用于目标分子检测的基于亲和力的划分试验的制作方法
【专利说明】用于目标分子检测的基于亲和力的划分试验
[0001] 相关申请的交叉参考
[0002] 本申请要求2013年2月8日提交的美国临时申请号61/762,707的优先权，该申 请通过引用纳入本文用于所有目的。
[0003] 发明背景
[0004] 定量来自对象的样品中生物分子的含量可为多种临床应用提供有用的信息。检测 和定量生物分子（如蛋白质）的一种方法是通过酶联免疫吸附实验（ELISA)。然而，该试验 有限的检测和定量精确性无法满足多种需求。替代性技术（如免疫PCR)具有提高检测灵 敏度的潜能，但在实践中受限于由于抗体的非特异性结合而产生的高背景信号的问题。
[0005] 因此，仍需要提供改进的定量精确性和低末端灵敏度的检测和定量生物分子的方 法。
【发明内容】
[0006] 在一个方面中，本发明提供了检测样品中目标分子的方法。在一些实施方式中，该 方法包括：
[0007] 将混合物中的样品至少与连接第一标记物的第一探针和连接第二标记物的第二 探针孵育，该第一和第二探针特异性结合相同的目标分子（如果存在）；
[0008] 将该样品划分为两个或更多个分区；以及
[0009] 在至少一个同一分区中检测是否存在两种或更多种探针（例如第一探针和第二 探针）；从而检测样品中的目标分子。
[0010] 在另一个方面中，本发明提供了检测样品中目标分子的方法，该目标分子连接或 能够生成可检测分子。在一些实施方式中，该方法包括：
[0011] 将混合物中的样品至少与连接第一标记物的第一探针孵育，该第一探针特异性结 合该目标分子（如果存在）；
[0012] 将该样品划分为两个或更多个分区；以及
[0013] 在至少一个同一分区中检测是否存在第一标记物和可检测的分子；从而检测样品 中的目标分子。
[0014] 在另一个方面中，本发明提供了检测样品中至少第一目标分子与第二目标分子 (其形成复合物）的相互作用的方法。在一些实施方式中，该方法包括：
[0015] 将混合物中的样品至少与连接第一标记物的第一探针和连接第二标记物的第二 探针孵育，该第一探针特异性结合第一目标分子（如果存在），且该第二探针特异性结合第 二目标分子（如果存在）；
[0016] 将该样品划分为两个或更多个分区；以及
[0017] 在至少一个同一分区中检测是否存在第一标记物和第二标记物；从而检测样品中 的目标分子。
[0018] 在另一个方面中，本发明提供了检测样品中目标分子或目标分子的相互作用的方 法，该方法包括：
[0019] 将混合物中的样品至少与连接产生可检测信号的第一标记物的第一探针和连接 第二标记物的第二探针孵育，该第一探针特异性结合目标分子（如果存在于样品中），且该 第二探针像第一探针一样特异性结合目标分子，或结合与第一探针特异性结合的目标分子 相互作用的第二目标分子（如果存在于样品中）；
[0020] 将该样品划分为两个或更多个分区；以及
[0021] 检测至少一个分区中第一标记物和/或第二标记物所生成的可检测信号的淬灭； 从而检测样品中的目标分子或目标分子的相互作用。
[0022] 在另一个方面中，本发明提供了检测样品中目标分子的方法，该方法包括：
[0023] 将混合物中的样品至少与连接第一标记物的第一探针和连接第二标记物的第二 探针孵育，该第一探针特异性结合与目标分子相互作用的分子组分，且该第二探针和目标 分子竞争与该分子组分相互作用；
[0024] 将该样品划分为两个或更多个分区；以及
[0025] 检测同时表达第一标记物和第二标记物的分区数目的减少；从而检测目标分子。
[0026] 在一些实施方式中，以两次或多次稀释重复该方法，并使结果对背景信号进行校 正。在一些实施方式中，该方法包括将样品至少划分为含有至少两个分区的第一分区文库 和含有至少两个分区的第二分区文库，该第一和第二分区文库以不同稀释度形成和/或每 个分区具有不同体积。在一些实施方式中，生成单一分区文库，其中各分区的体积变化使得 存在至少两种不同体积的分区。
[0027] 在一些实施方式中，该划分包括生成足够数目的分区，使得至少大部分分区含有 不超过五个拷贝的目标分子。
[0028] 在一些实施方式中，第一和第二标记物包含核酸、焚光部分、亲和标签或点击化学 部分，且第一标记物不同于第二标记物。在一些实施方式中，该第一标记物生成第一信号且 该第二标记物生成第二信号且第一信号和第二信号是可区分的。
