口蹄疫病毒非结构蛋白抗体酶联免疫检测试剂盒的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种口蹄疫病毒非结构蛋白抗体酶联免疫检测试剂盒。它包括口蹄疫病毒非结构蛋白3B抗原表位多肽包被的酶联反应板和酶标记抗抗体；所述口蹄疫病毒非结构蛋白3B抗原表位多肽为序列表中序列1所示的多肽。本试剂盒使用化学合成非结构蛋白3B抗原肽包被反应板，抗原用量少、灵敏性和特异性高，可以高效地检测是否存在口蹄疫病毒感染。本发明试剂盒特异性好、敏感、高效，具有良好的市场前景。
【专利说明】口蹄疫病毒非结构蛋白抗体酶联免疫检测试剂盒
【技术领域】
[0001]本发明属于生物【技术领域】，更具体地，本发明涉及一种口蹄疫病毒结构蛋白抗体酶联免疫检测试剂盒，特别是口蹄疫病毒结构蛋白VPl抗体酶联免疫检测试剂盒。
【背景技术】
[0002]口蹄疫(Foot-and-Mouth Disease, FMD)是世界范围内广泛分布，在国际间传播蔓延的全球性流行性传染病。国际兽医局(OIE)在1984年修订的动物传染病分类中将口蹄疫列为A类传染病之首。口蹄疫是由口蹄疫病毒感染引起偶蹄目动物发生的烈性传染病。常在牛群及猪群大范围流行。口蹄疫的致死率很低，但是感染率很高。发病的主要症状为:口腔粘膜、舌、唇、鼻镜、蹄叉、乳头等部位发生水疱，破溃形成烂斑，病畜蹄痛卧地、严重者蹄壳边缘溃裂或脱壳。不同动物的症状稍有不同，妊娠母牛可能流产，而后导致繁殖力降低；猪则以破蹄为最主要症状；山羊和绵羊的症状通常比牛温和。口蹄疫传染性高，传播迅速，感染猪、牛、羊等牲畜常导致幼畜死亡，成年动物生产能力急剧下降，严重危害畜牧业的发展和畜产品的生产供应。同时会引发流行国家或地区动物及动物产品的市场流通，并使其国际贸易受到及大的封锁和限制，给流行国家和地区的畜牧业生产造成了巨大经济的损失。因此口蹄疫历来受到各国政府的高度重视。
[0003]口蹄疫病毒(Foot-and-Mouth Disease Virus, FMDV)属于小核糖核酸病毒,该群病毒的其他成员包括普通感冒病毒和天花病毒等。口蹄疫病毒(FMDV)具有多型性、易变性等特点。目前，已知全世界有?个血清型:A、O、C、Satl (南非I型)、Sat2 (南非II型)、Sat3(南非III型)和AsiaI (亚洲I型)。每个型又分若干亚型，目前发现的亚型有70多个。由于不断发生抗原漂移，因此并不能严格区分亚型。FMDV由一条核酸RNA链和衣壳蛋白组成，基因组RNA全长约8.5kb，可直接作为信使RNA，FMDV基因组RNA由5’ UTR、3’ UTR和OFR组成。5’^^长约1300社，含有￥?8、二级结构、？10基因、？017((:)区段和内部核糖体进入位点等(IRES)。3，UTR由Poly(A)尾和大0RF3，末端与Poly(A)区段5，末端之间92个nt残基组成，长172nt。大ORF由L基因(P20a)、P1结构蛋白基因、P2和P3非结构蛋白基因以及起始密码子和终止密码子组成。以L、P1、P2和P3的顺序依次排列，长约6.5Kb。其中基因组的3D区段是编码FMDV的RNA聚合酶的，是病毒复制中不可缺少的成分。Pl结构蛋白基因编码4中主要的结构蛋白VP1、VP2、VP3和VP4，它们各60个组成了 FMD的外壳蛋白。
[0004]口蹄疫病毒基因所编码产生的非结构蛋白有L、2A、2BC、3AB、3ABC、3D等，其中L蛋白的免疫原性比其他非结构蛋白弱，感染动物不一定能产生抗体，即使产生抗体，维持的时间也比较短。病 毒感染动物可产生抗2B抗体，但这种抗体在ELISA反应中重复性不好，不能作为检测抗体。2C抗体由于消退的比3ABC快，且免疫牛中可检测到2C抗体，因此也不能作为检测指标。3D又称病毒感染相关抗原，没有型特异性，检测其抗体水平是评价动物是否接触过抗原的重要指标，也是国际贸易必检项目。目前认为仅检测3D抗体不能区分感染动物与免疫动物，因为疫苗中往往含有痕量的非结构抗原，经过多次免疫后，在免疫动物体内也能检测到3D抗体。3ABC聚蛋白中，3A免疫原性最强，3C免疫原性较弱。许多资料认为3ABC作为感染的标志可信度较大。检测3ABC抗体是确诊感染的重要指标。
