专利名称：黄瓜花叶病毒双抗体夹心酶联免疫吸附检测试剂盒及制备方法
技术领域：
本发明涉及百合黄瓜花叶病毒双抗体酶联免疫吸附检测试剂盒，以及这种检测试剂盒的制备方法。本发明所述的双抗体酶联免疫吸附特别指双抗体夹心法酶联免疫吸附。
背景技术：
百合(Lilium spp.)传统上是药用和食用植物，现已成为国际上重要切花观赏花卉之一。荷兰1997年百合种植面积达3560万hm2，每年生产鳞茎18亿个，70％以上出口，在荷兰根花卉生产中名列第二位。但随着百合种植面积日益扩大，高密度种植和长期无性繁殖使病毒不断积累，病毒病对百合的危害日趋严重，影响了百合的产量和品质，给百合种植业造成巨大的经济损失。但人们对百合受病毒危害的重视不够，百合的抗病毒品种极少。百合的引种频繁，鲜花进出口频率高，加速了病毒的传播。据报道，百合病毒病在19世纪后期几乎把百合栽培种和品种推向绝灭境地，现已知百合病毒病原有14种，类菌原体1种，其中为害严重的病毒有4种，即百合无症病毒(Lily symptomless virus，LSV)、黄瓜花叶病毒(Cucumbermosaic virus，CMV)、郁金香碎锦病毒(Tulip breaking virus，TBV，异名Lily mottle virus，LMoV)和百合丛簇病毒(Lily rosette virus，LRV)，其他各种病毒均为局部地区发生，百合病毒常复合侵染，不同病毒在百合上表现相似症状，同种病毒在不同条件下的症状有很大变异。
当前切花百合在我国花卉产业产值中占第四位，同时作为食品和药材，百合也是一种重要的经济作物。我国是百合病毒病流行较为严重的国家，其中主要是由于LSV和CMV等病毒引起的。减少病毒病在百合种植业中的损失，最便捷的方法是采用脱毒培养。国内现在大量采用脱毒培养技术，但依然存在不少问题，最主要的是缺少LSV和CMV的方便快捷、准确可靠的检测方法。
黄瓜花叶病毒百合株(CMV-Li)可侵染百合科植物的病毒，是百合科植物的主要病毒病害之一，广泛分布于世界各地。黄瓜花叶病毒经常与百合隐症病毒(LSV)、百合斑驳病毒(LMoV)等复合侵染百合科植物。单一CMV感染通常有轻微花叶症状，CMV通常和LSV等病毒复合侵染，造成严重的花叶症状、不开花、植株形态异常和球茎减小，每年在全世界范围内的园艺和农业生产中造成几十亿美元的重大损失。在我国，每年因CMV感染造成的经济损失也有十多亿元。
1896年Stewart首次报道了侵染百合的CMV，而后1937年Price也进行了报道，之后很多学者对侵染百合的CMV进行了研究。Benetti(1988)的调查研究表明CMV在意大利百合中广泛发生，并常和LSV符合侵染百合。Hagita(1989)通过酶联免疫方法检测百合CMV。Kim在1994研究报道了病毒唑对CMV的作用效果，在1995年通过组织吸附免疫的方法检测侵染百合的CMV等病毒，在1996年研究CMV的血清型与致病性的相关性时指出，CMV分离物的致病性与其血清型紧密相关，并将血清型分为Y(亚组I)与P(亚组II)两型，而来自百合的分离物不能使茄科和葫芦科等易被CMV侵染的作物发病，是相对独立的一个类群，同时对韩国光州等地区的百合植物进行病毒检测与调查，认为CMV为三种主要病毒之一。Cohen(1996)在以色列百合的病毒病一文中报道CMV的为主要病毒之一。Lee(1998)利用RT-PCR检测了侵染东方百合的CMV。