[0029] 在一些实施方式中，至少一种标记物是酶。在一些实施方式中，该第一标记物是第 一酶且该第二标记物是第二酶，且该检测包括检测第一和第二酶生成的产物。在一些实施 方式中，第一和第二酶选自：辣根过氧化物酶、P _半乳糖苷酶、荧光素酶、碱性磷酸酶和水 解二乙酸荧光素的酯酶。在一些实施方式中，在划分后孵育各分区，从而扩增第一和第二酶 生成的信号。在一些实施方式中，第一和第二酶的活性在划分前受到抑制。
[0030] 在一些实施方式中，第一标记物和第二标记物联合产生这样的信号：所述信号当 所述第一标记物、所述第二标记物或两者不存在的情况下不会产生。在一些实施方式中，该 第一标记物是第一酶且该第二标记物是第二酶且第一和第二酶的活性联合以生成指示第 一和第二标记物存在的可检测信号。
[0031] 在一些实施方式中，该第二标记物淬灭第一标记物生成的信号。在一些实施方式 中，第一和第二标记物是荧光共振能量转移（FRET)对的成员。
[0032] 在一些实施方式中，在划分后放大来自第一标记物的信号和来自第二标记物的信 号。在一些实施方式中，第一和第二标记物是核酸标记物。在一些实施方式中，这些核酸标 记物经扩增以生成扩增子且该检测包括检测该扩增子。在一些实施方式中，该检测包括检 测与扩增子相关的荧光信号。在一些实施方式中，该荧光信号由荧光标记的多核苷酸探针 生成。在一些实施方式中，该荧光信号由用于扩增核酸标记物的一个或多个引物生成。在 一些实施方式中，该荧光信号由荧光插入染料生成。
[0033] 在一些实施方式中，该方法还包括测定包含第一标记物和第二标记物的分区数 目。
[0034] 在一些实施方式中，这些分区是液滴或微通道。在一些实施方式中，这些液滴被不 互溶的运载体液体围绕。
[0035] 在一些实施方式中，该第一探针和/或第二探针包含结合剂，该结合剂独立地选 自抗体、适体和非抗体蛋白质支架。在一些实施方式中，该第一探针和/或第二探针包含目 标特异性结合剂，该目标特异性结合剂独立地选自核酸和锌指蛋白。在一些实施方式中，该 第一探针在孵育前连接目标分子。在一些实施方式中，该方法包括将混合物中的样品与超 过两种探针（例如3、4、5、6、7、8、9、10或更多种探针）孵育。
[0036] 在一些实施方式中，该目标分子是蛋白质。在一些实施方式中，该目标分子是核 酸。在一些实施方式中，该目标分子是DNA。在一些实施方式中，该目标分子是RNA。在一 些实施方式中，该目标分子是miRNA或mRNA。在一些实施方式中，该目标分子在检测前未扩 增或连接。在一些实施方式中，该目标分子在划分前未扩增或连接。
[0037] 在一些实施方式中，该目标分子是酶，其能够将混合物中的底物转化为可检测分 子或中间分子，该中间分子可被第一标记物进一步转化为可检测分子。在一些实施方式中， 该目标分子连接或结合可检测分子。在一些实施方式中，该目标分子包含荧光部分。
[0038] 在一些实施方式中，其中需要检测相互作用或形成复合物的两种或更多种目标分 子，第一和第二目标分子是蛋白质。
[0039] 在一些实施方式中，该分子组分是酶且该目标分子是该酶的底物。
[0040] 在一些实施方式中，测量表达第一标记物和/或第二标记物的分区数目的减少或 来自第一标记物和/或第二标记物的信号的减少，该测量相对于其中已知不存在目标分子 的对照样品进行。
[0041] 在一些实施方式中，该方法包括使用两种或更多种浓度的至少一种混合物组分分 析样品，以区分目标分子特异性共定位与随机共定位。在一些实施方式中，该方法包括估计 样品中目标分子的含量和/或浓度，通过从观察到的该样品中共定位事件数目中扣除预期 的该样品中随机共定位事件数目来进行。
[0042] 在另一个方面中，本发明提供了包含两个或更多个分区的分区文库。在一些实施 方式中，至少一些分区包含含有第一标记物的第一探针和含有第二标记物的第二探针。在 一些实施方式中，该分区文库包含至少500个分区。
