专利名称：白化茶树品种“洒金”特异dna分子标记及其鉴定方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，涉及茶树品种的生物技术鉴定，具体为一种光照诱导型白化茶树品种“洒金”特异DNA分子标记及品种“洒金”的鉴定方法，亦属于茶树遗传育种领域的应用技术。
背景技术：
名优茶生产目前已成为我国茶产业的主要经济效益来源。据统计，我国名优茶产量约占总产量的30％，但产值已达到总产值的70％左右；名优茶主要产区浙江省甚至达到90％。名优茶的生产取决于茶树优良品种推广和加工技术，其中品种起决定性作用。茶树品种新资源的开发利用，可以为名优茶产业注入新活力。
白茶品种新梢具有白化现象，其叶片中的氨基酸含量(尤其是茶氨酸)比普通品种高2倍以上，使茶叶滋味特别鲜爽，而且，目前茶氨酸已经被证明具有增强免疫力、降血压、促进大脑功能和预防帕金森氏症等功效，再加上目前资源稀少，售价非常的高。白茶品种的开发和利用，对名优茶的发展和茶叶功能性成分的开发利用都具有重要的意义。
白茶有两种类型，一种是在较低温度下出现白化的白茶，如“白叶茶1号”茶树品种。另一种是在强光照条件下产生白化的白茶品种，如“洒金”。“洒金”在夏季高温、强光时，其新梢叶片呈现白色或黄色，且其白化期间氨基酸含量最高可达7-10％。由于该品种可以克服普通茶树品种在夏季由于高温和强光的作用下产生苦涩味，所以在夏秋季节同样能生产优质的名优绿茶，推广该品种是增加绿茶产区经济效益的重要途径。
由于光照诱导型白化茶树品种“洒金”属于名贵品种，市场种苗紧缺。而且该品种只有在高温强光照季节才表现出白化现象，在茶树适宜种植的季节——冬季则与一般茶树品种在外部形态特征上很难区分。化学成分测定也可以用于白化茶树品种鉴定，但茶树的化学成分含量随生长季节和环境条件而变化，在冬季茶树种植期，白化茶树的特征性化合物，如茶氨酸含量也不是最高的季节，与一般茶树品种相当，所以在具体应用上受到季节限制。因此在苗木交易过程，迫切需要一种更准确而有效的鉴定技术，以防止假冒伪劣种苗坑害茶农。
DNA分子检测是鉴定品种最准确而稳定的方法，如果能寻找出某个品种的特异性DNA分子标记，可以快速而准确地鉴定品种的真实性。本发明提供光照诱导型茶树品种“洒金”的特异DNA分子标记及鉴定方法。该方法稳定可靠，不受生长季节和环境条件差异的影响。
发明内容
本发明的目的提供光照诱导型白化茶树品种“洒金”的特异DNA序列，作为其分子标记，通过特定引物进行PCR分析，如果具有该特异分子标记的DNA序列，就可以确定为品种“洒金”。否则，被鉴定的品种则为“洒金”以外的其它品种。结果可靠，操作简便。
本发明技术方案如下白化茶树品种“洒金”的特异DNA分子标记具有如SEQIDNO.1所述的核苷酸序列，其分子量为285bp。
SEQIDNO.1attttctgag ctagtatcac accattcatg tgagctctgc actctcctcc gtggatagct 60tccataaggt gccttaattc accttcctca acacacaact tatgcattcc tagatggcct 120attttgtaca acttgtttct gcagatnacg aattgaatgg ccagacgccg tattcccttt 180ttgtccttgg cacttgcccc tagtgggtat gcctctttgt ccaggaaatt caagatgtcg 240taatactagg ggtaagtgtc ttgaacctca tctatcacgg cgatt 285以上所述的白化茶树品种“洒金”的鉴定方法为以下步骤1.从茶树鲜叶中提取DNA；2.将提取的DNA通过随机引物CAATCGCCGT进行RAPD-PCR扩增；3.将PCR扩增产物电泳鉴定、带型分析，出现分子量为450-500bp条带的被测茶树判定为“洒金”品种。