Korbin(1998)等研究了CMV分离物的特性，利用ELISA和生物学实验，对波兰12种观赏植物的250个样品进行了CMV调查，发现病毒的侵染伴随着生物学形状而出现，并且在被病毒侵染的植物样品种，90％以上是多种病毒的符合侵染。在进行生物学实验时，大部分植物上的CMV分离物科通过汁液摩擦接种使这些长剑的CMV系统与鉴别寄主发病，丧失了通过汁液摩擦接种传播的特性。Niimi(1999)利用ELISA和DIBA检测田间样品种的CMV，在550个Lilium X Enchantment样品种的发生情况，在5个样品中检测到了CMV的存在，侵染率为0.9％。Chikara(2002)报道了来自日本与韩国的CMV分离物HL-CMV与Ly2-CMVs，它们具有共同的生物学特性，寄主范围相同，只侵染百合植物，根据它们的RNA3核苷酸序列分析表明尽管两个分离物来自不同的国家，但它们具有很高的同源性，达97％，据3a蛋白基因核CP基因序列树状进化图分析表明，这两种分离物在进化种单独成簇，说明它们来源于同一个祖先。Niimi等(2003)利用RT-PCR检测了侵染百合的CMV，并同时进行了ELISA检测，比较了两种检测方法的灵敏度。
CMV-Li属于黄瓜花叶病毒组，为三分体单正链RNA病毒，病毒颗粒呈正20面体，直径28～30nm。一般有RNA1、RNA2、RNA3和RNA4四条单正链线性核酸，长度分别为3300nt，305nt，2200nt和1000nt左右。CMV衣壳蛋白只有一种亚基，分子量为24kDa。已有报道对该病毒进行了全序列测序并分析了基因组结构。
目前国内尚无成熟的CMV-Li免疫检测方法，很难满足花卉及食用百合的脱毒检测需求。建立灵敏、稳定、高通量和易操作的CMV-Li的检测方法，是生产百合脱毒株的基础，是提高花卉百合品质和食用药用百合产量和质量的前提。
国内外现在对黄瓜花叶病毒百合株的主要检测手段有指示植物检测、电镜检测、分子生物学检测和免疫学检测等。
其中指示植物检测为较为传统的检测方法，测试条件受外界环境变化影响会出现不同的检测结果，检测周期也很长，操作十分复杂，检测结果不准确。
电镜检测灵敏度不高，需要大量病毒样本，检测过程复杂，并且检测结果受主观影响较大。由于电子显微镜代价昂贵，对大多数检测来说不具备条件。
分子生物学检测方法较为操作较为简单，通过病毒特异性引物进行RT-PCR检测，所需检测时间较短。但由于该病毒是单链正链RNA病毒，制备用于检测的样本模板较为复杂，对检测实验条件要求很高，且需要PCR仪等贵重仪器，检测试剂昂贵。需要有相当经验的操作者才能获得较为可靠的结果。
以上检测手段由于灵敏度、检测费用和操作难度等原因，都不适合作为大规模商业检测方法推广。
此外，现有技术制备ELISA检测试剂盒时，是用CMV全病毒免疫制备多克隆抗体，由此产生的抗体对全病毒具有特异性，但不一定对病毒衣壳蛋白亚单位单体表现高灵敏度。因此当被检植株尚未复制组装形成完整病毒颗粒，而仅含有尚未组装的衣壳蛋白亚单位游离单体时，利用现有技术将很难检测出来。
在现有技术中也没有对食用百合黄瓜花病毒检测的披露。
发明内容
本发明的目的是建立一种基于特异性多克隆抗体的CMV双抗体夹心酶联免疫检测(DAS-ELISA)方法，并研制出试剂盒，为CMV检测提供一种准确简便的技术手段。本发明所提供的这种试剂盒可以克服现有技术的不足，不仅可以快速得出被检植株是否染病，而且可以在病毒感染早期尚未组装形成完整病毒颗粒时就可检测出病毒感染情况。
