专利名称：：基于兔单克隆抗体的环丙沙星残留分析酶联免疫吸附试剂盒的制作方法
技术领域：
：本发明涉及试剂盒，尤其涉及一种基于兔单克隆抗体的环丙沙星残留分析酶联免疫吸附试剂盒。
背景技术：
：环丙沙星(环丙氟哌酸，ciprofloxacin,CPFX或CIP)，化学名1-环丙基_6-氟-1，4-二氢-4-氧代-7(1-哌嗪基)-3-喹啉羧酸。其为广谱高效药，它对G—杆菌的杀伤力特强，对耐药菌引起的严重感染也有效，是第三代氟喹诺酮类抗菌药物中抗菌活性较高的一种。该类药物吸收迅速、生物利用度高体内分布广泛，与其他抗生素无交叉耐药反应，是预防和治疗畜禽细菌性感染及支原体病的有效药物，其MIC在lyg/ml以下。但环丙沙星作为一种人畜共用药，其残留通过食物链对人体健康危害极大，不利于该类药物对人类疾病的治疗。所以必须十分重视环丙沙星在动物性食品中的残留问题。因此，开发出一种简单快速，适用于环丙沙星残留现场监控的痕量分析具有十分重要的现实意义。目前对环丙沙星残留检测的主要的方法是色谱法。其中HPLC法、液相色谱-串联质谱法虽然具有灵敏、准确等特点，但该方法前处理较复杂，所需仪器也较昂贵，需要有熟练的技术人员及且其分析周期较长，阻碍其推广应用。微生物法检测限过高，特异性不强，不够灵敏，一般多用于筛选。而免疫分析法具有一定的灵敏度和特异性，而且不需要昂贵的仪器设备，为环丙沙星提供了一个简单实用的分析检测途径。适用于大量样本的快速检测，ELISA检测方法已成为检测环丙沙星残留的发展趋势。兔单克隆抗体较常规的鼠单克隆抗体具有更多优点。首先，兔子相比于小鼠能识别更多免疫抗原的表位。其次，由于兔脾脏较大，可以进行更多的融合实验，使得高通量筛选融合细胞成为可能。本试剂盒应用杂交瘤技术得到环丙沙星兔单克隆抗体，开发出基于兔单克隆抗体的环丙沙星间接酶联免疫试剂盒，国内外均未见有报道。
发明内容本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种具有高特异性、高灵敏度的基于兔单克隆抗体的环丙沙星残留分析酶联免疫吸附试剂盒。基于兔单克隆抗体的环丙沙星残留分析酶联免疫吸附试剂盒包括盒体和设在盒体内的96孔酶标板以及试剂。96孔酶标板内包被有环丙沙星包被抗原，盒内的试剂如下(1)洗涤浓縮液；(2)稀释浓縮液；(3)环丙沙星标准溶液；(4)环丙沙星抗体；(5)辣根过氧化物酶标羊抗兔抗体；(6)底物稀释液；(7)底物;(8)底物显色液；(9)反应终止液。所述的环丙沙星包被抗原为环丙沙星与卵清蛋白的偶联产物，环丙沙星包被抗原能与抗环丙沙星抗体特异性结合；所述的洗涤浓縮液内含有氯化钠79g、磷酸二氢钾0.10.3g、磷酸氢二钠35g、氯化钾0.10.3g、吐温200.5lml和去离子水；所述的稀释浓縮液为含有氯化钠79g、磷酸二氢钾0.10.3g、磷酸氢二钠35g、氯化钾0.10.3g和去离子水；所述的环丙沙星抗体是兔单克隆抗体，是以兔子为免疫动物，经过杂交瘤技术最终得到的；所述的底物显色液为3，3，5，5_四甲基联苯胺配制液；所述的底物稀释液为pH5.0柠檬酸缓冲液，配方中含有36g柠檬酸、69g磷酸氢二钠和去离子水；所述的环丙沙星标准溶液的浓度为10ng/mL、5ng/mL、lng/mL、0.5ng/mL、0.lng/mL、0.05ng/mL;所述的底物为过氧化氢或过氧化脲；所述的反应终止液为2M硫酸或盐酸。本发明在环丙沙星检测中，IC50值为1.41ng/mL，抑制率曲线线性拟合方程y=0.0293x-l.3159，检测范围在0.19-10ng/mL之间，最低检测限是0.095ng/mL。