区文库的各分区的探针和探针标记物可以是本发明所述的任何探针或探针 标记物。在一些实施方式中，第一探针和/或第二探针包含结合剂，该结合剂选自抗体、适 体和非抗体蛋白质支架。在一些实施方式中，第一和第二标记物是核酸、荧光部分、亲和标 签或点击化学部分，且第一标记物不同于第二标记物。在一些实施方式中，第一标记物和第 二标记物联合产生这样的信号：所述信号当所述第一标记物、所述第二标记物或两者不存 在的情况下不会产生。在一些实施方式中，该第一标记物生成第一信号且该第二标记物生 成第二信号且第一信号和第二信号是可区分的。
[0209] 在一些实施方式中，该分区文库包含足量的分区，使得由于结合目标分子而形成 的探针的共定位可与随机共定位区分。在一些实施方式中，该分区文库的至少1个分区含 有〇个拷贝的目标分子。在一些实施方式中，该分区文库的至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9、 10、15、20、25、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250、300、400、500、600、700、800、900 或1000或更多个分区含有0个拷贝的目标分子。在一些实施方式中，该分区文库的至少1 个分区含有0个拷贝的目标分子且该分区文库的至少1个分区含有1个或更多个拷贝（例 如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个拷贝）的目标分子。在一些实施方式中，该分区文库的 至少约 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250、300、 400、500、600、700、800、900或1000或更多个分区含有0个拷贝的目标分子且该分区文库的 至少约 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250、300、 400、500、600、700、800、900或1000或更多个分区含有1个或更多个拷贝（例如1、2、3、4、 5、6、7、8、9、10或更多个拷贝）的目标分子。在一些实施方式中，该分区文库包含足量的分 区，使得两个或更多个探针不共定位在至少1个分区中。在一些实施方式中，该分区文库包 含足量的分区，使得探针不共定位在至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、40、50、60、 70、80、90、100、150、200、250、300、400、500、600、700、800、900 或 1000 或更多个分区中。
[0210] 在一些实施方式中，该分区文库的至少一些分区包含一种或多种目标分子。在一 些实施方式中，该分区文库的至少一些分区包含两种、三种、四种、五种或更多种不同的目 标分子。在一些实施方式中，各分区中存在平均不超过5个拷贝（例如不超过5个拷贝、不 超过4个拷贝、不超过3个拷贝、不超过2个拷贝或不超过1个拷贝）的一种或多种目标分 子。
[0211] 在一些实施方式中，该分区文库包含多个分区，所述多个分区是固体分区（如孔 或管）。在一些实施方式中，这些分区是微通道。在一些实施方式中，该分区文库包含多个 分区，所述多个分区是液体分区（如油相中的水性液滴）。在一些实施方式中，这些分区是 液滴。在一些实施方式中，这些分区是微胶囊。上文描述了合适的分区和生成分区的方法 的示例。
[0212] 在一些实施方式中，该分区文库包含在形状和/或尺寸方面基本均匀的分区。例 如，在一些实施方式中，这些分区（如液滴）在平均直径方面基本均匀。在一些实施方式中， 这些分区（如液滴）的平均直径是约 〇? 〇〇l、〇. 005、0. 01、0. 05、0. 1、0. 5、1、5、10、20、30、40、 50、60、70、80、90、100、150、200、300、400、500、600、700、800、900 或 1000 微米。在一些实施 方式中，这些分区（如液滴）的平均直径小于约1000、900、800、700、600、500、400、300、200、 100、50或25微米。在一些实施方式中，该分区文库包含在形状和/或尺寸方面不均匀的分 区（如液滴）。