本发明方案也可以将步骤3电泳鉴定出现的分子量为450-500bp条带胶回收，并对胶回收产物扩增和测序，得到一个大小为285bp的核苷酸序列；用SEQIDNO.1所述的核苷酸序列对照测序结果判定“洒金”品种。
图1为白化茶树品种“洒金”的特异DNA分子标记的核苷酸序列(SEQIDNO.1)。
具体实施例方式
1基因组NDA提取取被鉴定茶树鲜叶约100mg，放入研钵并加液氮100ml，快速研磨后；将研磨后的粉末快速转移至1.5ml离心管。加入65℃预热的2×CTAB 500μl混匀，65℃水浴5min。加入等量的氯仿-异戊醇(24∶1)混合液，充分混匀，于12000rpm离心10min，转移上清液至新的离心管。加入2倍体积无水乙醇，待白色絮状沉淀出现，用手术针勾出白色沉淀并转移入另一根新的离心管中，加入1ml 70％乙醇清洗，倒出乙醇；再经氯仿-异戊醇混合液和乙醇重悬和洗涤一次，于室温空气中晾干，最后用TE buffer或无菌水中稀释至DNA浓度为100μg/ml，保存于-20℃冰箱备用。
2PCR放应在0.5ml离心管中加入以下溶液17.8μl ddH2O，2.5μl的10×buffer，2.5μl的25mmol Mg2+，0.5μl的10mmol dNTP，0.33μl的引物(CAATCGCCGT)溶液，1.2μl的上述DNA溶液，0.17μl的TAG酶溶液。将离心管盖紧并置于DYADTMPTC-200PCR仪上，在94℃预变性5min；然后经94℃变性30s，36℃退火1min，72℃延伸2min，共40个循环处理；最后72℃延伸处理10min；保存于4℃，即为PCR产物。
3电泳取1.5克琼脂糖(Agrose)，加100ml水，加热至80℃溶解，倒入电泳槽制成6-7mm厚度的凝胶，冷却后在加样孔加入上述PCR反应产物，同时在另一加样孔加入DNA分析量标准物供分子量鉴定；在100V恒压条件下电泳约30min。
4带型鉴别将上述电泳凝胶置于JD-801凝胶电泳图象分析系统进行带型分析，以DNA分子量标准物为参照，在紫外线照射下发现，分子量为450-500bp的条带只在“洒金”品种出现、其它品种不具备。在品种鉴定中，如果具备该条带的供鉴定品种为“洒金”品种，否则可以鉴定为非“洒金”品种。
5特异DNA分子标记核苷酸序列分析本发明为了进一步了解上述特异性条带的核苷酸序列，对该序列进行了序列鉴定。方法是在紫外光下用无菌消毒的刀片将该特异条带从琼脂凝胶上切下，回收至干净的1.5ml离心管中，并用UNIQ-10柱式DNA胶回收试剂盒进行纯化。以纯化后的产物作模板，用相同的引物(CAATCGCCGT)进行二次PCR扩增，扩增产物用1.5％Agrose 1-H凝胶电泳(恒压100V)检测。然后用全自动DNA测序仪(ABI 3700)和BigDyeTerminators Cycle Sequencing Kit，按照单引物Sanger双脱氧链终止法测序。测序结果见图1。
实施例1供试品种为了验证本发明的特异DNA分子标记为光照诱导型白化茶树品种“洒金”特有，本实施例以常见的茶树品种“福鼎大白茶”(编号1号品种)，低温诱导型白化茶树品种“白叶茶1号”(编号2号品种)、“千年雪”(编号3号品种)，光照诱导型白化茶树品种2个——“黄金芽”(编号4号品种)和“洒金”(编号5号品种)等5个品种为试验材料。每个品种取1芽1叶新梢1个进行鉴定。
2基因组NDA提取分别秤取上述茶树品种鲜叶100mg，放入研钵并家液氮100ml，快速研磨后；将研磨后的粉末快速转移至1.5ml离心管。加入65℃预热的2×CTAB 500μl混匀，65℃水浴5min。加入等量的氯仿-异戊醇(24∶1)混合液，充分混匀，于12000rpm离心10min，转移上清液至新的离心管。加入2倍体积无水乙醇，待白色絮状沉淀出现，用手术针勾出白色沉淀并转移入另一根新的离心管中，加入1ml 70％乙醇清洗，倒出乙醇；再经氯仿-异戊醇混合液和乙醇重悬和洗涤一次，于室温空气中晾干，最后用TE buffer或无菌水中稀释至DNA浓度为100μg/ml，保存于-20℃冰箱备用。
