专利名称：一种鉴定茶树无性系品种的分子标记方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，涉及一种鉴定农作物品种纯度的方法，特别涉及一种鉴定茶树无性系品种纯度的分子标记方法。
背景技术：
茶叶是云南传统支柱产业之一，也是山区农民经济收入的重要来源。随着名优茶生产的发展，各地积极推进茶园良种化进程，经过多年努力，云南省无性系良种茶园面积已超过160万亩，良种化率达到30%。按照云南省委省政府每年发展无性系良种茶园面积10万亩的规划，年需良种苗木3亿株(每亩3000株)。同时，随着良种茶园的扩大，又大大促进了名优茶的发展，为茶农增收起到了巨大的作用。良种与名茶，相得益彰。统计还表明，无性系良种与当地群体种比较，其收益要高出1-3倍。因此，今后云南省对良种的需求将更 加迫切。茶树是多年生作物，良种一经应用，收益将是长期的。可是选育一个新品种需要十多年艰苦和细致的工作。由于技术条件的限制，以往品种种性真实性鉴定依据主要是形态特征和生化成分，因其易受环境条件、栽培措施和发育阶段的影响，可靠性不强。由于缺乏有效的品种鉴别手段，在良种推广过程中，出现品种假冒或有争议时难以进行有效的监督和仲裁。为了使云南省茶园良种化进程健康地发展，切实保护好新品种知识产权，迫切需要建立稳定可靠的茶树无性系品种鉴别方法和检验技术规程。现已表明分子标记技术是进行作物品种鉴别的最有效手段(王忠华.DNA指纹图谱技术及其在作物品种资源中的应用[J].分子植物育种，2006，4(3) :425-430.)。这项技术的特点是可反映不同品种基因组水平上的变异；不受环境条件变化的影响；具有遗传稳定性；多态性好等等。目前，已有多种分子标记技术在茶树品种鉴别研究上应用，并显示出很好的实用性。而与其他分子标记相比，SSR(Simple Sequence Repeat)标记技术具有多态性高、共显性、通用性好、开发快速、费用低等诸多优点，已在多种农作物遗传连锁图谱构建、遗传多样性研究、标记和定位基因以及分子标记辅助选择等方面得到应用，并发挥着越来越重要的作用。特别在茶树上，已经在茶树遗传多样性、亲缘关系、分子指纹图谱等方面开展了应用(刘振，王新超，赵丽萍，姚明哲，王平盛，许玫，唐一春，陈亮.基于EST-SSR的西南茶区茶树资源遗传多样性和未缘关系分析.分子植物育种，2008, (6) 1 :100-110 ;姚明哲，刘振，陈亮，王新超，马春雷，梁月荣.利用EST-SSR分析江北茶区茶树资源的遗传多样性和遗传结构.茶叶科学，2009，29 (3) :243-250 ;王丽鸳，刘本英，姜燕华，段云裳，成浩，周健，唐一春.用SSR分子标记研究茶组植物种间亲缘进化关系.茶叶科学，2009，29 (5)157-165.)。云南科研单位选育的茶树无性系良种试验示范结果表明，这些品种具有优质、高产、高效、适应性广等特点，是茶区生产优质茶叶及改善茶区茶树品种结构的理想品种。为保证优质良种产生最大的经济效益、社会效益，需要一种权威、准确、稳定检测方法进行茶树无性系品种纯度的快速鉴定。
发明内容
本发明目的是提供一种鉴定茶树无性系品种纯度的分子标记方法，它具有多态性高、遗传稳定、不受环境条件影响等优点，可以弥补传统检测方法的不足，从而为茶树品种的纯度检测建立起高效、准确、快速的鉴定方法。本发明所提供的鉴定茶树无性系品种纯度的方法，包括以下步骤I)按照如下方法提取待测茶树品种的基因组DNA :将待检测品种的I. Og鲜嫩芽叶放入研钵中，加入液氮充分研磨至粉末状，加入CTAB缓冲液，65°C水浴30-60分钟，再加入DNA提取液，提取得到待检测茶树品种的基因组DNA。2)按照如下方法对待检测茶树品种进行PCR扩增以步骤I)提取的基因组DNA为模板，用SSR引物进行PCR扩增，将所得到的PCR扩增产物进行10%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，得到待检测茶树品种的电泳图谱。
