一种用于我国养殖与野生三疣梭子蟹微孢子虫感染早期预警的套式引物及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于三疣梭子蟹疾病防治领域，特别涉及一种用于我国养殖与野生三疣梭 子蟹微孢子虫感染早期预警的套式引物及其应用。
【背景技术】
[0002] 三疣梭子蟹是我国重要的渔业生产对象，也是重要的高经济价值水产养殖品种， 然而近年来"牙膏病"的流行对三疣梭子蟹养殖业造成了巨大威胁。本实验室通过病理学 和分子生物学等方法证明了其病原为一种微孢子虫。三琉梭子蟹微孢子虫病虽然发病较为 缓慢，但是传染性很强。该病初期感染特征较为隐蔽，在培育中后期才表现典型症状，病蟹 丧失经济价值，经济损失很大。因此，建立三疣梭子蟹微孢子虫的早期诊断技术，对于养殖 三疣梭子蟹"牙膏病"的防治和预警均具有重要的现实意义。
[0003] 目前我国三疣梭子蟹育苗在很大程度上仍然依赖海捕的野生三疣梭子蟹。由于微 孢子虫的传播方式是垂直传播和水平传播共存，如果野生亲蟹携带微孢子虫，则不仅导致 出苗率下降，还极易垂直传播给子代，导致子代育成率下降，或终身带毒，生长速度下降，发 生"牙膏样"病变的则经济价值丧失，因此，野生亲蟹微孢子虫微量感染的早期诊断尤其重 要。分子PCR诊断技术由于快速、简便、样品组织需要量小，因而，适于三疣梭子蟹尤其是亲 蟹和蟹苗微孢子虫微量感染的快速诊断。但是，还未见到关于我国野生三疣梭子蟹微孢子 虫流行种的鉴定和序列分析的报道，也没有针对我国养殖与野生微孢子虫流行种特异的分 子检测技术。
[0004] 由于微孢子虫是细胞内寄生生物，还具有坚硬的几丁质外壳，不仅影响DNA的提 取效率，而且容易出现较短的片段，因此，国内外基于通用引物（扩增长片段）的微孢子虫 的检出率比细菌、病毒等病原的检出率要低许多，定量PCR技术虽然灵敏度有一定提高，但 是检测成本大幅提高，而且对仪器要求较高。套式PCR技术通过设计内、外两对嵌套引物进 行两轮扩增，痕量的模板DNA被富集、扩增到可以检测的量，放大效率极高，且因为两对引 物扩增的目的基因是嵌套的，扩增的特异性大大增强，达到高灵敏度、高特异性扩增目的基 因的目的。该法与单对引物的普通PCR相比效率高出很多，与荧光定量PCR相比又相对简 单易行且成本低廉。
【发明内容】
[0005] 本发明所要解决的技术问题是提供一种用于我国养殖与野生三疣梭子蟹微孢子 虫感染早期预警的套式引物及其应用，该套式引物检测灵敏度很高且特异性好，比通用引 物有大幅提高，适用于从微孢子虫微量或潜伏感染的蟹的肌肉组织等样品中早期检测三疣 梭子蟹微孢子虫，可在三疣梭子蟹微孢子虫的分子检测和疾病预警中应用，具有良好的应 用前景。
[0006] 本发明的一种用于我国养殖与野生三疣梭子蟹微孢子虫感染早期预警的套式引 物，所述套式引物包括一对外引物MI1F/MI545R和一对内引物MI230F/MI426R，具体序列如 下：
[0007] MIlF ：TGGCGACCAGTTCTAAG ；
[0008] MI545R ：AAGCCGAACAATCCACA ；
[0009] MI230F ：CARATAGATAGGGGCAGTAGC ；
[0010] MI426R ：ATCGGTCACTGCTAGAACTAC〇
[0011] 所述外引物MI1F/MI545R的扩增片段长度为545bp。
[0012] 所述内引物MI230F/MI426R的扩增片段长度为197bp。
[0013] 本发明的一种用于我国养殖与野生三疣梭子蟹微孢子虫感染早期预警的套式引 物的应用，所述套式引物应用于我国三疣梭子蟹微孢子虫的分子检测和疾病预警。
[0014] 经过普通与超微病理分析以及基于通用引物的广泛的流行病学调查表明，感染我 国养殖和野生三疣梭子蟹的微孢子虫为同一个种，具有完全相同的SSU rRNA基因序列，但 是该序列与已知的最为接近的微孢子虫序列也存在较多的碱基差异。据此，本发明设计了 一套基于我国三疣梭子蟹微孢子虫种特异序列的、养殖与野生蟹均适用的、较短的套式引 物。
[0015] 有益效果
[0016] 本发明检测灵敏度很高且特异性好，比通用引物有大幅提高，适用于从微孢子虫 微量或潜伏感染的蟹的肌肉组织等样品中早期检测三疣梭子蟹微孢子虫，可在我国三疣梭 子蟹微孢子虫的分子检测和疾病预警中应用，具有良好的应用前景。
【附图说明】
[0017] 图1为本发明的套式引物对野生三疣梭子蟹肌肉中微孢子虫的扩增结果。
【具体实施方式】
[0018] 下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明 而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人 员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定 的范围。
[0019] 实施例1
[0020] 分别应用微孢子虫通用引物（V1F/1492R)和套式引物（MI1F/MI545R和MI230F/ MI426R)对76份野生三疣梭子蟹样品肌肉DNA模板进行PCR扩增试验。
