一种利用dna条形码鉴别茶树品种的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及茶树品种的鉴别方法。
【背景技术】
[0002] 我国目前已选育了 114个国家级良种和154个省级良种，如何对这些品种进行准 确鉴定对育种者权益保护和新品种推广等具有重要意义。茶树新品种DUS(特异性、一致 性、稳定性的简称）测试指南是中国为国际植物新品种保护联盟（UPOV)制订的第一个植物 新品种DUS测试指南，它的制定为我国茶树资源评价和保护提供了技术基础和授权依据。 随着分子标记技术不断发展，UPOV已将DNA标记鉴定纳入农作物品种DUS测试内容。DNA 分子标记技术不仅具有稳定性、品种间变异的可识别性、最小品种内变异及实验结果的可 靠性，而且具有简便、迅速等优点，非常适合品种鉴定，克服了传统形态标记鉴定周期长、误 差大、性状差异小的缺点。国际植物品种权保护联盟（UPOV)在BMT测试指南草案中已将构 建DNA指纹数据库的标记方法确定为SSR和SNP。而SSR标记因引物开发廉价、操作简单、 易于推广，已被UPOV生物化学和分子技术工作组验证为植物新品种保护最广泛应用的标 记体系。UPOV虽已将作物SSR标记鉴定纳入农作物品种DUS测试内容，但对不同作物的测 试流程及具体方法却没有明确的规定。
【发明内容】
[0003] 针对目前依靠茶树植物学性状对茶树品种进行鉴定周期长、误差大、鉴定性状差 异小品种困难大、对鉴定者经验要求丰富等问题，本发明提供了一种简单、快速、准确利用 DNA条形码鉴别茶树品种的方法。
[0004] 本发明解决上述技术问题采用的技术方案是：一种利用DNA条形码鉴别茶树品种 的方法，包括以下步骤：
[0005] (I) DNA提取：分别提取数个茶树品种的DNA ;
[0006] (2)引物筛选：筛选条带清晰、稳定且重复性好的数对SSR引物；
[0007] (3) PCR扩增：将上述提取的DNA中的每个DNA分别与每对筛选的SSR引物混合配 成PCR反应试剂进行扩增；
[0008] (4) SSR标记的PCR产物分析：将每一 PCR反应产物进行凝胶电泳后染色，然后采 用凝胶成像仪拍照记录；
[0009] (5)分子条形码的构建：将上述记录的每对SSR引物上的每一个品种的电泳图上 清晰的条带记为"1"，同一位置无带或不易分辨的弱带计为"〇"，建立原始数据库；然后把 每对SSR引物上每一个品种位点的1、0数据转换为字母；再将数对SSR引物上对应品种转 换的字母进行组合，形成每一个品种的DNA条形码；
[0010] (6)鉴别：以上述DNA条形码为标准鉴别茶树品种的真伪。
[0011] 作为优选，采用试剂盒法提取DNA。
[0012] 作为优选，筛选出
[0013] F:CTCCGATTACTTTCTTCC
[0014] R:GCAGGTTAGCGGTGGTTA ;
[0015] F:TAGGGTTTTAGTTTCAG
[0016] R:AACATCCTTGCCTCGTC ;
[0017] F:GTGAAGTTAGTTGTTACTCTTTTTTGG
[0018] RiAGGGGAAGTGAGGAGGCAT ；
[0019] F:ATGCTTCAGGGAGTGACCAT
[0020] R:ATTTATGCCAAACTACCAACAG
[0021] 四对SSR引物。
[0022] 作为优选，每一 PCR反应试剂按体积份数6. 65份ddH20、I. 0份IOng/ μ L的上述 提取的一个品种的 DNA、1. 0 份 10XBuffer、0. 7 份 25mM 的 Mg2+、0. 2 份 IOmM 的 dNTP、各 0. 1 份 10 μ M 的 primers 和 0· 25 份 2U/ μ L 的 Taq polymerase 混合配成而成。
[0023] 作为优选，PCR扩增条件为94°C变性3min，然后94°C变性30s，53°C退火30s，72°C 延伸50s，共30个循环，完成以上循环以后，72°C延伸IOmin，最后将PCR产物冷却到室温或 者 4。。。
[0024] 作为优选，上述PCR扩增重复一次，比较两次扩增结果，如果两次结果不一致，PCR 扩增再重复一次，以有两次扩增一致的结果为准。
[0025] 作为优选，将PCR产物与6Xloading buffer混合，采用10%的聚丙稀酰胺凝胶电 泳，电泳后进行硝酸银染色，直到有清晰条带出现为止。
[0026] 作为优选，硝酸银染色的步骤为：①用10%乙醇和0. 5%乙酸固定5~8min ;②用 10%乙醇和0. 5%乙酸再次固定5~8min ;③用0. 2% AgNO3染色10~15min ;④用蒸馏水 冲洗数秒；⑤用I. 5% NaOH和0. 5%甲醛显色。
[0027] 作为优选，1、0数据转换为字母的规则为：①有2个位点，按位点的大小只有第一 个位点的编码为A ;只有第二个位点的编码为B ;两个位点都有的编码为C ;两个位点都没 的有编码为N ;②有3个位点，只有1个位点的按大小依次编码为A、B、C ;只有2个位点的， 按位点组合依次编码为D、E、F ;三个位点都有的编码为G ;如果三个位点都没有编码为N ; ③有4个位点，只有1个位点的按大小依次编码为A、B、C、D ;只有2个位点则编码字母从E 开始，按位点组合依次编码为E、F、G、H、I、J ;只有3个位点的按位点组合从K开始依次编 码为K、L ;4个位点都有的编码为M，4个位点都没有的编码为N。
[0028] 从以上技术方案可知，本发明利用分子标记技术，通过基因组DNA提取、标记筛 选、PCR扩增、产物分析、条带数据读取和字母条形码的建立等技术组合，建立了一种DNA条 形码鉴别茶树品种的方法，该方法与传统形态学鉴定方法相比，不受环境条件影响，方法简 单、快速、准确，可对茶树品种的真实性进行准确鉴定。
【附图说明】
[0029] 图1是引物234的扩增结果图。
[0030] 图2是引物685的扩增结果图。
[0031] 图3是引物A58的扩增结果图。
[0032] 图4是引物A142的扩增结果图。
【具体实施方式】
[0033] 下面结合附图详细介绍本发明：
[0034] 本发明用槠叶齐、湘波绿2号、福鼎大白茶、玉绿和尖波黄13号共5个品种来做测 试样品。首先，DNA提取方法按照试剂盒提供的步骤进行，最后溶解DNA到IOOul。Nanodrop 检测DNA浓度，DNA的浓度用重蒸水稀释到10-20ng/ul的浓度。
[0035] 接着，筛选条带清晰、稳定且重复性好的4对SSR引物，具体引物信息如下表1。
[0037] 表1筛选的引物信息
[0038] 然后，按照表2的试剂配方，先将除DNA之外的其它6种试剂进行混合，混合时Taq polymerase最后加入，然后分装成5份分别加入20ulPCR试管中，最后在每个管试中分别加 入 lulDNA。
[0041] 表2 IOuIPCR反应体系试剂配方
[0042] 将上述试管置于PCR仪中进行扩展，扩展程序为：94°C变性3min，94°C变性30s， 53°C退火30s，72°C延伸50s，共30个循环，完成以上循环以后，72°C延伸lOmin，最后将PCR 产物冷却到室温或者4°C。从PCR仪取出以后进行分析。产物的分析为聚丙烯酰胺凝胶电 泳：移取4ul的PCR产物混合Iul 6 X loading