3)将待检测茶树品种的电泳图谱与按照所述步骤I)和2)的方法得到的标准茶树品种的电泳图谱进行比较，如待检测品种与标准品种的谱带(带型)组成一致，则待检测品种与标准品种为同一品种，得出待检测的品种纯度。所述SSR引物对标准茶树品种能产生特异的谱带，可从现有的茶树SSR引物中选取。所述的标准品种为已知的茶树无性系品种。所述CTAB缓冲液的组成为每IOOml水溶液中含有2g CTAB，pH 8. 0的IOml ImoI/L Tris-HCI, 4ml 0. 5mol/L EDTA, 28ml 5mol/L NaCl，Iml P -巯基乙醇。所述DNA提取液是由体积比为24 I的三氯甲烷和异戊醇配成的混合液。所述PCR扩增的扩增程序为先95°C变性3-5min，然后进行如下30-35个循环94°C变性 30-358，531、541、551、561、581或601复性30-358，721延伸 50s，最后 72°C延伸IOmin0所述茶树品种为茶树无性系品种，其中云南茶树无性系品种主要有佛香I号、佛香2号、佛香3号、佛香4号、佛香5号、云茶I号、云茶春毫、云茶春韵、紫娟、云抗10号、云抗12号、云抗14号、云抗17号、云抗27号、云抗37号、云抗43号、云抗47号、云抗48号、云抗50号、73-11、76-38、云选9号、长叶白毫、73_8、云瑰、矮丰、云梅等共27个云南茶树无性系品种。所述SSR引物由序列表中2对引物SSR12、SSR42组成。所述PCR扩增的扩增程序为先95°C变性3min，然后进行如下35个循环94°C变性 308，53°〇、541、551、561、581或601复性 30s，72。。延伸 50s，最后 72°C延伸 IOmin0本发明对常规SSR分子标记技术的一些操作环节进行了改进和修改，修改后的实验方法保留了 SSR标记的特色和关键技术，简化了实验步骤，降低了技术含量，用于鉴定茶树品种纯度。该方法操作简单，能够在短时间对样品进行快速鉴定。本发明的优点I、针对SSR扩增对DNA质量要求不高的特点，简化了 DNA提取程序。与常规SSR分析相比，省略了 DNA纯化和降解RNA等步骤，节约时间和试剂费用。2、常规SSR分析时一般采用测序胶，即变性聚丙烯酰胺凝胶。制胶技术要求高，电泳上样前须对样品DNA的PCR扩增产物进行变性处理，电泳缓冲液和电泳后胶板的染色与显色试剂用量大。本发明采用10%非变性聚丙烯酰胺凝胶，制胶简便。电泳前不需变性，操作简单，胶量、电泳缓冲液和染色与显色的试剂节约一半。3、一般的生物工程公司可提供扩增反应液的试剂或扩增试剂盒。制胶和染色易掌握，图谱清晰。由于基因组DNA中SSR的多态性丰富，遗传性不受环境影响，其结果准确。本发明的积极效果其积极的效果是建立稳定可靠的茶树无性系品种鉴别方法和检验技术规程，促进茶树良种化进程健康发展，切实保护好茶树新品种知识产权，保障茶叶产业健康、稳定、可持续发展。
图I为整个技术流程图
图2、图3为部分待检测茶树品种和标准茶树品种(佛香3号)的电泳图谱。M 50bp分子量标准；1 :云抗10号；2 :佛香3号；3 :佛香I号；4 :紫娟；5 :待检测品种-I ；6 :待检测品种-2 ；7 :待检测品种-3 ；8 :待检测品种-4 ；9 :待检测品种-5 ;箭头所示为佛香3号的特异带型。
