专利名称：：测定食品中盐酸林可霉素含量的酶联免疫吸附分析方法
技术领域：
：本发明涉及一种测定食品中盐酸林可霉素(LIN)含量的酶联免疫吸附分析方法(ELISA)，属于食品安全监督或食品分析的研究领域。
背景技术：
：盐酸林可霉素(LIN)，俗称洁霉素或林肯霉素，属于林可胺类抗生素，是由美国人Mason等首先从链霉菌林可变种培养液中获得的一种高效广谱抗生素，对革兰阳性球菌有较好作用。除了临床主要用于敏感菌弓I起的各种感染外，其在动物饲养及动物疾病治疗中也被广泛使用，并能作为肉鸡的生长促进剂。虽然盐酸林可霉素毒性不大，但对人畜仍具有潜在危害性，如会造成假膜性肠炎的发生及细菌耐药性，其在动物组织中的残留问题日渐受到重视。因此各国政府及相关组织都对盐酸林可霉素作出限量要求，我国农业部235号文件规定其在牛奶，肝脏中的残留量分别为150g/L，500g/kg，美国食品药品监督管理局规定其在牛奶及猪，鸡的可食用组织中的残留限量为150i!g/L，100iig/kg。检测盐酸林可霉素的方法主要是高效液相色谱法(HPLC)，但是由于其在200-220nm处仅有较弱的紫外吸收，用紫外检测器无法达到低含量检测的要求。气相色谱法(GC)往往需要衍生化，增加了操作的繁琐性且灵敏度也不高。近年来，液相色谱-串联质谱法(LC-MS/MS)用于盐酸林可霉素的检测，虽然灵敏度较高，但仪器昂贵，前处理复杂及需要专业人员操作等因素也局限了其在现场检验，样品筛选中的应用。酶联免疫吸附分析法(ELISA)具有灵敏度高、特异性强、分析快速的优点，常被用于临床、药物、食品和环境等分析领域。本发明的目的是在采用一种新颖的半抗原修饰方法基础上，建立灵敏度高、特异性强的的测定盐酸林可霉素的酶免疫分析方法。
发明内容本发明的目的是针对现有技术的不足而提供一种测定食品中盐酸林可霉素含量的酶联免疫吸附分析方法，其特点是以多克隆抗体和抗原与之间特异性反应为基础而建立的分析方法。本发明的目的由以下技术措施实现，其中所述原料份数除特殊说明外均为重量份数。测定食品中盐酸林可霉素含量的酶联免疫吸附分析方法。(1)盐酸林可霉素修饰物的制备步骤l:将35g盐酸林可霉素(LIN)与58mL对甲氧基苯甲醛溶于1520mLN，N-二甲基甲酰胺(DMF)中，以苯作为带水剂，在106t:下反应，在苯不断被蒸走后得到粗产物，再经过NaHC03中和，二氯甲烷萃取，活性碳脱色以及乙醚-正己烷结晶后得到第一步产物2.5g，用红外光谱(IR)确证产物的分子结构。步骤2:将0.50.8g步骤1产物、12mL三乙胺和1.51.8g三苯氯甲烷溶解在58mL丙酮中，以CaCl2为干燥剂回流反应24小时，将反应液冷却到5(TC，加入0.541.5g硅胶，混合物搅拌10分钟，用丙酮热过滤，滤液用环己烷_正己烷结晶得到粗产物，粗产物溶于丙酮中快速经过硅胶柱，收集流出液，加热回流，用5070mL55t:的水重结晶得到略黄有光泽的固体颗粒，IR确证产物的分子结构。步骤3:将步骤2产物0.20.5g和0.10.18g丁二酸酐溶于1020mL新蒸吡啶中，在氮气保护下，室温反应24小时，45t:真空旋干得到黄色油状物，溶于乙酸乙酯中，依次用0.001mol/LHCL及纯水洗涤。加入无水NaS04干燥过夜，真空旋干得白色固体，IR确证产物的分子结构。步骤4:步骤3产物0.10.18g加入35mL80%乙酸溶液中，在90IO(TC加热回流2030分钟，充分冷却，析出白色固体，过滤，滤液真空旋干得油状物，用苯反复洗涤，旋干得到最终产物，IR确证产物的分子结构。步骤l-4的反应如下<formula>formulaseeoriginaldocumentpage5</formula>(2)免疫原和包被抗原的制备将3050mg盐酸林可霉素衍生物，1518mg二环己基碳二亚胺(DCC)，8lOmgN-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，溶解于400600yL的匿F中，室温搅拌过夜，将混合物离心520分钟，取上层清液，缓慢加入0.010.02%的牛血清白蛋白(BSA)或卵清蛋白(OVA)，搅拌反应24小时，离心分离，取上层清液，透析数天，获得林可霉素_蛋白质溶液，冷冻干燥，于温度-2(TC保存待用。