试剂盒中的环丙沙星抗体具有较高的特异性，除了和几种喹诺酮类小分子有较低交叉率(其对恩诺沙星、氧氟沙星、诺氟沙星、氟罗沙星、培罗沙星的交叉反应率分别为28.8%，13.1%，11%，22.6%，20.4%)，和其他喹诺酮类小分子、抗生素及磺胺类药物均无交叉反应。本发明适用于牛奶、尿样等样品中环丙沙星残留的检测，尤其在牛奶检测中效果更好。该试剂盒能同时检测大批量样本，方便又快速，对现场监控痕量分析具有十分重要的现实意义；同时使检测成本大大降低，具有潜在的经济价值。图1是环丙沙星单抗间接竞争ELISA标准曲线；图2是尿液基质的环丙沙星单抗间接竞争ELISA标准曲线。具体的实施方式本发明基于兔单克隆抗体开发环丙沙星残留分析的间接酶联免疫吸附试剂盒，该试剂盒基于免疫反应和酶促反应，能够检测牛奶及尿样等样本中的环丙沙星的残留。基于兔单克隆抗体的环丙沙星残留分析酶联免疫吸附试剂盒包括盒体和设在盒体内的96孔酶标板以及试剂。96孔酶标板内包被有环丙沙星包被抗原，盒内的试剂如下(1)洗涤浓縮液；(2)稀释浓縮液；(3)环丙沙星标准溶液；(4)环丙沙星抗体；(5)辣根过氧化物酶标羊抗兔抗体；(6)底物稀释液；(7)底物；(8)底物显色液；(9)反应终止液。所述的环丙沙星包被抗原为环丙沙星与卵清蛋白的偶联产物，环丙沙星包被抗原能与抗环丙沙星抗体特异性结合；所述的洗涤浓縮液内含有氯化钠79g、磷酸二氢钾0.10.3g、磷酸氢二钠35g、氯化钾0.10.3g、吐温200.5lml和去离子水；所述的稀释浓縮液为含有氯化钠79g、磷酸二氢钾0.10.3g、磷酸氢二钠35g、氯化钾O.10.3g和去离子水；所述的环丙沙星抗体是兔单克隆抗体，是以兔子为免疫动物，经过杂交瘤技术最终得到的；所述的底物显色液为3，3，5，5_四甲基联苯胺配制液；所述的底物稀释液为pH5.0柠檬酸缓冲液，配方中含有36g柠檬酸、69g磷酸氢二钠和去离子水；所述的环丙沙星标准溶液的浓度为10ng/mL、5ng/mL、lng/mL、0.5ng/mL、0.lng/mL、40.05ng/mL;所述的底物为过氧化氢或过氧化脲；所述的反应终止液为2M硫酸或盐酸。盒内的试剂设置(1)洗涤浓縮液1瓶，2535mL/瓶，内含有氯化钠79g、磷酸二氢钾0.10.3g、磷酸氢二钠35g、氯化钾0.10.3g、吐温200.5lml，为正常使用浓度的3040倍；(2)稀释浓縮液1瓶，2535mL/瓶，内含有氯化钠79g、磷酸二氢钾0.10.3g、磷酸氢二钠35g、氯化钾0.10.3g，为正常使用浓度的3040倍；(3)环丙沙星标准溶液(10ng/mL、5ng/mL、lng/mL、0.5ng/mL、0.lng/mL、0.05ng/mL)各1瓶，lmL/瓶;(4)环丙沙星抗体1管，2550ii1/管，使用时20003000倍稀释；(5)辣根过氧化物酶标羊抗兔抗体(酶标二抗)1管，50-100Pl/管，使用时10002000倍稀释；(6)底物稀释液1瓶，2535mL/瓶，内含36g拧檬酸，69g磷酸氢二钠，为正常使用量的30-40倍；(7)底物1瓶，15mL/瓶，其为过氧化氢或过氧化脲；(8)底物显色液为四甲基联苯胺配制液1瓶，25mL/瓶，配制方法为10mgTMB溶于2mLDMS0中；(9)反应终止液1瓶，1520mL/瓶，其为2mol/L硫酸或盐酸。实施例1:环丙沙星免疫抗原及包被抗原的合成具体操作步骤如下将5.76mgNHS，20.64mgEDC，3.86mgCPFX加入0.23mlDMF中，室温，遮光，孵育24h(溶液I);26.4mgBSA加入2.3ml0.01MpH7.4PBS中(溶液II)。再将孵育后的溶液I逐滴加入溶液II中，边加边摇，于室温，磁力搅拌3h。