[0213] 在一些实施方式中，这些分区（如液滴）在体积上基本均匀。例如，在一些实施 方式中，这些分区（如液滴）的平均体积为约〇? 〇〇l、〇. 005、0. 01、0. 02、0. 03、0. 04、0. 05、 0? 06、0. 07、0. 08、0. 09、0. 1、0. 2、0. 3、0. 4、0. 5、0. 6、0. 7、0. 8、0. 9、1、1. 5、2、2. 5、3、3. 5、4、 4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、 40、45 或 50nL。
[0214] 在一些实施方式中，这些分区（如液滴）是稳定的且能够长期储存。在一些实施 方式中，这些分区可在约-70°、-20°、0°、3°、4°、5°、6°、7°、8°、9°、10°、15°、 20°、25°、30°、35°或40°C下长时间储存（例如至少30天、至少60天、至少90天或更 长）。 实施例
[0215] 提供以下实施例用于说明而非限制本发明的权利要求。
[0216] 实施例1 :估计目标分子浓度
[0217] 该实施例提供了估计样品中目标分子浓度的统计学框架，具体方式为测量各分区 (如液滴）中对两种不同探针（FAM和VIC)呈阳性的分子的浓度。
[0218] 对于该实施例，使用了两种探针：探针A(如具有可检测标记物FAM)和探针B(如 具有可检测标记物VIC)的样品中，两者都能够特异性结合相同目标分子。可观察四种可能 的事件：N。（两种探针均为阴性）、NA (探针A为阳性且探针B为阴性）、NB (探针B为阳性且 探针A为阴性）和Nab (两种探针均为阳性）（图5)。对于各液滴，清楚测量事件。一些观 察到的双重阳性液滴（Nab)将是由于液滴中单种物质的偶然定位（N{SMAB)，而一些Nab将是 由于目标分子上实际存在共定位的探针（Nw?gftAB)。
[0219] 当目标分子上不存在共定位的探针时，系统中不存在系统性偏差，且A和B是不相 关的。在这种情况下，N{SMAB可估计为：
[0220]N偶然AB = (NANB) /N。
[0221] 当目标分子上存在共定位的探针时，必须从观察到的计数（Nskab)中扣除偶然计 数（N偶然AB):
[0222] N共定位AB =N观察AB-N偶然AB =N观察AB- (NaNb) /N0
[0223] 我们可以使用以下公式来计算目标分子上共定位的探针的浓度：
[0224] X共定位=In (N总）-In (N0+NA+NB+ ((NA) /N0)
[0225] 应理解，本文所述的实施例和实施方式仅用于说明目的，本领域技术人员应了解 据此作出的各种修饰或改变，且它们包括在本申请的主旨和权益以及所附权利要求书的范 围内。本文引用的所有发表物、专利和专利申请通过引用全文纳入本文以用于所有目的。
【主权项】
1. 一种检测样品中目标分子的方法，所述方法包括： 将混合物中的样品至少与连接第一标记物的第一探针和连接第二标记物的第二探针 孵育，所述第一和第二探针特异性结合相同的目标分子，前提是存在这类目标分子； 将所述混合物划分为两个或更多个分区；以及 在至少一个同一分区中检测是否存在所述第一标记物和所述第二标记物；从而检测所 述样品中的所述目标分子。2. 如权利要求1所述的方法，所述划分包括生成足量的分区，使得由于结合目标分子 而形成的所述探针的共定位能够与随机共定位区分。3. 如权利要求1或2所述的方法，所述第一和第二标记物包含核酸、荧光部分、亲和标 签或点击化学部分，且所述第一标记物不同于所述第二标记物。4. 如权利要求1-3中任一项所述的方法，所述第一标记物生成第一信号且所述第二标 记物生成第二信号且所述第一信号和所述第二信号是可区分的。5. 如权利要求1-4中任一项所述的方法，其中，至少一种标记物是酶。6. 如权利要求4或5所述的方法，所述第一标记物是第一酶且所述第二标记物是第二 酶，且所述检测包括检测所述第一和第二酶生成的产物。7. 如权利要求6所述的方法，所述第一和第二酶选自：辣根过氧化物酶、P -半乳糖苷 酶、荧光素酶、碱性磷酸酶和水解二乙酸荧光素的酯酶。8. 如权利要求6所述的方法，其中，在所述划分后孵育各分区，从而放大所述第一和第 二酶生成的信号。9. 如权利要求8所述的方法，所述第一和第二酶的活性在所述划分前被抑制。10. 如权利要求1-3中任一项所述的方法，所述第一标记物和所述第二标记物联合产 生这样的信号：所述信号当所述第一标记物、所述第二标记物或两者不存在的情况下不会 产生。