本发明所述的检测盒是包括反应板、酶标抗体、缓冲液、显色液、终止液及洗涤剂，其中反应板上包被有CMV病毒多克隆抗体；酶标抗体为辣根过氧化物酶标记的CMV抗体；缓冲液为用蒸馏水配制的其内含1％聚乙二醇4000，0.5％蛋白胨，0.5‰硫柳汞钠以及1‰吐温-20的pH＝7.4，0.07M的磷酸盐缓冲液；洗涤液为含1‰吐温-20，pH＝7.2的磷酸缓冲液；稀释液为生理盐水；显色剂A为内含0.5‰，pH＝5.0的过氧化脲醋酸水溶液；显色剂B为甲醇中溶入1.6‰四甲基联苯胺，并在溶解后加一倍的甘油；终止液为用蒸馏水配制的2M硫酸溶液。
本发明的检测试剂盒中反应板上包被的CMV病毒多克隆抗体与酶标抗体的制备方法如下反应板上包被的CMV病毒多克隆抗体制备方法是将健康的雄性兔或豚鼠或羊或鸡等动物中的任一种动物致敏后，在皮下或肌肉内注射经分离、纯化后所得CMV病毒衣壳蛋白使动物产生特异免疫反应，对产生抗体的实验动物进行采血，将所采血进行抗血清的分离。再对抗血清进行盐析、透析、离子交换层析等纯化步骤，得到纯化的CMV病毒多克隆体IgG，再将经纯化的CMV病毒多克隆IgG包被于检测反应板上；如收集到血清不能及时后述的处理时，可在其中加入千分之一浓度的叠氮钠保存于-20℃或加入等体积饱和硫酸铵保存于4℃。
辣根过氧化物酶标记的CMV抗体制备方法是将不同于制备CMV病毒多克隆抗体动物的健康雄性兔或豚鼠或羊或鸡中的任一种动物致敏后，肌肉或皮下内注射纯化CMV病毒衣壳蛋白使动物产生免疫，再对产生抗体的实验动物进行采血，将所采血进行抗血清的分离，再对所得的抗血清进行盐析、透析、离子交换层析等纯化步骤，得到纯化的待标记的CMV病毒多克隆抗体。利用戊二醛二步法对该纯化的多克隆抗体进行辣根过氧化物酶标记，获得酶标抗体。这里所述的不同于制备CMV病毒多克隆抗体动物的健康雄性兔或豚鼠或羊或鸡中的任一种动物是指在制备用于酶标抗体时采用的动物，应当与制备用于包被的CMV病毒多克隆抗体所采用的动物不同。如制备用于包被的CMV病毒多克隆抗体采用家兔时，制备辣根过氧化物酶标记的CMV抗体应当采用豚鼠，或山羊，或鸡等，而不能再使用兔子。如收集到的抗血清不能及时进行后续处理，可加入等体积灭菌甘油，保存于-20℃。
本发明中用于包被的CMV病毒多克隆抗体与用于酶标的待标记的CMV病毒多克隆抗体的制备方法是用现有技术得到CMV衣壳蛋白亚单位溶液，即将经分离纯化所得的CMV病毒经裂解，层析或电泳得到CMV病毒衣壳蛋白亚单位溶液。将此溶液透析于注射用水配置的pH＝7.2，0.02M的磷酸盐缓冲液PBS中，透析后，再用pH＝7.2，0.02M的磷酸盐缓冲液PBS将CMV衣壳蛋白浓度稀释至400ug/ml。
将前述的制备好的400ug/ml的CMV衣壳蛋白溶液与等体积的弗氏完全佐剂混合并充分乳化成基础免疫抗原，给动物皮下多点注射，做基础免疫；基础免疫中CMV衣壳蛋白的剂量为家兔200ug/只，豚鼠50ug/只，鸡200ug/只，山羊1mg/只。
三周后，将经前述方法处理的400ug/ml的CMV病毒衣壳蛋白溶液与弗氏不完全佐剂混合并充分乳化，对前述已做基础免疫的动物经皮下多点注射做第一次加强免疫；第一次加强免疫中CMV衣壳蛋白的剂量为家兔200ug/只，豚鼠50ug/只，鸡200ug/只，山羊1mg/只。
第一次加强免疫后，每隔两周后再次重复加强免疫一次，剂量途径与第一次加强免疫相同。
第二次加强免疫之后10天少量采血，检测抗体效价大于1∶64时即可大量采血。采血前动物禁食12小时以上。