反应混合物移入透析袋内，用O.01MpH7.4PBS透析去除游离的CPFX等小分子物质。包被抗原OVA-CPFX同法制备，用于包被酶标板。环丙沙星与载体蛋白的偶联原理如下秘)狡-COOHO注R-C00H为环丙沙星HO-0、-0为NHS:R-CO-NH-R为偶联产物实施例2:环丙沙星兔单克隆抗体的产生1、兔子的免疫初免将500i！g的免疫抗原与等量弗氏完全佐剂混合，完全乳化后，采用背部皮下5点注射白兔(lmL/只)；三周后用200yg的免疫抗原与弗氏不完全佐剂混合后同法进行第二次免疫；以后每两周免疫一次，共免疫37次后，血清效价达到64000以上时，用500iig的免疫抗原耳缘静脉注射，4天后颈动脉采全血，无菌取脾脏，准备细胞融合。2、兔单克隆抗体的制备兔子脾脏细胞与与处于对数生长期的240E进行细胞融合，以50%的PEG为融合齐U，HAT作为选择性培养基，铺于40块96孔板中。利用间接ELISA法筛选出阳性孔138个。将阳性孔细胞分装于24孔细胞培养板培养一周，运用间接ELISA法筛选出双阳性孔36个，再用间接竞争ELISA法从双阳性孔中筛选出亲和力高的l-4A，l-12H，2-6B，2-12A，2-12B五个编号的细胞进入亚克隆，每个细胞传代8孔培养，四周后采用间接ELISA法、间接竞争5ELISA法最后筛选出亲和力最好的2-6B-H进行扩大培养，生产单克隆抗体。实施例3:酶标板的包被环丙沙星包被抗原用pH9.6，0.05mol/L碳酸盐缓冲液(含2.93g碳酸氢钠和1.59g碳酸钠，溶于双蒸水或超纯水1L)稀释成4iig/mL，在酶标板的每孔加100yL，4°C包被12h或37t:包被2h，倾去包被液体，用PBST洗涤35次，拍干，然后在每孔中加入200iiL5X甘氨酸，37t:封闭1小时，取出后洗涤35次，干燥封膜后保存。实施例4:试剂盒的测定原理首先将环丙沙星与大分子载体蛋白偶联制成复合物作为包被抗原，并使包被抗原结合到某种固相载体表面，然后加入环丙沙星标准溶液或待测的样本(含待测的稀释样本)及环丙沙星兔单克隆抗体，环丙沙星标准溶液或待测样本与环丙沙星的包被抗原竞争性结合环丙沙星抗体，与包被抗原结合的抗体在加入酶标二抗后可以显现出颜色，与游离的环丙沙星小分子结合的抗体在洗涤时被除去。最后加入底物显色，环丙沙星标液或样本中环丙沙星含量越多，与固相抗原结合的抗体就越少，最后的发色反应减弱，抵制率就越高；反之，则发色反应增强，抑制率减低，因而先根据已知量环丙沙星的标准溶液获得抑制率与环丙沙星含量之间的半对数关系作图即得到标准曲线，再根据样本的抑制率来推出待测样本的浓度。实施例5:待测样本的前处理A、牛奶检测样品的前处理将鲜牛奶于4t:下10000rpm/min离心30min，弃去上层脂肪，准确吸取脱脂牛奶200uL于lmL离心管中，同时加入200uLPBS、400uL甲醇，于4。C下12000rpm/min离心30min，取上清液待测。B、尿液样品的前处理尿液用PBS稀释10倍后直接用于测量。实施例6:检测环丙沙星试剂盒的使用(1)试剂配制A、稀释浓縮液试剂盒中稀释浓縮液用超纯水或蒸馏水稀释3040倍后使用。B、洗涤浓縮液试剂盒中洗涤浓縮液用超纯水或蒸馏水稀释3040倍后使用。C、底物稀释液试剂盒中底物稀释液用超纯水或蒸馏水稀释3040倍后使用。(2)试剂盒操作过程如下A、试剂盒使用前需要室温稳定半小时以上。B、取出酶标板，加入50iU标样或待处理样本加入到各自孔中，标样和样本同时做2-4个重复，然后加入50iU稀释好的环丙沙星抗体，37t:孵育1小时。C、倒出孔中的液体，将微孔板倒置于吸水纸上拍打，以保证完全除去孔内的液体，用300iU洗涤液洗涤35次，拍干。