11. 如权利要求10所述的方法，所述第一标记物是第一酶且所述第二标记物是第二酶 且所述第一和第二酶的活性联合以生成指示所述第一和第二标记物存在的可检测信号。12. 如权利要求1-11中任一项所述的方法，其中，在所述划分后放大来自所述第一标 记物的信号和来自所述第二标记物的信号。13. 如权利要求12所述的方法，所述第一和第二标记物是核酸标记物。14. 如权利要求13所述的方法，所述核酸标记物经扩增以生成扩增子且所述检测包括 检测所述扩增子。15. 如权利要求14所述的方法，所述检测包括检测与所述扩增子相关的荧光信号。16. 如权利要求15所述的方法，所述荧光信号由荧光标记的多核苷酸探针生成。17. 如权利要求15所述的方法，所述荧光信号由用于扩增所述核酸标记物的一个或多 个引物生成。18. 如权利要求15所述的方法，所述焚光信号由焚光插入染料生成。19. 如权利要求1-18中任一项所述的方法，所述方法还包括测定包含所述第一标记物 和所述第二标记物的分区的数目。20. 如权利要求1-19中任一项所述的方法，所述分区是液滴或微通道。21. 如权利要求20所述的方法，所述液滴被不互溶的运载体液体围绕。22. 如权利要求1-21中任一项所述的方法，所述目标分子是蛋白质。23. 如权利要求1-21中任一项所述的方法，所述目标分子是核酸。24. 如权利要求23所述的方法，所述目标分子是DNA。25. 如权利要求23所述的方法，所述目标分子是RNA。26. 如权利要求25所述的方法，所述RNA是miRNA或mRNA。27. 如权利要求23所述的方法，所述目标分子在所述检测前不经扩增或连接。28. 如权利要求23所述的方法，所述目标分子在所述划分前不经扩增或连接。29. 如权利要求1-28中任一项所述的方法，所述第一探针和/或第二探针包含结合剂， 所述结合剂独立地选自抗体、适体和非抗体蛋白质支架。30. 如权利要求1-28中任一项所述的方法，所述第一探针和/或第二探针包含目标特 异性结合剂，所述目标特异性结合剂独立地选自核酸和锌指蛋白。31. 如权利要求1-30中任一项所述的方法，所述第一探针在所述孵育前连接所述目标 分子。32. 如权利要求1-31中任一项所述的方法，所述方法包括将混合物中的所述样品与超 过两种探针孵育。33. -种检测样品中目标分子的方法，所述目标分子连接或能够生成可检测分子，所述 方法包括， 将混合物中的所述样品与连接第一标记物的第一探针孵育，所述第一探针特异性结合 所述目标分子，前提是存在所述目标分子； 将所述混合物划分为两个或更多个分区； 在至少一个同一分区中检测是否存在所述第一标记物和所述可检测分子，从而检测所 述样品中的所述目标分子。34. 如权利要求33所述的方法，所述目标分子是酶，其能够将所述混合物中的底物转 化为所述可检测分子或中间分子，所述中间分子能进一步被所述第一标记物转化为所述可 检测分子。35. 如权利要求33所述的方法，所述目标分子连接或结合所述可检测分子。36. 如权利要求35所述的方法，所述目标分子包含焚光部分。37. -种检测样品形成复合物的至少第一目标分子与第二目标分子的相互作用的方 法，所述方法包括： 将混合物中的所述样品至少与连接第一标记物的第一探针和连接第二标记物的第二 探针孵育，所述第一探针特异性结合第一目标分子，前提是存在所述第一目标分子，且所述 第二探针特异性结合第二目标分子，前提是存在所述第二目标分子； 将所述混合物划分为两个或更多个分区；以及 在至少一个同一分区中检测是否存在所述第一标记物和所述第二标记物；从而检测所 述样品中的所述目标分子。38. 如权利要求37所述的方法，所述第一和第二目标分子是蛋白质。39. 如权利要求38所述的方法，所述第一探针和/或第二探针包含结合剂，所述结合剂 独立地选自抗体、适体和非抗体蛋白质支架。40. 如权利要求37或38所述的方法，所述第一和第二标记物包含核酸、荧光部分、亲和 标签或点击化学部分，且所述第一标记物不同于所述第二标记物。41. 如权利要求37-40中任一项所述的方法，所述第一标记物生成第一信号且所述第 二标记物生成第二信号且所述第一信号和所述第二信号是可区分的。42. 如权利要求37-40中任一项所述的方法，所述第一标记物和所述第二标记物联合 产生这样的信号：所述信号当所述第一标记物、所述第二标记物或两者不存在的情况下不 会产生。