本发明的检测试剂盒中用于包被的CMV病毒多克隆抗体与用于酶标的多克隆抗体的制备方法是将抗血清温浴于25℃，在搅拌下缓慢加入硫酸铵固体粉末至浓度为18％，再于25℃下温浴数十分钟后，进行离心处理，弃去上清液，将沉淀溶解于去离子水中，再加入硫酸铵粉末至浓度为14％，25℃温浴30min后再离心处理，弃去上清液，将沉淀溶解于15ml去离子水中，再在pH为6.3浓度为0.07M的磷酸缓冲液PBS中透析至无铵离子，再进行离子交换层析，同时检测洗脱液280纳米处的光吸收值(OD280)，待有吸收峰出现，收集最先流出的10ml组分，即为纯化的IgG。
本发明所采用的动物最好为家兔、山羊和豚鼠。
本发明提供了双抗体夹心法酶联免疫检测盒，采用这种属于免疫学方法进行检测具有如下优点1、灵敏度高，可以检测到样品中ng级水平的病毒。
2、操作简单，普通工作人员经过简单培训就可以完成。
3、可重复性好，检测结果稳定可靠。
4、对仪器要求较低，仅需要普通恒温水浴箱、酶标仪等。如只需定性检测，则可直接通过目测获得检测结果，连酶标仪都不需要。
5、由于本发明的CMV病毒多克隆抗体所用的毒株为黄瓜花叶病毒兰州百合分类株，因此，它不但可以用于花卉百合，也可用于食用百合。
6、本发明采用的免疫源为CMV病毒衣壳蛋白，因此采用由此免疫源产生的抗体，不仅对完整病毒有特异敏感性，而且对尚未形成完整病毒的病毒蛋白亚单位也有相当的敏感性。用这种抗体制备的检测试剂盒可以检测出已染病但尚未形成完整病毒的植株。本发明的这一优点可以在感染早期就检测出植株是否已经感染，以及时采取隔离、拔除等措施，避免病毒感染范围在大田种群中扩大，从而避免或减小损失，无疑这对相关花卉及食用百合的种植生产是有极为积极的作用。
正是基于以上优点，本发明适于作为大规模商业检测方法推广，具有良好的市场前景。
附图1为用本发明的方法检测已知感染CMV样品的结果。其中1至8样品中每组样品的第一个柱状线(即左边第一个柱状线)为100倍稀释；第二个柱状线为200倍稀释；第三个状线为400倍稀释；第四个柱状线为800倍稀释；第五个柱状线为1600倍稀释，第六个柱状线为3200倍稀释，第七个柱状线为6400倍稀释。
附图2为本发明与全病毒多抗DAS-ELISA的比较。其中各被测样品(样品1至14，以及阴性样品和阳性样品)中的第一个柱状线(即每个样品左边第一个柱状线)为本发明的结果；而第二个柱状线(即每个样品左边第二个柱状线)为全病毒多抗DAS-ELISA的检测结果。
具体实施例方式
本发明以下提供一个实施例，并根据实施例例详细解说本发明的有关内容。在本实施例中是用兔和豚鼠为免疫动物。其抗体及检测试剂盒的制备如下步骤一实验动物致敏准备2.5kg左右雄性日本大耳兔若干只，200g左右雄性豚鼠20只，禁食一天。用弗氏完全佐剂(石蜡油∶羊毛脂＝7∶1，加入灭活的分枝杆菌至4mg/ml)致敏，家兔剂量为1ml/只，豚鼠剂量为0.2ml/只，致敏途径为腹腔注射。
步骤二一次免疫一周后，将-20℃保存的400ug/ml CMV病毒衣壳蛋白溶液与等体积与弗氏完全佐剂混合，充分乳化，经皮下多点注射做基础免疫。每只家兔免疫剂量为CMV衣壳蛋白200ug，每只豚鼠免疫剂量为CMV衣壳蛋白50ug。
步骤三加强免疫三周后，将-20℃保存的400ug/ml CMV病毒衣壳蛋白溶液与等体积与弗氏不完全佐剂(石蜡油∶羊膜脂＝7∶1)混合，充分乳化，经皮下多点注射做第一次加强免疫。每只家兔免疫剂量为CMV衣壳蛋白200ug，每只豚鼠免疫剂量为CMV衣壳蛋白50ug。
步骤四二次加强免疫第一次加强免疫后2周，进行第二次加强免疫，剂量途径同第一次。每隔2周，重复该步骤一次至抗血清效价符合要求。
步骤五抗血清滴度检测第三次免疫之后10天，自免疫家兔耳缘静脉及豚鼠腿部静脉各采血200ul至无菌微量离心管中，6000g离心2分钟。分离血清。经免疫双扩散法检测抗体滴度应不低于1∶64。