D、加入稀释好的酶标二抗100ii1，反应40分钟。E、取底物显色液200iil加于底物缓冲液10mL中，再加入0.02%底物过氧化氢，振荡均匀后，每孔加入100iU以上配制好的显色溶液，轻微振板，37t:暗处孵育15分钟。F、加入50ii1终止液，测定0D450值判定结果。G、根据不同浓度标样的OD值计算抑制率，绘制ELISA标准曲线。H、根据样本测定的OD，值和稀释倍数，通过标准曲线计算样本中环丙沙星的测定含量ng/mL(即卯b，以lml液体为lg计算)。样本中环丙沙星含量=分析浓度X稀释倍数(卯b)。实施例7:ELISA试剂盒测定结果1、ELISA标准曲线及灵敏度以标准品浓度对数值为横坐标，相对的B/B。X100X值为纵坐标绘制线性标准曲线(B。标准品浓度为Ong/mL所对应的吸光值；B:其它各浓度所对应的吸光值)。曲线上测得达到50%抑制率时所对应的环丙沙星小分子的浓度值即为灵敏度。从图1环丙沙星ELISA平均测定的标准曲线中可知该曲线在O.0510ng/mL之间有良好的线性，达到10%抑制率环丙沙星的浓度值为0.095ng/mL，有较理想的灵敏度，IC50值为1.41ng/mL。2、ELISA的特异性采用间接竞争ELISA法，将系列浓度的恩诺沙星、诺氟沙星、氧氟沙星、培罗沙星、氟罗沙星等喹诺酮类小分子，以及氯霉素、土霉素、新霉素、四环素、磺胺嘧啶、磺胺二甲嘧啶、磺胺甲恶唑几种常用兽药与环丙沙星兔单克隆抗体同时加入到96孔酶标板中，以抑制率为纵坐标，各样品浓度对数为横坐标绘制标准曲线，分别计算各自的ICs。值。再根据环丙沙星兔单克隆抗体相对环丙沙星小分子的IC5。值与环丙沙星兔单克隆抗体相对各种竞争物的IC5。值的比值即得到交叉反应率(CR%)。对其它药物的交叉率结果见表1表3。IC50(环丙沙星)CR%=-x100%IC50(其他小分子)表1与喹诺酮类的交叉反应性竞争物IC50(ng/mL)CR%环丙沙星1.47100恩诺沙星5.128.8氧氟沙星11.213.1诺氟沙星13.411氟罗沙星6.522.6培罗沙星7.220.4表2与部分抗生素的交叉反应性7竞争物IC50(ng/mL)CR%氯霉素>106<0細5土霉素>105〈0.005新霉素>105<0.005四环素>106<0細5表3与部分磺胺类药物交叉反应性竞争物IC50(ng/mL)CR%磺胺嘧啶>105<0.005阳能磺胺二甲嘧啶>105O.005磺胺甲恶唑>105O.0053、ELISA的精确度与准确度测定添加环丙沙星到牛奶中使其浓度为0.4ng/mL、2ng/mL、4ng/mL，每个浓度设八个重复进行测定；在尿样中添加环丙沙星使其浓度为5ng/mL、10ng/mL、50ng/mL、100ng/mL，每个浓度设四个重复分别进行测定。牛奶稀释4倍后并添加三个浓度的环丙沙星标准液0.4ng/mL、2ng/mL、4ng/mL，检测结果见表4，平均回收率分别为77.12%、84.6%和63.02%，变异系数分别为12.2%、6.26%、11.6%。回收率在63.02%-84.6%之间，变异系数在6.26%-12.2%之间。检测范围在0.76ng/mL-40ng/mL，其最低检测限达到0.38ng/mL。表4鲜牛奶ELISA准确性试验结果添加量重复数平均测定值回收率变异系数(ng/mL)(N)(ng/mL)(%)(%)0.480.31±0.0577.1212.2281.69±0.1684.66.26482.52±0.5263.0211.6由于PBS缓冲体系建立标准曲线在检测尿液时回收率不太理想，通过以尿液为基质又建立一条标准曲线如图2。