具体实施例方式一、本发明所用的主要试剂配制Ulmol/L Tris-HCI(pH 8. 0)100ml 12. Ig Tris-HCI(三羟甲基氨基甲烷盐酸盐)，加去离子水至100ml，NaOH(氢氧化钠)调pH 8. O。2,0. 5mol/L EDTA(pH 8. 0)100ml 18. 6g EDTA(乙二胺四乙酸二钠)，2g NaOH，4°C保存备用。3、5mol/L NaCl100ml 29. 2g NaCl (氯化钠)，加去离子水至 100ml。4、CTAB 缓冲液100ml 2g CTAB，pH 8.0 的 IOml lmol/L Tris-HCI, 4ml 0. 5mol/L EDTA, 28ml5mol/L NaCl, Iml P -巯基乙醇。5、CTAB/NaCl 缓冲液100ml 10g CTAB，4. Ig NaCl，加去离子水溶解定容 100ml。6、DNA提取液(三氯甲烷异戊醇/24v Iv)100ml 4ml异戊醇溶于96ml三氯甲烷。7、3mol/L NaAc(pH5. 2)100ml 60ml H2O中加入40. 824g NaAc 3H20，溶解后，用冰醋酸调pH至5. 2，然后定溶100ml,灭菌。8、5 X TBE (Tris-硼酸)电泳缓冲液1000ml 54g Tris (三羟甲基氨基甲烷)，27. 5g 硼酸，20ml 0. 5mol/L EDTA (pH8. 0)，加去离子水至1000ml。
9、高盐TE缓冲液500ml 100ml 5mol/L NaCl，5ml lmol/L Tris-HCI (pH 8.0),0. Iml 0. 5mol/LEDTA (pH 8.0)，加水定容 500ml，灭菌。10、70% 乙醇100ml 70ml 无水乙醇，加水 30ml 至 100ml。11、30%丙烯酰胺
100ml :29g丙烯酰胺，Ig N、N-二甲叉双丙烯酰胺，37°C助溶，加去离子水定容至IOOml。12、6 X londing Buffer (上样缓冲液)100ml :0. 25g溴酹蓝,0. 25g 二甲苯青F F, 40g鹿糖,加水溶解定容至IOOml。13、10%过硫酸铵IOml lg过硫酸铵，加去离子水至10ml。14、固定液(10%乙醇)500ml :50ml乙醇，2. 5ml乙酸，加去离子水至500ml。15、染色液(0. 2AgN03)500ml :0. Ig AgNO3 (硝酸银)，加去离子水至 500ml。16、显色液100ml 1. 5g NaOH, 500 U I 甲醛，加去离子水 100ml。二、鉴定茶树品种纯度的方法I、样品选取采集待检测茶树无性系品种的一芽二叶鲜嫩芽叶，_20°C保存备用。2、待检测茶树品种基因组DNA的提取I)将I. Og鲜嫩芽叶放入研钵中，加入液氮充分研磨，研磨至粉末状，转入I. 5ml离心管中，加入 0.6ml CTAB 提取液(2% CTAB,0. IM Tris,20mmol EDTA, I. 4M NaCl，pH 8.0)，震荡混匀，然后转入65°C水浴锅保温50min，期间不断摇匀。2)随后加入等体积(0.6ml)氯仿/异戊醇(24 I)，充分混匀。3)室温下IOOOOrpm,离心IOmin,吸上清液(0. 4ml)于新的I. 5ml离心管中，加入1/10 体积 CTAB/NaCl (10% CTAB，0. 7M NaCl)，用等体积氯仿 / 异戊醇(24 I)抽提。4)室温下IOOOOrpm,离心8min,吸上清液(0. 4ml)于新的I. 5ml离心管中，上清液中加入2/3体积的异丙醇,混勻后于_20°C放置lh, 5000rpm,离心5min,收集沉淀。5)加入 0. 4ml 高盐缓冲液(IOmmol Tris, 0. Immol ETDA, IM NaCl, pH 8. 0)溶解沉淀，60°C水浴锅保温30min。然后IOOOOrpm,离心5min,去除不能溶解杂质,吸上清液(约0. 4ml)于新的I. 5ml离心管中(无沉淀属正常现象)。6)加入1/10体积NaAc (pH 5. 2)及2/3体积体积的异丙醇，混匀后于_20°C放置30min。然后5000rpm离心5min,倒掉上清液,收集沉淀。7)用70%的乙醇洗DNA沉淀3次，每次2min，将离心管倒置于吸水纸上，使DNA干燥，最后溶于300 u I超纯水(ddH20)中，并加入2 u I RNase (4mg/ml)，恒温箱37°C保温30min，_20°C冰箱保存备用。3、PCR 扩增