步骤六采血于最后一次免疫后第10天，对试验动物禁食一天。家兔采用颈动脉放血法采血，豚鼠采用心脏采血。
步骤七抗血清的分离采集到的血样，置灭菌血清分离瓶中，37℃静置2小时，4℃静置过夜。第二天，用灭菌毛细管小心收集析出血清，剩余样品于3000g离心5分钟，继续收集分离出的血清。收集到的血清在不能及时进行后述处理时可加入千分之一浓度的叠氮钠保存于-20℃。
步骤八多克隆IgG的粗分离将血清温浴于25℃，加入等体积无菌生理盐水，混匀。搅拌下，以每100ml血清稀释物缓慢加入硫酸铵固体粉末18g至浓度为18％，25℃下温浴30min，3000g离心30min。弃去上清液，将沉淀溶解于去离子水中至体积为25ml，此时多克隆抗体浓度与原抗血清中相等。搅拌下，加入硫酸铵粉末至14％(不可忽略第一次沉淀处理残留的硫酸铵量)。25℃温浴30min。3000g离心30min，弃去上清液。将沉淀溶解于15ml去离子水中，在PBS(pH6.3 0.07M)中透析至无铵离子。准备一个1.6cm×30cm的层析柱，用经过处理的DE52(Whatman)50ml装柱，室温下以PBS(pH6.3 0.07M)平衡3个柱床体积。将样品加入该离子交换柱中，用同样的缓冲液洗脱，流速控制在1ml/1分钟。检测OD280，待有吸收峰出现，收集最先流出的10ml组分，即为初步纯化IgG。此方法对于羊、兔抗血清和豚抗血清都适用。
步骤九辣根过氧化物酶(HRP)标记的豚抗CMV抗体的制备辣根过氧化物酶(HRP)标记豚抗CMV抗体。称取HRP25mg溶于0.5ml的1.25％戊二醛溶液中，于室温静置过夜。反应后的酶溶液经Sephadex G-25层析柱，用生理盐水洗脱。流速控制在1ml/1分钟，收集棕色流出液。如体积大于5ml，则以PEG12000浓缩至5ml。放置25ml小烧杯中，缓慢搅拌。将待标记的抗体12.5mg用生理盐水稀释至5ml，搅拌下逐滴加入酶溶液中。然后加入1M pH9.5碳酸缓冲液0.25ml，继续搅拌3小时。加0.2M赖氨酸0.25ml，混匀后，置室温2小时。在搅拌下逐滴加入等体积饱和硫酸铵，4℃置1小时。3000g离心半小时，弃上清。沉淀物用半饱和硫酸铵洗二次，最后沉淀物溶于少量0.15M PH7.4的PBS中。将上述溶液装入透析袋中，对0.15M PH7.4的PB缓冲盐水透析，去除铵离子后(用萘氏试剂检测)，10,000g离心30分钟去除沉淀，上清液即为酶结合物，分装后，冰冻保存。
步骤十兔抗CMV多克隆IgG预包被条的制备经由包被、封闭、干燥过程A.包被用CB(pH9.6，0.05M)将兔抗CMV多克隆抗体稀释至50或100ug/ml，100ul/孔包被于酶标检测板上，37℃温浴2小时，4℃过夜。
B.封闭用含有0.2％明胶，5％小牛血清，2％蔗糖的Tris-HCl(pH8.0)以150ul/孔封闭，37℃温浴3小时。
C、干燥37℃下尽量干燥。
步骤十一酶工作液配制A.缓冲液配制以蒸馏水配制磷酸盐缓冲液(pH7.4，0.07M)，内含1％聚乙二醇4000作为增敏剂0.5％蛋白胨；0.5‰硫柳汞钠以及1‰吐温-20。
B.以所配的缓冲液按适当浓度稀释冻存的酶标记抗体。
步骤十二其他试剂的配制A.洗涤液PBST洗液(PBS，pH7.2含1‰吐温-20)B.样品提取液1000ml PBST中含有亚硫酸钠1.3g、聚乙烯吡咯烷酮20g、叠氮钠0.2g、牛血清白蛋白2g和吐温-20 20g。