[0005]目前，口蹄疫的防治主要依靠疫苗免疫。我国对口蹄疫施行强制性免疫，每年春秋进行一次集中免疫，两次之间对新补栏家畜及时进行补免。在实际生产中如何鉴别诊断易感动物是进行了疫苗免疫还是感染了口蹄疫病毒对口蹄疫防疫体系的建立、检验检疫都是十分重要的。世界各国也在该领域开展了广泛的研究。ELISA方法具有特异、敏感、快速、简便、可靠性好等特点，且能自动化操作，并能迅速的检测大量样品，在FMD的诊断中日益受到人们的重视，现已成为国际上检测易感动物猪、牛等是否疫苗免疫或感染病毒的常规方法之一。
[0006]意大利的De等(1997)研制出基于3ABC蛋白的间接捕获ELISA技术，并可区分野毒感染和疫苗毒感染。丹麦的Sorensen等(1998)开发出以杆状病毒表达的抗原所构建的ELISA方法，可分别检测非结构蛋白3AB、3ABC、3D，其中3AB、3ABC、3DELISA均可检测FMDV的7种血清型病毒抗体。德国的Bruderer (2004)也成功建立了 3ABC ELISA方法。谢庆阁等(2003)利用大肠埃希氏菌表达的口蹄疫病毒非结构蛋白3ABC多肽作为抗原建立了一种可以区分FMDV感染与疫苗免疫的间接酶联免疫吸附试验。尤永进、朱彩珠等(2003)以同样的原理建立基于非结构蛋白3ABC的ELISA检测方法。
[0007]现有的基于非结构蛋白的酶联免疫吸附检测方法使用的反应板包被的大多是3ABC、3AB，且大都是通过原核表达的方法得到非结构蛋白的包被抗原。此类原核表达的蛋白产物中含有少量的载体蛋白和宿主菌蛋白，完全去除它们是很困难，这些杂蛋白就会与检测样品产生非特异性的结合，从而影响了检测结果的准确性。
[0008]口蹄疫是关系到国 家经济安全的重大动物疫病，相关关键技术应该牢牢掌握在自己手里。一旦我们拥有自主知识产权，将利于保障我国的经济安全。
【发明内容】
[0009]本发明的目的是提供一种新的用于口蹄疫易感动物猪疫苗免疫与病毒感染的鉴别诊断的酶联免疫检测试剂盒。
[0010]本发明的口蹄疫病毒非结构蛋白抗体酶联免疫检测试剂盒，包括口蹄疫病毒非结构蛋白3B抗原表位多肽包被的酶联反应板和酶标记抗抗体；所述口蹄疫病毒非结构蛋白3B抗原表位多肽为序列表中序列I所示的多肽。
[0011]所涉及的包被抗原采用固相化学合成的方法生产，包被抗原含有口蹄疫病毒非结构蛋白3B的主要抗原位点多肽，可与口蹄疫病毒感染后产生的非结构蛋白3B抗体特异结
八
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[0012]所述酶标记抗抗体的标记酶为辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶；所述酶标记抗抗体为酶标记兔抗猪IgG ;所述酶标记抗抗体优选为辣根过氧化物酶标记的兔抗猪IgG多克隆抗体。
[0013]所述酶联反应板为可拆卸96孔酶标板；所述口蹄疫病毒非结构蛋白3B抗原表位多肽为化学人工合成得到。
[0014]本发明通过以下方式实现:采用口蹄疫病毒非结构蛋白3B的人工化学合成多肽包被的可拆96孔聚苯乙烯酶联反应板。同时，试剂盒中含有以辣根过氧化物酶标记的兔抗猪的IgG多克隆抗体酶结合物，阴性对照血清，阳性对照血清，样品稀释液，TMB底物溶液，20X浓缩洗涤液和终止液等组分。以间接酶联免疫吸附试验(ELISA)方法检测样品中的3B蛋白抗体。
