P16^INK4a双抗体夹心酶联免疫吸附检测试剂盒的制作方法

专利名称：P16^INK4a双抗体夹心酶联免疫吸附检测试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及免疫试剂产品领域。
背景技术：
P16W"a蛋白是抑癌基因产物，但在多种人体肿瘤中过度表达， 特别是在宫颈癌及癌前病变中几乎100%的表达，而在正常的宫颈
上皮细胞不表达。同时，P161NK4a也在肺癌、食道癌等多种肿瘤中
表达。P16"^"是多种人类肿瘤相关标志物。近些年国内外是在病
理组织切片上，采用免疫组织化学方法检测P16INK4a，将其用于科 学研究或用于辅助病理诊断。目前国内外有酶联免疫吸附检测试剂 盒，它包括亲和素一过氧化物酶复合物、显色液、反应终止液、阳 性对照品、抗体稀释液、浓縮洗涤液，但其用于癌症筛查敏感性、 特异性、准确性不够高。

发明内容
本发明的目的就是针对现有酶联免疫吸附检测试剂盒用于癌 症筛查敏感性、特异性、准确性不够高之不足，而提供将一种敏感 性、特异性、准确性高的P16^K"双抗体夹心酶联免疫吸附检测试剂盒。
P16INK4a双抗体夹心酶联免疫吸附检测试剂盒，包括亲和素一 过氧化物酶复合物、显色液、反应终止液、阳性对照品、抗体稀释 液、浓缩洗涤液，它还有P16^K"多克隆抗体包被的酶标板、生物 素标记的P16^K"单克隆抗体。
本发明的优点是我们将P16WK"双抗体夹心酶联免疫吸附检 测试剂盒在小样本的人群筛査中应用已经获得成功。我们用
P16^K"酶联免疫吸附检测试剂盒检测20例肺癌患者痰标本，其中 8例阳性，对照的15例正常人痰标本均为阴性。我们在1356例宫 颈标本中，采用P16^K"双抗体夹心酶联免疫吸附检测试剂盒进行 宫颈癌筛查，其敏感性为87.80%，特异性为92.43%，总体符合率 为91.59%，阴性预测值为97.16%。 P16^K"双抗体夹心酶联免疫 吸附检测试剂盒用于宫颈癌筛查其敏感性和特异性均高于目前临 床广泛应用的细胞学筛查结果，两者相比差异有显著性。证明P16^k"双抗体夹心酶联免疫吸附检测试剂盒可以用于癌症筛查。
本发明使用简便，检测结果快速、准确、客观，能同时检测大量样 本，适用于大样本人群的癌症筛查，检测成本比传统的癌症筛查方 法低。
具体实施例方式
一、材料与方法
1. 标本收集收集宫颈标本1356例。接受实验妇女年龄在 24—70之间，均已婚且无宫颈手术史。所有病例首先用无菌棉签 拭子在宫颈口旋转2周提取脱落细胞，然后用无菌细胞刷获取宫颈 脱落细胞行新柏氏液基细胞学(TCT)检查。棉签拭子提取的宫颈 脱落细胞与TCT保存液固定的宫颈脱落细胞均采用P16WK"酶联免 疫吸附试剂盒，检测pl6^k"蛋白的表达。在阴道镜下行宫颈活体 组织取材行病理组织学检查。收集20例肺癌患者痰标本，15例 正常人痰标本。
2. 脱落细胞中P16"^"蛋白提取汲取细胞保存液5ml，用生 理盐水离心洗涤2次，加入300. 1蒸馏水于-2(TC充分冻融2次以裂 解细胞，离心取上清-20。C保存备用。
3. P16INK4a酶联免疫吸附试剂盒检测P161NK4a的表达用
P16^k"多克隆抗体包被酶标板4"C过夜，用5%脱脂牛奶(PBS配 制)于37"C封闭2小时。检测时取出标本蛋白样品并于酶标板中 每孔加入100. 1于4'C反应过夜，然后加入酶标P16^k"单克隆抗 体于37'C孵育1小时，四甲基联苯二胺(TMB)显色液，450/620nm 双波长测定吸光度。每个样本设2个重复孔，用已知免疫组织化学 方法检测pl6WK"蛋白表达强阳性的宫颈癌新鲜细胞样本设为阳性 对照，用已知免疫组织化学方法检测pl6WK"蛋白表达阴性的宫颈 炎新鲜细胞样本及PBST为阴性对照。