C.显色剂A以蒸馏水配制的醋酸缓冲液pH5.0，内含0.5‰过氧化脲。
D.显色剂B用甲醇配制的1.6‰四甲基联苯胺(TMB)，溶解后对倍加甘油。
E.终止液蒸馏水配制的2M硫酸溶液。
F.阳性对照适当浓度稀释的CMV纯化样品。
G.阴性对照适当稀释的健康百合组织蛋白提取液。
步骤十三检测方法A.样品处理将样品新鲜叶片组织0.1g，加入样品提取液1ml，在研钵中匀浆，至微量离心管中8000g离心5分钟，保留上清液。
B.加样将上述上清液以100ul/孔，加入预包被的多抗板条孔中，同时设空白(只加100ul样品稀释液)、阴性对照(加100ul，不加样品稀释液)、阳性对照(加100ul，不加样品稀释液)，37℃温浴60分钟。PBST冲洗4次，甩干。
C.加酶标抗体每孔加入100ul上述酶工作液，37℃温浴20分钟，PBST冲洗加样孔4-6次，尽量甩干。
D.显色先后加入显色剂A、B各50ul，37℃避光温浴15分钟。
E.终止加入一滴终止液。
F.检测于酶标仪上检测405nm吸收值。
检测实例1称取经过CMV接种的植物样品各0.1g，分别加样品提取液1ml，于组织匀浆器或研钵中匀浆。匀浆液在8000g离心5分钟，吸取上清液100ul用样品提取液稀释至1ml，取100ul分别加入第一列检测孔中，并在随后的加样孔中倍比稀释直至6400倍。同时阴性对照液100ul，加入最后一列的检测孔中。覆盖上密封膜，在37℃孵育60分钟。倾去孔内液体，PBST冲洗加样孔4-6次，尽量甩干。每检测孔中加入酶工作液100ul，覆盖上密封膜，37℃孵育60分钟。倾去孔内液体，PBST冲洗加样孔4-6次，尽量甩干。每孔分别加入底物A和底物B各50ul，覆盖上封闭膜，37℃避光孵育15分钟。加入终止液50ul终止反应。于酶标仪上检测405纳米吸光值，结果参见附图1。
结果说明本发明方法对阳性样品提取物一般可检测到800-1600倍稀释度。
为对比起见，同时用TRizol法对同批样品各取样100mg提取总RNA，利用简并引物进行RT-PCR扩增后用伯乐iCycler PCR仪进行检测。检测结果表明，当模板稀释度大于320倍以上均无检出。实际的检测结果如下表。
上述对比实验的结果说明，本发明方法对CMV的检出率优于RT-PCR方法。
检测实例2对疑似CMV感染情况样品14份，分别取叶片组织0.1g，加入1ml样品提取液，匀浆，8000g离心5分钟，取上清100ul加入加样孔中。经与前相同的处理，用本发明的方法及全病毒免疫多克隆抗体DAS-ELISA检测，结果见图2。
结果显示，对于感染晚期样品1、2、3、4感染中期样品10、11、12、13、14本发明方法与全病毒多抗DAS-ELISA检测结果相当。对于感染早期样品5、6、7、8、9，本发明方法检出率更高。
权利要求
1.百合黄瓜花叶病毒的双抗体酶联免疫吸附检测试剂盒，包括反应板、酶标抗体、缓冲液、显色液、终止液及洗涤剂，其特征在于反应板上包被有CMV病毒多克隆抗体；酶标抗体为辣根过氧化物酶标记的CMV抗体；缓冲液为用蒸馏水配制的其内含1％聚乙二醇4000，0.5％蛋白胨，0.5‰硫柳汞钠以及1‰吐温-20的pH＝7.4，0.07M的磷酸盐缓冲液；洗涤液为含1‰吐温-20，pH＝7.2的磷酸缓冲液；稀释液为生理盐水；显色剂A为内含0.5‰，pH＝5.0的过氧化脲醋酸水溶液；显色剂B为甲醇中溶入1.6‰四甲基联苯胺，并在溶解后加一倍的甘油；终止液为用蒸馏水配制的2M硫酸溶液。