其中，LIN-OVA为免疫原，LIN-BSA为包被抗原。(3)盐酸林可霉素多克隆抗体的制备用免疫原LIN-OVA免疫两只兔子将14mg免疫原溶解于0.54mL的生理盐水中，加入0.53mL完全福氏佐剂，混合成油包水的乳浊液，每只兔子每次吸取0.52.OmL乳浊液，多次皮下注射入兔子背部，15周后，对兔进行加强免疫，使用不完全福氏佐剂，其余与第一次免疫相同，第二次免疫后，25周进行下一次免疫，第三次、第四次免疫后，57天抽取0.10.5mL耳血，检测抗体产生的情况，第五次免疫后，515天处死兔子，取全血，将血液在冰箱中放置过夜，吸取上层清液，分装，于温度-2(TC保存。(4)建立测定盐酸林可霉素含量的酶联免疫吸附分析方法对所得抗体性能进行表征，在最优试验条件下，建立测定盐酸林可霉素含量的ELISA。本发明具有如下优点1.采用新颖的半抗原修饰方法对盐酸林可霉素的分子结构进行合理修饰。2.成功制备出抗盐酸林可霉素的多克隆抗体并建立测定食品中盐酸林可霉素含量的ELISA。3.灵敏度高、特异性强。4.样品处理简单、测试量大、测试费用低。5.对样品的测定，ELISA与HPLC有很好的相关性。图1为测定盐酸林可霉素的ELISA标准曲线包被抗原LIN-BSA1:50，000(e.g.20ng/well);抗体I，1:50，000;羊抗兔lgG-辣根过氧化物酶(GaRIgG-HRP)，1:20，000由图1得知，9次ELISA测定的平均标准曲线，IC5。值(标准曲线中吸光度降低50%所对应的盐酸林可霉素的浓度，IC5。值越小，灵敏度越高)为23.729.3g/mL，检出限(LOD)为00.150.98ng/mL.图2.为ELISA和HPLC对7个加标样品中盐酸林可霉素的检测结果的相关曲线由图2得知，两种方法相关性较好，回归方程为Y=1.022x-0.9995(R2=0.9756，n=7).具体实施例方式下面通过实施例对本发明进行具体的描述，有必要在此指出的是本实施只用于对发明进行进一步说明，但不能理解为对本发明保护范围的限制，该领域的技术熟练人员可以根据上述发明的内容作出一些非本质的改进和调整。实施例1.盐酸林可霉素修饰物的制备林可霉素为小分子半抗原，不能直接免疫动物产生抗体，但可对其进行化学修饰，使修饰物带有端基为活性基团的连接桥，以便与载体蛋白相连制备免疫原。为了最大程度地保持林可霉素分子的特征结构，本发明采用了一种新颖的半抗原修饰方法，在对3，4，7位上的羟基进行保护的基础上，让2位上的羟基参与修饰反应，最终得到仅在林可霉素分子2位连接上一个终端带羧基手臂的半抗原衍生物。盐酸林可霉素修饰物的制备步骤l:将35g盐酸林可霉素(LIN)与58mL对甲氧基苯甲醛溶于1520mLN，N-二甲基甲酰胺(DMF)中，以苯作为带水剂，于温度106t:下反应，在苯不断被蒸走后得到粗产物，再经过NaHC03中和，二氯甲烷萃取，活性碳脱色以及乙醚-正己烷结晶后得到第一步产物2.5g，用红外光谱(IR)确证产物的分子结构。步骤2:将0.50.8g步骤1产物、12mL三乙胺和1.51.8g三苯氯甲烷溶解在58mL丙酮中，以CaCl2为干燥剂回流反应24小时，将反应液冷却到5(TC，加入0.51.5g硅胶，混合物搅拌10分钟，用丙酮热过滤。滤液用环己烷-正己烷结晶得到粗产物。粗产物溶于丙酮中快速经过硅胶柱，收集流出液，加热回流，用5070mL55t:的水重结晶得到略黄有光泽的固体颗粒，IR确证产物的分子结构。步骤3:将步骤2产物0.20.5g和0.10.18g丁二酸酐溶于1020mL新蒸吡啶中，在氮气保护下，室温反应24小时，于温度45t:真空旋干得到黄色油状物，溶于乙酸乙酯中，依次用0.001mol/LHCL及纯水洗涤。