以步骤2提取的待检测茶树品种的基因组DNA为模板，用SSR引物进行PCR扩增。其中，PCR扩增体系如下扩增体积为lOiil，其成分为1.0iil 20-50ng/ u I templateDNA, 0. 4 u I 10 u mol/1 primer, I. O u I 10 X PCR buffer (Mg2++free) 0. 7 u I 25mmol/lMgCI2,0. 2 u I 10nmol/l dNTP, 0. I U I 5U/ U I Taq DNA polymerase, 6. 6 U I 灭菌 ddH20。PCR扩增程序先95°C变性3min，然后进行如下35个循环94°C变性30s，53°C、54°〇、551、561、581或601复性 30s，72。。延伸 50s，最后 72°C延伸 IOmin04、凝胶制备将配好10%非变性聚丙烯酰胺凝胶灌入事先做好的20X20cm的两块玻璃板的间隙中(Imm厚)，立即插入样品梳，10-15min内聚合，聚合后小心抽出样品梳，并用洗瓶冲洗样品胶孔。
5、凝胶电泳扩增产物加入I 上样缓冲液，上样电泳。电泳缓冲液为I150V，电泳2h 30min左右。6、凝胶银染I)电泳完毕后,取下胶板,在500ml固定液中固定12-15min(可同时固定2-4块胶)。2)去离子水漂洗2次，每次5min。3)0. 2%硝酸银染色液染色12_15min (可同时染色2_4块胶)。4)去离子水快速漂洗10-20s。5)放入预冷的500ml显色液显色，不断摇动，至谱带显出(可同时显色2_4块胶)。6)终止反应，用蒸馏水漂洗I次。7)把染色后的凝胶进行带型分析或扫描纪录，或放入5%的甘油溶液中浸泡30min左右制成干胶，室温干燥后，进行带型分析或扫描纪录。7、鉴定将待检测样品的SSR扩增产物的电泳图谱，与按照上述步骤I至6的方法获得的标准茶树品种的电泳图谱相比较，根据待检测茶树品种样品SSR扩增产物和标准茶树品种SSR扩增产物的DNA谱带的组成(带型)的一致性，鉴定茶树品种纯度。本发明的方法对任一茶树无性系品种有效，但SSR引物有别，下面以茶树无性系品种佛香3号以及引物SSR12、SSR42为实用范例。实施例I、以佛香3号为标准茶树品种鉴定茶树品种纯度。鉴定前对来源于云南省的27个品种(含佛香3号)进行了 SSR标记的筛选，发现SSR引物SSR12、SSR42对佛香3号的基因组DNA可产生特异的谱带，因此，用引物SSR12、SSR42对佛香3号供检样品的DNA进行分析。I、样品选取从云南茶树无性系品种中选取待检测品种佛香3号及其他4个待检测品种(对照)，为检验鉴定效果，再掺入云抗10号、佛香I号、紫娟等茶树品种，采集待检测茶树无性系品种的一芽二叶鲜嫩芽叶，_20°C保存备用。2、茶树品种基因组DNA的提取I)将I. Og鲜嫩芽叶放入研钵中，加入液氮充分研磨，研磨至粉末状，转入I. 5ml离心管中，加入 0.6ml CTAB 提取液(2% CTAB,0. IM Tris,20mmol EDTA, I. 4M NaCl，pH 8.0)，震荡混匀，然后转入65°C水浴锅保温50min，期间不断摇匀。2)随后加入等体积(0.6ml)氯仿/异戊醇(24 I)，充分混匀。3)室温下IOOOOrpm,离心IOmin,吸上清液(0. 4ml)于新的I. 5ml离心管中，加入1/10 体积 CTAB/NaCl (10% CTAB，0. 7M NaCl)，用等体积氯仿 / 异戊醇(24 I)抽提。4)室温下IOOOOrpm,离心8min,吸上清液(0. 4ml)于新的I. 5ml离心管中，上清液中加入2/3体积的异丙醇,混勻后于_20°C放置lh, 5000rpm,离心5min,收集沉淀。5)加入 0. 4ml 高盐缓冲液(IOmmol Tris, 0. Immol ETDA, IM NaCl, pH 8. 