[0043] 在一些实施方式中，大部分分区包含含有第一标记物的第一探针和含有第二标记 物的第二探针。在一些实施方式中，该第一探针和/或第二探针包含结合剂，该结合剂选自 抗体、适体和非抗体蛋白质支架。在一些实施方式中，这些第一和第二标记物是核酸、荧光 部分、亲和标签或点击化学部分，且第一标记物不同于第二标记物。在一些实施方式中，该 第一标记物生成第一信号且该第二标记物生成第二信号且该第一信号和该第二信号是可 区分的。在一些实施方式中，该第一标记物是第一酶且该第二标记物是第二酶且第一和第 二酶的活性联合以生成指示第一和第二标记物存在的可检测信号。
[0044] 在一些实施方式中，至少一些分区包含一种或多种目标分子。在一些实施方式中， 各分区中存在平均不超过5个拷贝的一种或多种目标分子。
[0045] 在一些实施方式中，这些分区是液滴。在一些实施方式中，这些液滴被不互溶的运 载体液体围绕。在一些实施方式中，这些分区是微通道。在一些实施方式中，这些分区是微 胶囊。
[0046] 定义
[0047] 除非另外定义，本文中使用的所有技术和科学术语具有本领域普通技术人员通常 所理解的同样含义。参见例如Lackie，DICTIONARY OF CELLAND MOLECULAR BIOLOGY(《细胞 分子生物学词典》），埃尔斯威尔出版社（Elsevier)(第4版2007) ;Sambrook等，MOLECULAR CLONING, A LABORATORY MANUAL (《分子克隆，实验室手册》），冷泉港实验室出版社（冷泉 港，纽约1989)。术语"一个"或"一种"意在表示"一个（种）或多个（种）"。当术语"包 含"及其各种变体例如"包括"和"含有"位于叙述步骤或要素之前的时候，是用来表示添加 其它的步骤或要素是任选的，并且是非排它性的。本发明的实践中可以使用与本文所述类 似或等价的任何方法、装置和材料。本文提供的定义是用来帮助理解本文经常用到的某些 术语，不对本发明的范围构成限制。
[0048] 本文所用术语"划分"或"划分的"指将样品分隔为多个部分，或"分区"。分区可 以是固体或液体。在一些实施方式中，分区是固体分区，例如微通道。在一些实施方式中， 分区是液体分区，例如液滴。在一些实施方式中，液体分区（如液滴）是不互溶的液体（如 水和油）的混合物。在一些实施方式中，液体分区（如液滴）是水性液滴，其被不互溶的运 载体液体（如油）围绕。
[0049] 术语"探针"指与目标分子特异性相互作用或特异性结合目标分子的分子（例如 蛋白质、核酸、适体等）。与目标分子特异性相互作用或特异性结合目标分子的分子的非限 制性示例包括核酸（如寡核苷酸）、蛋白质（如抗体、转录因子、锌指蛋白、非抗体蛋白支架 等）和适体。
[0050] "目标分子"指样品中待检测的分子。在一些实施方式中，该目标分子是肽、蛋白质 (如抗体、酶、生长调节剂、凝血因子或磷蛋白）、多核苷酸（例如DNA(如dsDNA或ssDNA); RNA (如mRNA或miRNA);或DNA-RNA杂交体）、适体、肽核酸、碳水化合物、病毒、病毒样颗粒、 药物化合物、代谢物或细胞。在一些实施方式中，样品中的两种或更多种待检测目标分子包 含相互作用的目标分子的复合物（例如蛋白质的配体-受体复合物）。
[0051] 对于结合目标分子的探针，术语"结合"通常指该探针（如寡核苷酸或抗体）结合 纯群体中大部分目标分子，假设探针与目标分子具有合适摩尔比。例如，结合给定目标分 子的探针通常结合溶液中至少2/3的目标分子（例如75%、80%、85%、90%、91%、92%、 93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%)。本领域技术人员应理解，取决于测定结 合的方法和/或阈值，可出现一些变化。
[0052] 术语"特异性结合"或"与……特异性相互作用"指探针（如寡核苷酸或抗体）与 目标分子的结合亲和性比非目标分子高至少2倍，例如至少4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、 10倍、20倍、25倍、50倍或100倍。例如，特异性结合特定目标分子的探针通常以与非目标 分子相比高至少2倍的亲和性结合目标分子。