加入无水NaS04干燥过夜，真空旋干得白色固体，IR确证产物的分子结构。步骤4:步骤3产物0.10.18g加入35mL80^乙酸溶液中，于温度9010(TC加热回流2030分钟，充分冷却，析出白色固体，过滤，滤液真空旋干得油状物，用苯反复洗涤，旋干得到最终产物，IR确证产物的分子结构。盐酸林可霉素半抗原衍生物的表征由于保护基团都带有苯环的结构，所以通过苯环的红外特征峰(o=1613,1587，1516cm—0，再辅以熔点的测试，就能判断保护基连接或脱去是否成功。最终产物的红外图谱与林可霉素的红外图谱作比较，差别仅在前者出现了羰基的红外特征峰(o=1733cm—0，谱图信息符合目标产物的结构。2.免疫原和包被抗原的制备将3050mg盐酸林可霉素衍生物、1518mg二环己基碳二亚胺(DCC)和810mgN-羟基琥珀酰亚胺(NHS)溶解于400600yL的N，N-二甲基甲酰胺，室温搅拌过夜，将混合物离心520分钟，取上层清液，缓慢加入0.010.02%的牛血清白蛋白(BSA)或卵清蛋白(OVA)，搅拌反应24小时，离心分离，取上层清液，透析数天，获得林可霉素_蛋白质溶液，冷冻干燥，于温度-2(TC保存待用。其中，LIN-OVA为免疫原，LIN-BSA为包被抗原。3.盐酸林可霉素多克隆抗体的制备用免疫原LIN-OVA免疫两只兔子将14mg免疫原溶解于0.54mL的生理盐水中，加入0.53mL完全福氏佐剂，混合成油包水的乳浊液，每只兔子每次吸取0.52.OmL乳浊液，多次皮下注射入兔子背部，15周后，对兔进行加强免疫，使用不完全福氏佐剂，其余与第一次免疫相同，第二次免疫后，25周进行下一次免疫，第三次、第四次免疫后，57天抽取0.10.5mL耳血，检测抗体产生的情况，第五次免疫后，515天处死兔子，取全血，将血液在冰箱中放置过夜，吸取上层清液，分装，于温度-2(TC保存。4.优化实验条件，建立测定盐酸林可霉素的酶联免疫吸附分析方法(ELISA)对所得抗体性能进行表征，在最优试验条件下，建立测定食品中盐酸林可霉素含量的ELISA。(1)溶液配制(a)碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液称取2.606gNa2C0310H20，3.434gNaHC03，用800mL超纯水混匀溶解后，调节pH值，加水至1L，配成0.05mol/L，pH=9.6的碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液;(b)磷酸缓冲液(储备液，PBSX10)称取21.961gNa2HP0412H20，6.031gNaH2P04*2H20，87.666gNaCl，加800mL超纯水混合，加热溶解；用lmol/L的NaOH调节pH二7.5，加超纯水至IL，配成含O.15mol/LNaCl，pH=7.5的0.lmol/L磷酸缓冲液(储备液)；[OO53](c)酪蛋白溶液称取酪蛋白加热溶解于0.01mol/L的PBS中，配成1.0%酪蛋白溶液；(d)磷酸缓冲液_吐温储备液(含1%Tween20的0.lmol/L磷酸缓冲储备液，PBSTXIO，pH=7.5);(e)盐酸林可霉素标准溶液的配制(lmg/mL)称取0.005gLIN溶解于5mL超纯水；(f)LIN-OVA和LIN-BSA交联物的配制(lmg/mL)用微量天平称LIN-OVA或LIN-BSA交联物5mg，加入5mL超纯水溶解；(g)底物溶液(20mL纯水;lmL醋酸钠缓冲液；200yL四甲基联苯胺(TMB)(1%);20iiL过氧化氢(5%);1)醋酸钠缓冲液称取3.450gCH3COONa*31120，用lOOmL超纯水溶解，再用lmol/L拧檬酸(21'031gC6H807H20溶解于lOOmL水中)调节pH=5.8后，再用水定容到250mL，配成0.lmol/L醋酸钠缓冲液；2)TMB:称取0.0717gTMB，用7.17mL二甲基亚砜溶解混匀，配成1%，w/v;3)过氧化氢取20iiL30X的过氧化氢加入100iiL超纯水中，混匀，配成5X;(h)H2S04溶液移取25mL浓H2S04，溶解于475mL的超纯水中，配成5%H2S04溶液。