[0015]所涉及的酶联反应板的最佳制备条件是:包被时将多肽抗原溶于PH9.4的碳酸盐溶液，然后加到96孔聚苯乙烯酶联反应板，每孔50ng抗原，在37°C放置2_4h，再4_8°C下放置过夜(8-12小时)使多肽抗原与酶联反应板充分结合。然后按照300ul/孔加入含l%(g/ml)牛血清白蛋白(BSA)的PBS缓冲液(PH=7.4)，37°C封闭处理l_2h，洗涤后甩干，待酶联反应板干燥后密封4°C保存。
[0016]所述试剂盒中含有显色液和终止液；当标记酶为辣根过氧化物酶时显色液由显色液A液和显色液B液组成,所述显色液A液为含0.2%(g/ml)过氧化氢尿素的柠檬酸磷酸盐缓冲液，所述显色液B液为0.2mg/ml的四甲基联苯胺溶液；使用时两者以1:1的比例混合。当标记酶为碱性磷酸酶时，显色液为4-硝基酚磷酸盐缓冲液。所述终止液为2mol/L的硫酸溶液。
[0017]所述试剂盒还包括阴性对照血清、阳性对照血清；所述阴性对照血清为用无口蹄疫抗体的正常猪血清；所述阳性对照血清为以所述口蹄疫病毒非结构蛋白3B抗原表位多肽为免疫原免疫猪得到的血清；
[0018]所涉及的阳性对照血清具体是以人工化学合成的非结构蛋白3B抗原表位多肽作为免疫原，免疫25-35日龄无特定病源体(SPF)猪，制备高免血清，加入1000U/ml链霉素和青霉素，过滤径为0.2 μ m的滤膜除菌，作为试剂盒的阳性对`照血清。
[0019]所涉及的阴性对照血清具体是用无口蹄疫抗体的正常猪血清，加入1000U/ml链霉素和1000U/ml青霉素，过滤径为0.2 μ m的滤膜除菌，作为试剂盒阴性血清。
[0020]所述试剂盒还包括样品稀释液和浓缩洗漆液；样品稀释液为含有3%(g/ml)BSA的0.15M、pH为7.4的PBS缓冲液(过滤径为0.45 μ m滤膜);所述浓缩洗涤液为0.15Μ，ρΗ7.4，含有0.5% (ml/ml) Tween-20的磷酸盐缓冲液(经过滤径为0.2 μ m的滤膜除菌)。
[0021]本发明试剂盒的检测程序为:
[0022]1.平衡:将试剂盒从冷藏环境中取出，置室温平衡30分钟后使用，液体试剂用前混匀。
[0023]2.配液:将浓缩洗涤液用蒸馏水或去离子水20倍稀释备用。
[0024]3.设定:留I个空白孔，3个阴性对照孔，和2个阳性对照孔，其余为待测样本孔。
[0025]4.待测标本预稀释:往稀释板孔内每孔加100 μ I样本稀释液，分别加入5 μ I待测样本。
[0026]5.加样:空白孔不加样；3个阴性对照孔各加100μ I阴性对照，2个阳性对照孔各加100 μ I阳性对照；其余孔分别按预先设定加100 μ I稀释的待测样本。加样过程时间跨
度应尽量短。
[0027]6.温育:震荡混匀，置37°C温箱或水浴锅中，反应30分钟。
[0028]7.洗板:弃去反应液，每孔加入稀释后的洗涤液300μ 1，浸泡15秒，甩弃洗液。连续洗板4次后拍干。
[0029]8.加酶:空白孔不加酶；其余各孔加100 μ I辣根过氧化物酶标记兔抗猪IgG抗体(艳红色)。[0030]9.温育:置37°C温箱或水浴锅中，反应30分钟。
[0031]10.洗板:弃去反应液，每孔加入稀释后的洗涤液300μ 1，浸泡15秒，甩弃洗涤液。连续洗板5次后拍干。
[0032]11.显色:每孔(包括空白对照孔)依次加入显色底物液Α、显色底物液B各50 μ 1，震荡混匀，置37°C温箱或水浴锅中，显色15分钟。
[0033]12.终止:每孔(包括空白对照孔)加入显色终止液各50 μ I，振荡混匀终止反应。
[0034]13.测定:用空白对照孔调零后测定各孔450nm的OD值。也可用双波长450nm/630nm测定各孔OD值。
[0035]本发明试剂盒的检测结果的判定:
[0036]1.阴性对照OD平均值应该< 0.2，否则无效。
[0037]2.阳性对照每个检测值应该在0.6到1.8之间，否则无效。
[0038]3.临界值的计算:临界值=0.17X阳性对照平均OD值。
[0039]4.结果判定:样本测定OD值>临界值者判为阳性；样本测定OD值〈临界
[0040]值者判为阴性(建议对OD值〈临界值，^ 0.5倍临界值的样本跟踪观察)。本发明的积极效果在于:本发明采用生物信息学方法对非结构蛋白的抗原表位进行精确分析，从3B蛋白上的主要抗原表位上筛选出适合ELISA检测用的肽段。同时，采用先进的固相合成肽技术合成多肽抗原用于包被酶标反应板以及制备试剂盒中的阳性对照血清。
[0041]由于试剂盒中使用的包被抗原是化学合成多肽，不含杂蛋白，纯度高，特异性强，灵敏度高，因此可以有效地检测口蹄疫非结构蛋白抗体，以判断被检动物是否感染口蹄疫病毒。实验结果表明，试剂盒重复性好，特异性强，灵敏度高。可以有效地检测口蹄疫病毒感染后产生的非结构蛋白抗体，以判断被检动物是否感染口蹄疫病毒。能满足不同层次人员的需要，具有广阔的市场前景和良好的经济、社会效益。
[0042]本试剂盒采用化学合成3B抗原肽包被反应板，抗原用量少、灵敏性和特异性高，可以高效地鉴别口蹄疫易感动物猪是感染了病毒还是接受了疫苗免疫。同时可以根据结果进行免疫效果的评价。本发明试剂盒特异性好、敏感、高效，具有良好的市场前景。
[0043]本发明所涉及的口蹄疫病毒非结构蛋白酶联免疫吸附试验诊断试剂盒用于口蹄疫易感动物猪疫苗免疫与病毒感染的鉴别诊断，有利于减少我国口蹄疫爆发所带来的损失，也有利于我国口蹄疫防控体系的建立。
【具体实施方式】
[0044]下述实施例中的方法，如无特别说明，均为常规方法。
[0045]实施例1、口蹄疫病毒非结构蛋白抗体酶联免疫检测试剂盒包被抗原制备
[0046]本发明采用生物信息学方法对非结构蛋白的抗原表位进行精确分析，从3B蛋白上的主要抗原表位上筛选出适合ELISA检测用的肽段，即口蹄疫病毒非结构蛋白3B抗原表位多肽，其序列如序列表中序列I所示。将该多肽作为本发明试剂盒的包被原制备口蹄疫病毒非结构蛋白酶联免疫检测试剂盒。
[0047]本发明的包被抗原可使用Applied Biosystem全自动多肽合成仪(型号433A)制备。运用 Merrifield 固相合成法，米用的是Fmoc (9_fIuorenylmethyloxycarbonyl, 9_荷甲氧羰基)修饰的氨基酸，使用Rink Amide MBHA树脂做为固相载体。生产过程包括多肽抗原固相合成、多肽裂解和鉴定、抗原纯化、冷冻干燥以及保存五部分。以下分别进行说明:
[0048]一、包被抗原固相合成
[0049]1、合成试剂的准备
[0050]合成包被抗原氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
[0051]依据包被抗原序列以及合成规模准备合适的Fmoc修饰的氨基酸(购自NOVA公司)，加入至相应的Cartridge中。同样按要求合成规模称取树脂5g，放入反应腔，将上下盖子拧紧，贴标签，记录所合成肽的名称，批号，反应腔的TARE及所称树脂的重量。将反应腔装入合成仪。配制适量的合成试剂包括100%的NMP、3%的AM (已酰咪唑)、35%的PIP(哌啶)、100%的MeOH (甲醇)等放置到相对应的试剂瓶中。
[0052]2、合成仪状态的检测
[0053]检查433A多肽合成仪器是否正常运行，开机后，运行Run Self Test程序，仪器自检各项指标是否正常。另外检查氮气是否充足，系统表压是否正常(433A正常表压