2PCR放应在0.5ml离心管中加入以下溶液17.8μl ddH2O，2.5μl的10×buffer，2.5μl的25mmol Mg2+，0.5μl的10mmol dNTP，0.33μl的引物(CAATCGCCGT)溶液，1.2μl的上述DNA溶液，0.17μl的TAG酶溶液。将离心管盖紧并置于DYADTMPTC-200PCR仪上，在94℃预变性5min；然后经94℃变性30s，36℃退火1min，72℃延伸2min，共40个循环处理；最后72℃延伸处理10min；保存于4℃，即为PCR产物。
3电泳取1.5克琼脂糖(Agrose)，加100ml水，加热至80℃溶解，倒入电泳槽制成6-7mm厚度的凝胶，冷却后在加样孔加入上述PCR反应产物，同时在另一加样孔加入DNA分析量标准物供分子量鉴定；在100V恒压条件下电泳约30min。
4带型鉴别将上述电泳凝胶置于JD-801凝胶电泳图象分析系统进行带型分析，以DNA分子量标准物为参照，在紫外线照射下发现，分子量为450-500bp的条带只在5号品种“洒金”中出现，编号为1-4号的“福鼎大白茶”、“白叶茶1号”、“千年雪”、“黄金芽”等4个其它品种检测不出该条带。证明供鉴定品种中5号品种为“洒金”，编号为1-4号的4个品种不是“洒金”。将该条带胶回收，并对胶回收产物扩增和测序，得到一个大小为285bp的核苷酸序列；用SEQIDNO.1所述的核苷酸序列对照测序结果判定“洒金”品种。
在茶树种苗交易或品种鉴定研究过程，根据本发明提供的DNA序列的特异分子标记，应用上述方法，可以准确鉴定所提供的茶树品种是否“洒金”品种。由于DNA分子结构具有品种特异性，而且不受环境条件和季节变化的影响，任何时间都可以进行。
权利要求
1.白化茶树品种“洒金”的特异DNA分子标记，其特征在于特异DNA分子标记具有如SEQIDNO.1所述的核苷酸序列，其分子量为285bp。
2.按权利要求1所述的白化茶树品种“洒金”，其特征在于它的鉴定方法为以下步骤(1)从茶树鲜叶中提取DNA；(2)将提取的DNA通过随机引物CAATCGCCGT进行RAPD-PCR扩增；(3)将PCR扩增产物电泳鉴定、带型分析，出现分子量为450-500bp条带的被测茶树判定为“洒金”品种。
3.按权利要求2所述的白化茶树品种“洒金”的鉴定方法，其特征在于将步骤(3)电泳鉴定出现的分子量为450-500bp条带胶回收，并对胶回收产物扩增和测序，得到一个大小为285bp的核苷酸序列；用SEQIDNO.1所述的核苷酸序列对照测序结果判定“洒金”品种。
全文摘要
本发明属于生物技术领域，涉及茶树品种的生物技术鉴定。公开了一种光照诱导型白化茶树品种“洒金”的特异DNA分子标记及其鉴定方法，该特异DNA分子标记的核苷酸序列其分子量为285bp。它的鉴定方法为从茶树鲜叶中提取DNA；将提取的DNA通过PCR扩增；将PCR扩增产物电泳鉴定、带型分析，出现分子量为450－500bp条带的被测茶树判定为“洒金”品种。将此分子量为450－500bp电泳条带胶回收，并对胶回收产物扩增和测序；用本发明公开的大小为285bp的核苷酸序列对照测序结果判定“洒金”品种。本发明提供的光照诱导型茶树品种“洒金”的特异DNA分子标记及鉴定方法稳定可靠，不受生长季节和环境条件差异的影响。
文档编号C12P19/34GK1955312SQ20061005334
公开日2007年5月2日 申请日期2006年9月12日 优先权日2006年9月12日
发明者梁月荣, 杜颖颖, 金晶, 陆建良, 林晨 申请人:浙江大学