[OO65](2)主要仪器洗板机A5082，Tecan，Austria;酶标仪A2082，Tecan，Austria;酶标板costar;高效液相色谱仪Alltech-OOl(3)间接竞争ELISA步骤1)用包被抗原包板，每孔200iiL，4t:过夜；2)PBST缓冲液(PBST储备液1:10稀释)满孔洗涤三次；3)加入酪蛋白溶液封阻，每孔280iiL，室温放置1小时；4)PBST缓冲液洗板三次；5)依次每孔加入100iiL的标准溶液和100yL的一定稀释度的多克隆抗体，室温放置1小时；6)PBST缓冲液洗板三次；7)加入酶标二抗(羊抗兔lgG-辣根过氧化物酶，GaRIgG-HRP)，每孔200yL，室温放置1小时；8)PBST缓冲液洗板三次；9)加入底物液显色，每孔200iiL，振摇1520分钟；10)加入5%H2S04溶液，每孔80iiL，终止反应;11)用酶标仪测定吸光度值，做出标准曲线，进行结果分析与讨论。(4)ELISA实验条件的优化本发明对包被抗原的浓度、抗体的稀释度、酶标二抗的稀释度等作了优化，优化结果为包被抗原的浓度为20ng/mL，抗体的稀释度为1:50，000，酶标二抗的稀释度为1:20，000，实验在室温下进行。以后的实验均在此条件下进行。(5)ELISA的标准曲线及灵敏度盐酸林可霉素标准溶液的浓度为0，1，3，10，30，100,300，1000ng/mL，由盐酸林可霉素的储备液lmg/mL经过纯水稀释而得。以盐酸林可霉素浓度的对数为横坐标，以相对信号B/B。X100X为纵坐标做标准曲线(B。盐酸林可霉素标液浓度为Ong/mL所对应的吸光度值；B:其他各浓度对应的吸光度值)。图1为9次ELISA测定的平均标准曲线，IC5。在23.7-29.3ng/mL之间。(6)ELISA的特异性ELISA特异性可用交叉反应率来表示。交叉反应率(CR%)=(盐酸林可霉素的IC5。/测试物质的IC5。)X100%。交叉反应率越小，ELISA的特异性越高。在本发明选择盐酸克林霉素及其他7种用于动物饲养及动物疾病治疗的药物进行交叉反应实验，交叉反应物的结构及交叉反应实验如表1所示。抗体与盐酸克林霉素的交叉反应率为18.9%，与其他7种药物的交叉反应率均小于0.01%，说明所得抗体对盐酸林可霉素的特异性较高。5.ELISA对加标样品中盐酸林可霉素含量的测定随机选择了6种食品牛奶I，牛奶11，猪肝I，猪肝11，鸡肉I，鸡肉11，经ELISA检测，均没有检出林可霉素，为阴性样品。对所选样品进行加标实验，猪肝及鸡肉样品需切碎匀浆，牛奶样品可直接用于加标。称取15g，加入不同浓度盐酸林可霉素标准溶液，震荡20分钟，4t:静止过夜，加入0.Olmol/LHCL溶液，水浴振荡半小时，超声20分钟，离心，取上层清液，用2mol/LNaOH溶液调节pH值到6.0左右，离心，上清液用超纯水稀释2050倍后ELISA直接测定，结果如表2所示，回收率在76.6-117.6.%，相对标准偏差为1.7-34.6%，说明该ELISA方法的准确性和精密度都较好。6.ELISA和HPLC的比较盐酸林可霉素的HPLC条件为HypersilGold柱，柱温为室温，流动相为用H3P04调节pH至6.0的O.Olmol/L硼砂溶液甲醇=80::20，流量lmL/min，进样20yL，紫外检测波长215nm，盐酸林可霉素标准溶液的浓度分别为1、5、10、20、40、60、80、100yg/mL，样品萃取液用0.45iim滤膜过滤后直接测定。所建立的ELISA的可靠性用HPLC进行进一步验证。