10.2psi)。合成前应对仪器的性能有所了解，所以要对每种合成试剂的流速进行测定。433A合成仪:发送 Flow Ratel-18 到合成仪,选择 Main Menu一Module Test一按 Prer 或 next找 Module A、ModuleD、Module1、Module1、Module A) 一按 Start—按 more 进行测量或观察，若流量不合适，则调节下阀门压力，直至达到要求(具体检测要求见下表1 )。
[0054]表1.多肽合成仪流速检测标准表
[0055]
【权利要求】
1.一种多肽，为序列表中序列I所示。
2.—种口蹄疫病毒非结构蛋白抗体酶联免疫检测试剂盒，包括口蹄疫病毒非结构蛋白3B抗原表位多肽包被的酶联反应板和酶标记抗抗体；所述口蹄疫病毒非结构蛋白3B抗原表位多肽为序列表中序列I所示。
3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于:所述酶标记抗抗体的标记酶为辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶；所述酶标记抗抗体为酶标记兔抗猪IgG，所述酶标记抗抗体优选为辣根过氧化物酶标记的兔抗猪IgG多克隆抗体。
4.根据权利要求2或3所述的试剂盒，其特征在于:所述酶联反应板为可拆卸96孔酶标板；所述口蹄疫病毒非结构蛋白3B抗原表位多肽为化学人工合成得到。
5.根据权利要求2或3所述的试剂盒，其特征在于:所述口蹄疫病毒非结构蛋白3B抗原表位多肽包被的酶联反应板的获得方法是将所述口蹄疫病毒非结构蛋白3B抗原表位多肽溶于100 μ I的ρΗ9.4的碳酸盐溶液，然后加到96孔聚苯乙烯酶联反应板，每孔50ng抗原，在37°C放置2-4小时，再4-8°C下放置8_12小时使多肽抗原与酶联反应板充分结合，然后按照300 μ I/孔加入含有lg/100ml牛血清白蛋白pH7.4的PBS缓冲液，37°C封闭处理1-2小时，洗涤后甩干，待酶联反应板干燥后4°C密封保存。
6.根据权利要求1-4中任意一项所述的试剂盒，其特征在于:所述试剂盒中还含有显色液和终止液；当标记酶为辣根过氧化物酶时显色液由显色液A液和显色液B液组成，所述显色液A液为含0.2g/100ml过氧化氢尿素的柠檬酸磷酸盐缓冲液,所述显色液B液为0.2mg/ml的四甲基联苯胺溶液；当标记酶为碱性磷酸酶时，显色液为4-硝基酚磷酸盐缓冲液；所述终止液为2mol/L的硫酸溶液。
7.根据权利要求6所`述的试剂盒，其特征在于:所述试剂盒还包括阴性对照血清、阳性对照血清；所述阴性对照血清为无口蹄疫抗体的正常猪血清；所述阳性对照血清为以所述口蹄疫病毒结构蛋白VPl抗原表位多肽为免疫原免疫猪得到的血清。
8.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于:所述试剂盒还包括样品稀释液和浓缩洗涤液；样品稀释液为含有3g/100mlBSA的0.15M、PH为7.4的PBS缓冲液；所述浓缩洗涤液为0.15M，pH7.4，含有体积百分含量为0.5%的Tween-20的磷酸盐缓冲液。
9.根据权利要求1-8中任意一项所述的试剂盒，其特征在于:所述口蹄疫病毒为猪O型口蹄疫病毒；具体可为猪口蹄疫0R/80病毒。
10.权利要求1所述的多肽或者权利要求2-9的试剂盒在制备检测是否感染动物口蹄疫病毒病的试剂盒中的应用；其中，动物口蹄疫病毒病为猪口蹄疫病毒病；具体为猪O型口蹄疫病毒引起的猪口蹄疫病毒病；更具体为猪口蹄疫0R/80病毒引起的猪口蹄疫病毒病。
【文档编号】G01N33/68GK103864906SQ201410092728
【公开日】2014年6月18日 申请日期:2014年3月13日 优先权日:2014年3月13日
【发明者】肖进, 齐鹏, 董春娜, 王楠, 赵洪涛, 张蕾, 张欣, 张艳宾, 张君, 李凤鸣, 郑应华 申请人:中牧实业股份有限公司