尿液中添加量为5ng/mL、10ng/mL、50ng/mL、100ng/mL，检测结果见表5，其回收率在83.34%-118.8之间，变异系数介于4.51%-17.12%，最低检测限为lng/mL。表5尿液中ELISA准确性试验结果<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>权利要求一种基于兔单克隆抗体的环丙沙星残留分析酶联免疫吸附试剂盒，其特征在于包括盒体和设在盒体内的96孔酶标板以及试剂，96孔酶标板内包被有环丙沙星包被抗原，盒内的试剂如下(1)洗涤浓缩液；(2)稀释浓缩液；(3)环丙沙星标准溶液；(4)环丙沙星抗体；(5)辣根过氧化物酶标羊抗兔抗体；(6)底物稀释液；(7)底物；(8)底物显色液；(9)反应终止液。2.根据权利要求1所述的基于兔单克隆抗体的环丙沙星残留分析酶联免疫吸附试剂盒，其特征在于所述的环丙沙星包被抗原为环丙沙星与卵清蛋白的偶联产物，环丙沙星包被抗原能与抗环丙沙星抗体特异性结合。3.根据权利要求1所述的基于兔单克隆抗体的环丙沙星残留分析酶联免疫吸附试剂盒，其特征在于所述的洗涤浓縮液内含有氯化钠79g、磷酸二氢钾0.10.3g、磷酸氢二钠35g、氯化钾0.10.3g、吐温200.5lml和去离子水。4.根据权利要求1所述的基于兔单克隆抗体的环丙沙星残留分析酶联免疫吸附试剂盒，其特征在于所述的稀释浓縮液为含有氯化钠79g、磷酸二氢钾0.10.3g、磷酸氢二钠35g、氯化钾0.10.3g和去离子水。5.根据权利要求1所述的基于兔单克隆抗体的环丙沙星残留分析酶联免疫吸附试剂盒，其特征在于所述的环丙沙星抗体是兔单克隆抗体，是以兔子为免疫动物，经过杂交瘤技术最终得到的。6.根据权利要求1所述的基于兔单克隆抗体的环丙沙星残留分析酶联免疫吸附试剂盒，其特征在于所述的底物显色液为3，3，5，5-四甲基联苯胺配制液。7.根据权利要求1所述的基于兔单克隆抗体的环丙沙星残留分析酶联免疫吸附试剂盒，其特征在于所述的底物稀释液为pH5.0柠檬酸缓冲液，配方中含有36g柠檬酸、69g磷酸氢二钠和去离子水。8.根据权利要求1所述的基于兔单克隆抗体的环丙沙星残留分析酶联免疫吸附试剂盒，其特征在于所述的环丙沙星标准溶液的浓度为10ng/mL、5ng/mL、lng/mL、0.5ng/mL、0.lng/mL、0.05ng/mL。9.根据权利要求1所述的基于兔单克隆抗体的环丙沙星残留分析酶联免疫吸附试剂盒，其特征在于所述的底物为过氧化氢或过氧化脲。10.根据权利要求1所述的基于兔单克隆抗体的环丙沙星残留分析酶联免疫吸附试剂盒，其特征在于所述的反应终止液为2M硫酸或盐酸。全文摘要本发明公开了一种基于兔单克隆抗体的环丙沙星残留分析酶联免疫吸附试剂盒，该试剂盒在环丙沙星检测中，IC50值为1.41ng/mL，抑制率曲线线性拟合方程y＝0.0293x-1.3159，检测范围在0.19-10ng/mL之间，最低检测限是0.095ng/mL。试剂盒中抗环丙沙星抗体具有较高的特异性，除了和其他喹诺酮类小分子有较低交叉率，对恩诺沙星、氧氟沙星、诺氟沙星、氟罗沙星、培罗沙星的交叉反应率分别为28.8％，13.1％，11％，22.6％，20.4％。和其他抗生素以及磺胺类药物均无交叉反应。本发明适用于牛奶、尿样等样本中环丙沙星残留的检测。该试剂盒能同时检测大批量样本，方便又快速，对现场监控痕量分析具有十分重要的现实意义；同时使检测成本大大降低，具有潜在的经济价值。文档编号G01N33/577GK101699292SQ20091015325公开日2010年4月28日申请日期2009年10月29日优先权日2009年10月29日发明者倪庚,刘娜,郑晓冬,陆蕾,黄斌申请人:浙江大学