2.根据权利要求1所述的检测试剂盒中反应板上包被的CMV病毒多克隆抗体与酶标抗体的制备方法，其特征是a反应板上包被的CMV病毒多克隆抗体制备方法是将健康的雄性兔或豚鼠或羊或鸡中任一种动物致敏后，在肌肉内注射CMV病毒的衣壳蛋白使动物产生免疫，检测抗体滴度大于1∶64以上后即对实验动物进行采血，并将所采血进行抗血清的分离，再将保存的血清进行柱层析，得到纯化的CMV病毒多克隆体IgG，再将经纯化CMV病毒多克隆体包被于检测反应板上；b辣根过氧化物酶标记的CMV抗体制备方法是将不同于制备CMV病毒多克隆抗体的健康雄性兔或豚鼠或羊或鸡中的任一种动物致敏后，在肌肉内注射CMV病毒的衣壳蛋白使动物产生免疫，再对实验动物进行采血，将所采血进行抗血清的分离，收集到的血清加入千分之一浓度的叠氮钠保存于4℃，再将保存的血清进行柱层析，得到纯化的待标记的CMV病毒多克隆体IgG，再将辣根过氧化物酶溶于戊二醛溶液中，静置使体系充分反应后，再进行柱层析得酶溶液，将待标记的抗体用生理盐水稀释至5ml，搅拌下逐滴加入酶溶液中，再在其中加入0.2M赖氨酸0.25ml，混匀后在室温静置使体系反就充分，然后再滴加等体积的饱和硫酸铵，再经静置后离心处理，弃去上清物，留沉淀物用半饱和硫酸铵洗涤，再将其0.15MPH7.4的磷酸缓冲液中，再进行透析处理，将经透析所得液体离心处理，取上清液为酶标抗体。
3.根据权利要求2所述的检测试剂盒中反应板上包被的CMV病毒多克隆抗体与酶标抗体的制备方法，其特征是包被的CMV病毒多克隆抗体与酶标抗体的待标记的CMV病毒多克隆体IgG制备方法是将分离出的CMV病毒衣壳蛋白悬于用注射水配置的pH＝7.2，0.02M的磷酸盐缓冲液中，再将其用磷酸缓冲液稀释至浓度为200～500ug/ml，然后用等体积的弗氏完全佐剂混合并充分乳化，再给动物皮下多点注射免疫；两周后，将分离出的CMV病毒衣壳蛋白重悬于注射用水配置的pH＝7.2，0.02M的磷酸盐缓冲液PBS中，再将其稀释至浓度为200～500ug/ml，与等体积的由石蜡油∶羊膜脂＝7∶1的弗氏不完全佐剂混合并充分乳化，给前述动物皮下多点注射免疫；两周后再次重复前述步骤2次，在测定效价大于1∶64时采血，进行抗体分离。
4.根据权利要求2或3所述的检测试剂盒中反应板上包被的CMV病毒多克隆抗体与酶标抗体的制备方法，其特征是将分离所得25ml多抗血清中再加入等体积无菌生理盐水混匀，在搅拌下缓慢加入硫酸铵固体粉末至浓度为18％，再于25℃下温浴10～30分钟后，进行离心处理，弃去上清液，将沉淀溶解于去离子水中至体积为25ml，再在体系中加入硫酸铵粉末至浓度为14％，25℃温浴10～30min后再离心处理，弃去上清液，将沉淀溶解于15ml去离子水中，在pH为6.3浓度为0.07M的磷酸缓冲液PBS中透析至无铵离子，再进行柱层析，同时检测OD280，待有吸收峰出现，收集最先流出的10ml组分，即得到纯化IgG。
全文摘要
本发明公开黄瓜花叶病毒检测试剂盒以及制备方法。本发明的检测盒包括反应板、酶标抗体、缓冲液、显色液、终止液及洗涤剂。其中反应板上包被有CMV病毒多克隆抗体酶标抗体为辣根过氧化物酶标记的CMV抗体。本发明采用的免疫源为CMV病毒衣壳蛋白。采用由此免疫源产生的抗体，不仅对完整病毒有特异敏感性，而且对尚未形成完整病毒的病毒蛋白亚单位也有相当的敏感性。
文档编号G01N21/77GK1996020SQ20051002279
公开日2007年7月11日 申请日期2005年12月31日 优先权日2005年12月31日
发明者王若愚, 谢忠奎, 安黎哲, 王建辉 申请人:中国科学院寒区旱区环境与工程研究所