7种加标样品，即牛奶I，加标浓度5iig/mL和10iig/mL;牛奶II，加标浓度20yg/mL;猪肝I，加标浓度40yg/g;猪肝11，加标浓度50iig/g:鸡肉1，加标浓度80iig/g;鸡肉II，加标浓度lOOiig/g。加标样品用0.lmol/L盐酸萃取并用ELISA和HPLC测定，测定结果以ELISA为横坐标，HPLC为纵坐标作图得两者的相关曲线，如图2所示，回归方程为Y=1.022x-0.9995.，相关系数为0.9756，n二7，说明二者的相关性很好。表1抗体与其他8种药物的交叉反应率9<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>样品加标浓度稀释度检出浓度回收率RSD_ug/g(ml)_Pg/g(ml)__(%，n=3)0.12.08±0.33103.815.9牛奶I0.2504.70±0.75117.615.9116.96±3.8984.823.0_^_41.27±7.43_103.2_18.00.12.30±0.14115.06.3牛奶II0.24.60±0.63115.013.615017.58±1.8788.010.7_^_46.91±1.65__3.50.12.44±0.1297.54.8猪肝I0.2404.90±1.6498.033.4125.20±4.93100.819.6_^_57.31±5.84_115.0_10.20.12.22±0.4488.719.7猪肝II0.24.63±1.2092.725.914020.76±1.3883.16.7_^_44.04±3.75__8.50.14.62±1.6092.534.6鸡肉I0.2209.26±0.1692.61.7153.71±2.03107.43.8_^_93.39±13.86__14.80.12.23±0.4489.119.9鸡肉II0.24.63±0.3892.68.214022.85±4.4579.019.5_^_38.33±3.65_^_9.5加标样品均为阴性样品加标。1权利要求测定食品中盐酸林可霉素含量的酶联免疫吸附分析方法，其特征在于该方法包括以下步骤(1)盐酸林可霉素修饰物的制备步骤1将3～5g盐酸林可霉素与5～8mL对甲氧基苯甲醛溶于15～20mLN，N-二甲基甲酰胺中，以苯作为带水剂，在温度96～106℃下反应，在苯不断被蒸走后得到粗产物，再经过NaHCO3中和至中性，二氯甲烷萃取，活性碳脱色以及乙醚-正己烷结晶后得到第一步产物2.5g，用红外光谱确证产物的分子结构；步骤2将0.5～0.8g步骤1产物、1～2mL三乙胺和1.5～1.8g三苯氯甲烷溶解在5～8mL丙酮中，以CaCl2为干燥剂回流反应24小时，将反应液冷却到50℃，加入0.5～1.5g硅胶，混合物搅拌10分钟，用丙酮热过滤，滤液用环己烷-正己烷结晶得到粗产物，粗产物溶于丙酮中快速经过硅胶柱，收集流出液，加热回流，用50～70mL55℃的水重结晶得到略黄有光泽的固体颗粒，用红外光谱确证产物的分子结构；步骤3将步骤2产物0.2～0.5g和0.1～0.18g丁二酸酐溶于10～20mL新蒸吡啶中，在氮气保护下，室温反应24小时，在温度45℃真空旋干得到黄色油状物，溶于乙酸乙酯中，依次用0.001mol/LHCL及纯水洗涤，加入无水Na2SO4干燥过夜，真空旋干得白色固体，用红外光谱确证产物的分子结构；步骤4将步骤3产物0.1～0.18g加入3～5mL80％乙酸溶液中，在温度90～100℃加热回流20～30分钟，充分冷却，析出白色固体，过滤，滤液真空旋干得油状物，用苯反复洗涤，旋干得到最终产物，用红外光谱确证产物的分子结构；步骤1-4的反应如下(2)免疫原和包被抗原的制备将30～50mg盐酸林可霉素衍生物、15～18mg二环己基碳二亚胺和8～10mgN-羟基琥珀酰亚胺溶解于400～600μL的N，N-二甲基甲酰胺中，室温搅拌过夜，将混合物离心5～20分钟，取上层清液，缓慢加入0.01～0.02％的牛血清白蛋白(BSA)或卵清蛋白(OVA)，搅拌