0)溶解沉淀，60°C水浴锅保温30min。然后IOOOOrpm,离心5min,去除不能溶解杂质,吸上清液(约0. 4ml)于新的I. 5ml离心管中(无沉淀属正常现象)。 6)加入1/10体积NaAc (pH 5. 2)及2/3体积体积的异丙醇，混匀后于_20°C放置30min。然后5000rpm离心5min,倒掉上清液,收集沉淀。7)用70%的乙醇洗DNA沉淀3次，每次2min，将离心管倒置于吸水纸上，使DNA干燥，最后溶于300 u I超纯水(ddH20)中，并加入2 u I RNase (4mg/ml)，恒温箱37°C保温30min，_20°C冰箱保存备用。3、SSR引物的PCR扩增以步骤2提取的待检测茶树品种的基因组DNA为模板，用SSR引物进行PCR扩增。其中，PCR扩增体系如下扩增体积为lOiil，其成分为1.0iil 20-50ng/ u I templateDNA, 0. 4 u I 10 u mol/1 primer, I. O u I IOXPCR buffer (Mg2++free) 0. 7 u I 25mmol/lMgCI2,0. 2 u I 10nmol/l dNTP, 0. I u I 5U/ u I Taq DNA polymerase, 6. 6 u I 灭菌 ddH20。PCR扩增程序先95°C变性3min，然后进行如下35个循环94°C变性30s，53°C、54°〇、551、561、581或601复性 30s，72。。延伸 50s，最后 72°C延伸 IOmin04、凝胶制备将配好10%非变性聚丙烯酰胺凝胶灌入事先做好的20X20cm的两块玻璃板的间隙中(Imm厚)，立即插入样品梳，10-15min内聚合，聚合后小心抽出样品梳，并用洗瓶冲洗样品胶孔。5、凝胶电泳扩增产物加入I U I上样缓冲液,上样电泳。电泳缓冲液为I父18￡，恒压电压150V，电泳2h 30min左右。6、凝胶银染I)电泳完毕后，取下胶板，在500ml固定液中固定12-15min(可同时固定2-4块胶)。2)去离子水漂洗2次，每次5min。3)0. 2%硝酸银染色液染色12-15min (可同时染色2_4块胶)。4)去离子水快速漂洗10-20s。5)放入预冷的500ml显色液显色，不断摇动，至谱带显出(可同时显色2_4块胶)。6)终止反应，用蒸馏水漂洗I次。7)把染色后的凝胶进行带型分析或扫描纪录，或放入5%的甘油溶液中浸泡30min左右制成干胶，室温干燥后，进行带型分析或扫描纪录。
7、鉴定将待检测样品的SSR扩增产物的电泳图谱，与按照上述步骤I至6的方法获得的标准茶树品种的电泳图谱相比较，根据待检测茶树品种样SSR扩增产物和标准茶树品种SSR扩增产物的DNA谱带的组成(带型)的一致性，鉴定茶树品种纯度。结果表明，5个待检测品种中只有待检测品种-I的SSR图谱带型与佛香3号相同，其他品种与佛香3号和待检测品种-I带型有差异，与预选掺杂的情况相符，说明待检测品种-I是佛香3号，其他4个待检测品种则不是佛香3号。部分待检测品种和标准品种佛香3号的电泳图谱如图2、图3 所不，图中，M 50bp分子量标准；1 :云抗10号；2 :佛香3号；3 :佛香I号；4 :紫娟；5 :待检测品种_1 ；6 :待检测品种-2 ；7 :待检测品种-3 ；8 :待检测品种-4 ；9 :待检测品种-5 ;箭头所示为佛香3号的特异带型。
权利要求
1.一种鉴定茶树无性系品种的分子标记方法，包括以下步骤 1)按照如下方法提取待检测茶树品种的基因组DNA:将待检测品种的I. Og鲜嫩芽叶放入研钵中，加入液氮充分研磨至粉末状，加入CTAB缓冲液，65°C水浴30-60分钟，再加入DNA提取液，提取得到待检测茶树品种的基因组DNA。