43. -种检测样品中目标分子或多个目标分子的相互作用的方法，所述方法包括： 将混合物中的样品至少与连接第一标记物的第一探针和连接第二标记物的第二探针 孵育，所述第一标记物生成可检测信号，所述第一探针特异性结合目标分子，前提是所述第 一目标分子存在于所述样品中，且所述第二探针与第一探针特异性结合相同的目标分子或 结合与所述第一探针特异性结合的目标分子相互作用的第二目标分子，前提是这类目标分 子存在于所述样品中； 将所述混合物划分为两个或更多个分区；以及 检测至少一个分区中所述第一标记物和/或所述第二标记物生成的可检测信号的淬 灭；从而检测所述样品中的目标分子或多个目标分子的相互作用。44. 如权利要求43所述的方法，所述第二标记物淬灭所述第一标记物生成的信号。45. 如权利要求43或44所述的方法，所述第一和第二标记物是荧光共振能转移 (FRET)对的成员。46. -种检测样品中目标分子的方法，所述方法包括： 将混合物中的样品至少与连接第一标记物的第一探针和连接第二标记物的第二探针 孵育，所述第一探针特异性结合与所述目标分子相互作用的分子组分，且所述第二探针与 所述目标分子竞争与所述分子组分相互作用； 将所述混合物划分为两个或更多个分区；以及 检测同时表达所述第一标记物和所述第二标记物的分区数目的减少；从而检测所述目 标分子。47. 如权利要求46所述的方法，其中，相对于对照样品测量同时表达所述第一标记物 和所述第二标记物的分区数目的减少，所述对照样品中已知不存在所述目标分子。48. 如权利要求46或47所述的方法，所述分子组分是酶且所述目标分子是所述酶的底 物。49. 如权利要求1-48中任一项所述的方法，所述方法包括使用混合物的至少一种组分 的两种或更多种浓度分析所述样品以区分目标分子特异性共定位与随机共定位。50. 如权利要求49所述的方法，所述方法包括估计所述样品中所述目标分子的含量和 /或浓度，具体方法为从观察到的所述样品中共定位事件数目中扣除预期的所述样品中随 机共定位事件数目。51. -种包含两个或更多个分区的分区文库，其中，至少一些分区包含含有第一标记物 的第一探针和含有第二标记物的第二探针。52. 如权利要求51所述的分区文库，包含至少500个分区。53. 如权利要求51或52所述的分区文库，其中，大部分分区包含含有第一标记物的第 一探针和含有第二标记物的第二探针。54. 如权利要求51-53中任一项所述的分区文库，所述第一和第二标记物包含核酸、焚 光部分、亲和标签或点击化学部分，且所述第一标记物不同于所述第二标记物。55. 如权利要求51-54中任一项所述的分区文库，所述第一标记物和所述第二标记物 联合产生这样的信号：所述信号当所述第一标记物、所述第二标记物或两者不存在的情况 下不会产生。56. 如权利要求51-54中任一项所述的分区文库，所述第一标记物生成第一信号且所 述第二标记物生成第二信号且所述第一信号和所述第二信号是可区分的。57. 如权利要求56所述的分区文库，所述第一标记物是第一酶且所述第二标记物是第 二酶且所述第一和第二酶的活性联合以生成指示所述第一和第二标记物存在的可检测信 号。58. 如权利要求51-57中任一项所述的分区文库，所述第一探针和/或第二探针包含结 合剂，所述结合剂选自抗体、适体和非抗体蛋白质支架。59. 如权利要求51-58中任一项所述的分区文库，其中，至少一些分区包含一种或多种 目标分子。60. 如权利要求59所述的分区文库，其中，各分区中存在平均不超过5个拷贝的一种或 多种目标分子。61. 如权利要求51-60中任一项所述的分区文库，所述分区是液滴。62. 如权利要求61所述的分区文库，所述液滴被不互溶的运载体液体围绕。63. 如权利要求51-60中任一项所述的分区文库，所述分区是微通道。64. 如权利要求51-60中任一项所述的分区文库，所述分区是微胶囊。
【专利摘要】本发明提供了检测样品中目标分子的方法，包括将样品与两种或更多种可检测经标记探针孵育，将样品划分为多个分区并在同一分区中检测是否存在两种或更多种探针。
【IPC分类】C40B20/04
【公开号】CN105102696
【申请号】CN201480020132
【发明人】A·M·麦考伊, S·蒂佐内弗, F·熊
【申请人】生物辐射实验室股份有限公司
【公开日】2015年11月25日
【申请日】2014年2月5日
【公告号】EP2954102A1, US20140228239, WO2014124046A1