°C— 15 秒。
3.根据权利要求1所述的蚕微孢子虫SYBRGreen荧光定量PCR检测方法，其特征在 于使用 ABI PRISM 7500Fast Real-Time PCR System 仪器时，扩增条件为 95°C—30 秒， 然后95°C 3秒一45°C 25秒，采集荧光信号，40个循环，融解曲线制作95°C— 15秒，60°C 1 分钟，95°C— 15秒。
4.根据权利要求1所述的蚕微孢子虫SYBRGreen荧光定量PCR检测方法，其特征 在于使用LightCycler等毛细管的仪器时，扩增条件为95 °C — 30秒，然后95 °C 5秒 -450C 20秒，检测荧光信号，共40个循环，最后融解曲线制作95°C— 1秒，65°C 15秒， 95°C— 1秒，以0. 20C /秒速率降至40°C。
5.根据权利要求1 4任意一项权利要求所述的蚕微孢子虫SYBRGreen荧光定量PCR 检测方法，其特征在于取样品加适量生理盐水研磨，勻浆液用纱网过滤，收集滤液，以差速 离心法，500rpm，离心2分钟，弃沉淀，然后上清液以5000rpm，10分钟离心，弃上清，差速离 心至沉淀呈灰白色，用适量生理盐水悬浮，得到Nb孢子粗提液；取0. 5ml, IO8个/ml微孢子 虫悬浮液，5000rmp，离心5分钟，去上清，保留孢子，同时加入0. 2mol/L KOH 0. 25ml，充分 混合，27°C诱导1小时后5000rpm，离心5分钟，去上清；用0. 5ml生理盐水重悬，25°C放置 30分钟；5000rpm，离心5分钟，沉淀加50 μ 1核酸提取液充分混勻后100°C沸水浴10分钟， 13，OOOrpm离心3分钟，上清液即为提取的微孢子虫DNA。
6.用于蚕微孢子虫SYBRGreen荧光定量PCR检测的试剂盒，其特征在于该试剂 盒包括核酸提取液、Nb-PCR MIX、阳性质控品和阴性质控品；所述的Nb-PCR MIX是蚕微 孢子虫检测的扩增反应液，其包括上游引物5 ’ -GGAAAGAAGAAAGGCCCAAG-3 ’，下游引物 5’ -ATCTTCCAGCGTCGTTGATT-3’。
7.根据权利要求6所述的用于蚕微孢子虫SYBRGreen荧光定量PCR检测的试剂盒， 其特征在于核酸提取液由 25mM Na0H、50mMTris-HCl (pH8. 0)、0. 1% TritonX_100、0. 05mM EDTA (pH8. 0)组成。
8.根据权利要求6所述的用于蚕微孢子虫SYBRGreen荧光定量PCR检测的试剂盒， 其特征在于每个 Nb-PCR MIX 检测单位由 10μ1 2 X SYBR Premix Ex Taq,0. 4 μ 1 ROX Reference Dye II，0· 4 μ 1 上游引物(10 μ Μ)、0· 4 μ 1 下游引物(10 μ Μ)、6· 8 μ 1 ddH20 组 成；一个检测单位中，取Nb-PCR ΜΙΧ18μ 1，加入DNA模板2μ 1，检测体积为20 μ 1。
9.根据权利要求6所述的用于蚕微孢子虫SYBRGreen荧光定量PCR检测的试剂盒，其 特征在于阳性标准品为蚕微孢子虫小亚单位核糖体RNA基因特异性扩增片段，经过克隆 连接到T载体上，构成的重组质粒。
10.用于蚕微孢子虫SYBRGreen荧光定量PCR检测的特异性引物序列，其特征在于该 序列为上游引物5，-GGAAAGAAGAAAGGCCCAAG-3，； 下游引物5’ -ATCTTCCAGCGTCGTTGATT-3，。
全文摘要
本发明涉及家蚕微孢子虫(Nosema bombycis，Nb)的检测方法，尤其涉及蚕微孢子虫SYBR Green荧光定量PCR检测方法及其试剂盒和特异性引物。蚕微孢子虫SYBR Green荧光定量PCR检测方法，该方法包括(1)采集样本；(2)家蚕微孢子虫DNA的提取；(3)SYBR Green荧光定量PCR扩增法对样本进行检测；(4)扩增反应结束后根据反应的荧光强度对相应样本进行分析，从而判断所采集的样本中家蚕微孢子虫的存在，并能对其进行准确定量，实现了对家蚕微孢子虫的实时快速检测。由于该方法引入了特异性扩增引物和SYBR Green Buffer体系，使得微孢子虫检测的灵敏度和特异性得到很大程度的增强，并避免了漏检和误检。
文档编号G01N21/64GK101935707SQ20101027222
公开日2011年1月5日 申请日期2010年9月3日 优先权日2010年9月3日
发明者何永强, 吴姗, 帅江冰, 张晓峰, 徐国群, 王素华, 董强, 许赢升, 陈 胜, 鲁兴萌, 黎昊雁 申请人:浙江省检验检疫科学技术研究院