2)按照如下方法对待检测茶树品种进行PCR扩增以步骤I)提取的基因组DNA为模板，用SSR引物进行PCR扩增，将所得到的PCR扩增产物进行10%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，得到待检测茶树品种的电泳图谱。
3)将待检测茶树品种的电泳图谱与按照所述步骤I)和2)的方法得到的标准茶树品种的电泳图谱进行比较，如待检测品种与标准品种的谱带(带型)组成一致，则待检测品种与标准品种为同一品种，得出待检测的品种纯度。
2.根据权力要求I所述的方法，其特征在于所述SSR引物对标准茶树品种能产生特异的谱带。
3.根据权力要求I所述的方法，其特征在于所述CTAB缓冲液的组成为每IOOml水溶液中含有 2g CTAB，pH 8.0 的 IOml lmol/L Tris_HCI，4ml 0. 5mol/L EDTA, 28ml 5mol/LNaCl，lmiP-巯基乙醇。
4.根据权利要求I所述的方法，其特征在于所述DNA提取液是由体积比为24 I的三氯甲烷和异戊醇配成的混合液。
5.根据权利要求I所述的方法，其特征在于所述PCR扩增的扩增程序为先95°C变性3-5min，然后进行如下 30-35 个循环94°C变性 30_35s，53°C、54°C、55°C、56°C、58°C或 60°C复性 30-35s，72°C延伸 50s，最后 72°C延伸 IOmin0
6.根据权利要求I至5中任一所述的方法，其特征在于所述茶树品种为茶树无性系品种，其中云南茶树无性系品种主要有佛香I号、佛香2号、佛香3号、佛香4号、佛香5号、云茶I号、云茶春毫、云茶春韵、紫娟、云抗10号、云抗12号、云抗14号、云抗17号、云抗27号、云抗37号、云抗43号、云抗47号、云抗48号、云抗50号、73-11、76-38、云选9号、长叶白毫、73-8、云瑰、矮丰、云梅等共27个云南茶树无性系品种。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于所述SSR引物为由序列表中的2对引物SSRl2 和 SSR42 组成。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于所述PCR扩增的扩增程序为先95°C变性3min，然后进行如下35个循环94°C变性30s，53°C、54°C、55°C、56°C、58°C或60°C复性30s，72。。延伸 50s，最后 72°C延伸 IOmin0
9.根据权利要求I至5中任一所述的方法，其特征在于所述步骤2)中将所得到的PCR扩增产物进行10 %非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳。
10.根据权利要求I至5中任一所述的方法，其特征在于所述步骤I)中水浴时间为50分钟。
全文摘要
本发明提供一种鉴定茶树无性系品种的分子标记方法，属生物技术领域。包括以下步骤将待测品种的1.0g鲜嫩芽叶放入研钵，加入液氮研磨至粉末状，加入CTAB缓冲液，1)65℃水浴30-60分钟，再加入DNA提取液，得到待测茶树品种的基因组DNA；2)以步骤1)提取的基因组DNA为模板，用SSR引物进行PCR扩增，将扩增产物进行10％非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，得到待测品种的电泳图谱；3)将待测品种的电泳图谱与按照所述步骤1)和2)的方法得到的标准茶树品种的电泳图谱进行比较，如待检品种与标准品种的谱带组成一致，则待测品种与标准品种为同一品种，得出待测品种纯度。本发明与其他方法相比，更能真实反映茶树品种的遗传背景和亲缘关系。该技术可作为鉴定茶树品种真伪的科学依据。
文档编号C12Q1/68GK102776271SQ20111012326
公开日2012年11月14日 申请日期2011年5月13日 优先权日2011年5月13日
发明者刘本英, 孙雪梅, 李友勇, 汪云刚 申请人:刘本英