反应24小时，离心分离，取上层清液，透析数天，获得林可霉素-蛋白质溶液，冷冻干燥，于温度-20℃保存待用，其中，LIN-OVA为免疫原，LIN-BSA为包被抗原；(3)盐酸林可霉素多克隆抗体的制备用免疫原LIN-OVA免疫两只兔子将1～4mg免疫原溶解于0.5～4mL的生理盐水中，加入0.5～3mL完全福氏佐剂，混合成油包水的乳浊液，每只兔子每次吸取0.5～2.0mL乳浊液，多次皮下注射入兔子背部，1～5周后，对兔进行加强免疫，使用不完全福氏佐剂，其余与第一次免疫相同，第二次免疫后，2～5周进行下一次免疫，第三次、第四次免疫后，5～7天抽取0.1～0.5mL耳血，检测抗体产生的情况，第五次免疫后，5～15天处死兔子，取全血，将血液在冰箱中放置过夜，吸取上层清液，分装，于温度-20℃保存；(4)建立测定盐酸林可霉素含量的酶联免疫吸附分析方法对所得抗体性能进行表征，在最优试验条件下，建立测定盐酸林可霉素含量的ELISA；(5)ELISA对加标样品中盐酸林可霉素含量的测定随机选择了6种食品牛奶I，牛奶II，猪肝I，猪肝II，鸡肉I，鸡肉II，经ELISA检测，均没有检出林可霉素，为阴性样品，对所选样品进行加标实验，猪肝及鸡肉样品需切碎匀浆，牛奶样品可直接用于加标，称取1～5g，加入不同浓度盐酸林可霉素标准溶液，震荡20分钟，4℃静止过夜，加入0.01mol/LHCL溶液，水浴振荡半小时，超声20分钟，离心，取上层清液，用2mol/LNaOH溶液调节pH值到6.0左右，离心，上清液用超纯水稀释20～50倍后ELISA直接测定，回收率在76.6-117.6％，相对标准偏差为1.7-34.6％，说明该ELISA方法的准确性和精密度都较好；(6)ELISA和HPLC的比较盐酸林可霉素的HPLC条件为HypersilGold柱，柱温为室温，流动相为用H3PO4调节pH至6.0的0.01mol/L硼砂溶液∶甲醇＝80∶∶20，流量1mL/min，进样20μL，紫外检测波长215nm，盐酸林可霉素标准溶液的浓度分别为1、5、10、20、40、60、80、100μg/mL，样品萃取液用0.45μm的滤膜过滤后直接测定；所建立的ELISA的可靠性用HPLC进行进一步验证，7种加标样品，即牛奶I，加标浓度5μg/mL和10μg/mL；牛奶II，加标浓度20μg/mL；猪肝I，加标浓度40μg/g；猪肝II，加标浓度50μg/g；鸡肉I，加标浓度80μg/g；鸡肉II，加标浓度100μg/g，加标样品用0.1mol/L盐酸萃取并用ELISA和HPLC测定，测定结果以ELISA为横坐标，HPLC为纵坐标作图得两者的相关曲线，回归方程为Y＝1.022x-0.9995，相关系数为0.9756，n＝7，说明二者的相关性很好。F2009102163182C0000011.tif全文摘要本发明公开了测定食品中盐酸林可霉素含量的酶联免疫吸附分析方法(ELISA)，其特点是采用新颖的半抗原修饰方法，合成盐酸林可霉素的修饰物并将其与蛋白联接，制得免疫原及包被抗原。通过免疫动物获得兔抗盐酸林可霉素的多克隆抗体。抗体用于盐酸林可霉素的免疫分析，标准曲线的浓度范围为1～1000ng/mL，IC50为23.7～29.3ng/mL；抗体与盐酸克林霉素的交叉反应率为18.9％，与其它7种常用抗生素或激素几乎没有交叉反应。6种市售食品加标后用0.01mol/LHCL萃取，萃取液经适当稀释用ELISA测定，加标回收率为76.6～117.6％，相对标准偏差为1.7～34.6％。用HPLC和ELISA对7种加标样品进行分析，两种方法相关性较好(R2＝0.9756，n＝7)。本发明建立的ELISA可靠，灵敏度高，特异性强，可用于食品中盐酸林可霉素含量检测。文档编号G01N21/31GK101726590SQ200910216318公开日2010年6月9日申请日期2009年11月25日优先权日2009年11月25日发明者杨红,王悦秋,邓安平申请人:四川大学