[0053] 术语"标记物"和"可检测标记物"可互换地指可通过光谱、光化学、生物化学、免 疫化学、化学或其它物理手段检测的组合物。例如，可用的标记物包括荧光染料、发光剂、放 射性同位素（如 32p、3h)、高电子密度试剂、酶、生物素、地高辛或半抗原以及可被检测的蛋 白质、核酸或其他实体，例如通过将放射性标记物整合至与目标分子特异性反应的抗体、肽 或寡核苷酸中。可以采用本领域已知的用于偶联探针与标记物的任何方法，例如，使用如下 文献中所述的方法：Hermanson，Bioconjugate Techniques (《生物结合技术》）1996,学术 出版社有限公司（Academic Press, Inc.)，圣迭戈。
[0054] "连接"至标记物的分子（例如本文所述经标记探针）是共价（通过接头或化学 键）或非共价（通过离子、范德华力、静电或氢键）地结合标记物的分子，从而可通过检测 与该分子结合的标记物来检测是否存在该分子。
【附图说明】
[0055] 图1.图2_4、6和7中示意图的图示说明。（A)用于结合目标分子（如抗体、适体 等）的探针的代表。（B)与一个目标分子结合的两个探针（如识别目标分子上不同表位的 抗体）。（C)连接有核酸链（标记物）的探针。（D)连接有核酸链（标记物）的抗体（探 针）的细节并显示用于扩增来自标记物的信号的引物和探针。（E)含有与目标分子的不同 表位结合的两种抗体的分区（液滴）；一种抗体使用可通过基于FAM的试验（表示为F)检 测的寡聚物标记且另一种抗体使用可通过基于VIC的试验（表示为V)检测的寡聚物标记。 (F)含有与目标分子的不同表位结合且使用荧光标记物标记的两种探针的分区（液滴），该 荧光标记物通过将非荧光底物（NFS)酶促切割为可检测标志物来生成信号。
[0056] 图2.不存在目标分子时探针划分的示意图。各分区间抗体分离很大程度上取决 于随机因素，且通过荧光信号的抗体检测显示这些探针很少共定位。
[0057] 图3.存在目标分子时探针划分的示意图。由于目标分子的存在，抗体非随机地划 分。通过相关荧光信号检测到抗体的存在。
[0058] 图4.存在目标分子时探针划分的示意图。由于目标分子的存在，探针非随机地划 分。通过非荧光底物酶促切割生成的相关荧光信号检测到抗体的存在。
[0059] 图5.样品中经连接物质浓度的评估。在其中使用两种探针（探针A (如具有可检 测标记物FAM)和探针B (如具有可检测标记物VIC))的样品中，两者都能够特异性结合相 同目标分子，观察到四种可能的事件：N。（两种探针均为阴性）、N A(探针A为阳性且探针B为 阴性）、Nb (探针B为阳性且探针A为阴性）和Nab (两种探针均为阳性）。清楚测量N。、Na、 NJPNab。一些观察到的双重阳性事件（如液滴）将是由于液滴中单种物质的偶然定位，而 一些则是由于实际存在经连接的分子。可如实施例1中所述评估经连接分子的浓度。
[0060] 图6.由于目标分子的存在，探针非随机地划分。通过一个分区内发生的全部两种 转化反应（非荧光底物（NFS)酶促切割为可检测标志物）所生成信号来检测两种探针是否 存在。
[0061]图7.目标分子联合目标特异性探针的内在活性的检测。在该实施例中，目标分 子是碱性磷酸酶（AP)或包含AP的复合物。将通过将4-甲基伞形基磷酸酯（MUP)转化为 4-甲基伞形酮（4MU)的AP活性检测与对AP的特定同种型具有特异性的经标记探针（VIC， "V")的检测联用。
[0062] 发明详述
[0063] I?引言
[0064] 本发明提供了检测样品中一种或多种目标分子的方法、组合物和试剂盒。在一个 相关方面中，本发明提供了检测样品中两种或更多种目标分子之间相互作用或目标分子复 合物的方法、组合物和试剂盒。将样品与特异性结合目标分子或样品中可能存在的目标分 子的两种、三种、四种、五种或更多种探针孵育。这些样品被划分为多个分区并分析（例如 使用数字分析）是否存在经标记探针。在一些实施方式中，在检测前扩增信号或经标记探 针生成的信号。本文所述方法允许对目标分子的检测具有改进的灵敏度，并允许精确定量 目标分子或分子，并降低对直接检测样品中目标分子的限制。
[0065] II?通过共定位探针检测目标分子
[0066] 在一个方面中，本发明涉及使用共定位至目标分子的两种或更多种探针检测样品 中目标分子的方法。不受特定理论的限制，认为当对样品高度分配从而每个分区中含有少 量探针分子时（例如平均每个分区中小于约5、4、3、2或1个探针），可计算多种不同探针 偶然（而非通过特异性结合分区中的目标分子）共定位至特定分区的可能性。多种不同探 针与目标分子的结合由于其