4.结果判读P16^k"酶联免疫吸附试剂盒检测宫颈脱落细胞 中P16^k"蛋白结果判读以新柏氏液基细胞学检查判读为无宫颈 上皮内瘤变或恶性肿瘤，病理诊断为宫颈炎的150例新鲜宫颈脱落 细胞标本吸光度平均值记为Mod,标准差记为SD。统计学显示， 个体样本的吸光度(ODi)落在M0D±3SD的可能性为99%，我们 以0Di<M0D+3SD判读为阴性，MOD+3SD. 0Di<M0D+6SD判 读为弱阳性(+ )， M0D+6SD. ODi〈MoD+9SD判读为中等阳性(+ + )， ODi. MoD+9SD判读为强阳性(+ + + )。
5.统计学处理采用二分法进行计数统计，P16"^"酶联免疫 吸附试剂盒检测P16皿"蛋白以弱阳性(+ )为阈值。采用SPSS10.0 统计学软件进行统计学分析，以p<0.05判断为差异具有显著性。
二、实验结果
1、 P16^K"双抗体夹心酶联免疫吸附检测试剂盒检测新鲜提取 蛋白的宫颈脱落细胞中pl6INK4a蛋白表达敏感性为87.80%，特 异性为92.43%。用P16^K"双抗体夹心酶联免疫吸附检测试剂盒 检测CIN1级宫颈脱落细胞标本pl6INK4a的表达敏感性为83. 2% ， 而CIN2、 CIN3和宫颈癌标本pl6INK4a的敏感性达到92. 56% ，两 者相比差异有高度显著性(P<0.001)。 P16WK"双抗体夹心酶联免 疫吸附检测试剂盒检测pl6INK4a在CIN及宫颈癌脱落细胞标本中 的表达强度明显高于炎性病变标本(p<0.001)。
P16INK4a双抗体夹心酶联免疫吸附检测试剂盒检测新鲜提取蛋 白的宫颈脱落细胞中pl6"^"蛋白表达敏感性为87.80%， TCT的 敏感性为82.93%，两者相比差异有显著性(p = 0.023); P16INK4a 双抗体夹心酶联免疫吸附检测试剂盒检测新鲜提取蛋白的宫颈脱 落细胞pl6""K"蛋白表达特异性为92.43%， TCT的特异性为88.11 %，两者相比差异有高度显著性(p<0.001)
2、 P16^"a酶联免疫吸附检测试剂盒检测20例肺癌患者痰标 本，其中8例阳性，对照的15例正常人痰标本均为阴性。
三、结论
P16INK4a双抗体夹心酶联免疫吸附检测试剂盒检测新鲜提取蛋 白的脱落细胞中pl6"^"蛋白，用于筛查宫颈癌敏感性和特异性均 优于TCT检测。P16WK"双抗体夹心酶联免疫吸附检测试剂盒用于 癌症筛查具有准确、快速、方便、价格低廉的优势，且能够用仪器 操作并给出客观的判读结果而不受检查医师的主观因素影响，更适 用于大规模的人群筛查。
权利要求
1、P16INK4a双抗体夹心酶联免疫吸附检测试剂盒，包括亲和素—过氧化物酶复合物、显色液、反应终止液、阳性对照品、抗体稀释液、浓缩洗涤液，其特征在于它还有P16INK4a多克隆抗体包被的酶标板、生物素标记的P16INK4a单克隆抗体。
全文摘要
P16^INK4a双抗体夹心酶联免疫吸附检测试剂盒，包括亲和素-过氧化物酶复合物、显色液、反应终止液、阳性对照品、抗体稀释液、浓缩洗涤液，其特征在于它还有P16^INK4a多克隆抗体包被的酶标板、生物素标记的P16^INK4a单克隆抗体。优点是采用P16^INK4a双抗体夹心酶联免疫吸附检测试剂盒进行宫颈癌筛查，其敏感性为87.80％，特异性为92.43％，总体符合率为91.59％，阴性预测值为97.16％。使用简便，检测结果快速、准确、客观，能同时检测大量样本，适用于大样本人群的癌症筛查，检测成本比传统的癌症筛查方法低。
文档编号G01N33/577GK101446591SQ20081019768
公开日2009年6月3日 申请日期2008年11月15日 优先权日2008年11月15日
发明者莉 丁, 邹先进 申请人:邹先进