[0021] 通用引物（V1F/1492R)扩增体系和条件：扩增体系共25yL，由I yL组织DNA模 板、I UL 正向引物 VlF(10yM)、l yL 反向引物 1492R(10yM)、12. 5yL 2X GoTaq? Green Master Mix(promega)和 9.5以1^无0嫩酶水组成。扩增条件为：94°0 5111；[11，然后94°0 458， 45°C 35s，72°C 90s循环32次，最后72°C延伸lOmin。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳，紫外 凝胶成像仪观察结果。
[0022] 套式引物外引物（MI 1F/MI545R)扩增体系和条件：扩增体系共25 μ L，由I yL组 织〇嫩模板、0.5以1^正向外引物肌卟（1(^]\〇、0.5 41^反向外引物肌5451?(1(^]\〇、12.5 41^ 2\0〇丁&9@6代611]\^8丨61]\^1&1'〇111683)和10.5以1^无0嫩酶水组成。扩增条件为：95°〇 预变性 5min，然后 95°C 45s，47°C 35s，72°C，40s 循环 25 次，最后 72°C延伸 5min。PCR 产物 一部分用作内引物模板，一部分经I %琼脂糖凝胶电泳，紫外凝胶成像仪观察结果。
[0023] 套式引物内引物（MI230F/MI426R)扩增体系和条件：扩增体系共25 μ L，由 I UL外引物扩增的PCR产物、0. 3yL正向内引物MI230F(10yM)、0. 3yL反向内引物 MI426R(10yM)、12.5yL 2X GoTaq?Green Master Mix(promega)和 10.9yL无 DNA 酶 水组成。扩增条件为：95°C预变性5min，然后95°C 35s，50°C 30s，72°C 20s循环20次，最后 72 °C延伸5min。PCR产物经1 %琼脂糖凝胶电泳，紫外凝胶成像仪观察结果。
[0024] 图1为其中20份样品的套式引物扩增结果。从电泳图可以看出，套式引物扩增的 条带明亮而单一，无杂带，特异性好。阳性结果经测序验证均为三疣梭子蟹微孢子虫。通用 弓丨物和外引物以及套式引物对所有野生三疣梭子蟹样品的检测结果比较见表1。
[0025] 检测结果说明：1、野生三疣梭子蟹中微孢子虫含量极低，但是感染率较高，显示了 建立特异而高度灵敏的微孢子虫检测技术的必要性；2、套式引物（MI1F/MI545R和MI230F/ MI426R)的特异性好且检测灵敏度比通用引物大幅提高，适用于我国养殖和野生三疣梭子 蟹微孢子虫微量感染或潜伏感染的早期监测和预警。
[0026] 表1不同引物对76份野生三疣梭子蟹样品中微孢子虫的扩增结果
【主权项】
1. 一种用于我国养殖与野生三疣梭子蟹微孢子虫感染早期预警的套式引物，其特征在 于：所述套式引物包括一对外引物MI1F/MI545R和一对内引物MI230F/MI426R，具体序列如 下： MIlF ：TGGCGACCAGTTCTAAG ； MI545R ：AAGCCGAACAATCCACA ； MI230F ：CARATAGATAGGGGCAGTAGC ； MI426R ：ATCGGTCACTGCTAGAACTAC〇2. 根据权利要求1所述的一种用于我国养殖与野生三疣梭子蟹微孢子虫感染早期预 警的套式引物，其特征在于：所述外引物MI1F/MI545R的扩增片段长度为545bp。3. 根据权利要求1所述的一种用于我国养殖与野生三疣梭子蟹微孢子虫感染早期预 警的套式引物，其特征在于：所述内引物MI230F/MI426R的扩增片段长度为197bp。4. 一种如权利要求1所述的用于我国养殖与野生三疣梭子蟹微孢子虫感染早期预警 的套式引物的应用，其特征在于：所述套式引物应用于我国三疣梭子蟹微孢子虫的分子检 测和疾病预警。
【专利摘要】本发明涉及一种用于我国养殖与野生三疣梭子蟹微孢子虫感染早期预警的套式引物及其应用，所述套式引物包括一对外引物MI1F/MI545R和一对内引物MI230F/MI426R，具体序列如下：MI1F：TGGCGACCAGTTCTAAG；MI545R：AAGCCGAACAATCCACA；MI230F：CARATAGATAGGGGCAGTAGC；MI426R：ATCGGTCACTGCTAGAACTAC。本发明检测灵敏度很高且特异性好，比通用引物有大幅提高，适用于从微孢子虫微量或潜伏感染的蟹的肌肉组织等样品中早期检测三疣梭子蟹微孢子虫，可在我国三疣梭子蟹微孢子虫的分子检测和疾病预警中应用，具有良好的应用前景。
【IPC分类】C12Q1/04, C12N15/11, C12R1/90, C12Q1/68
【公开号】CN104946747
【申请号】CN201510289724
【发明人】周俊芳, 房文红, 王浩, 王元, 周红霞
【申请人】中国水产科学研究院东海水产研究所
【公开日】2015年9月30日
【申请日】2015年5月29日