鉴别细菌感染的方法
【专利说明】鉴别细菌感染的方法 发明领域
[0001] 本申请涉及至少一种用于鉴别来自腹膜样品的细菌感染性质的方法，具体而言， 所述感染是否由革兰氏-阳性和/或革兰氏-阴性细菌引起。更具体地，所述方法涉及鉴别 所述样品中一种或多种细胞和/或体液标志物的相对量。进一步，所述发明涉及治疗方法， 其涉及所述方法的使用，理想地允许在选择治疗方案和/或监测成功治疗效果中做出知情 决策。
[0002] 发明背景
[0003] 细菌感染依然是世界各地的发病率和死亡率的主要原因，尤其由于耐抗生素的病 原菌的空前蔓延。而且，标准诊断的不良表现阻碍有效的感染控制，并且因此关于有效治疗 的使用作出不恰当的选择。这种令人恐慌的情形正引起对临床实践，公共卫生和生物医学 研究的巨大挑战。
[0004] 疑似感染的当前诊断和治疗主要取决于可能的微生物病原体的阳性鉴定，该概念 在一个多世纪前由Robert Koch引入但从那以后没有被改变。细菌感染的致病病原体的阳 性鉴定不仅对指导和改善关于抗生素治疗选择的患者管理是关键性的，而且它提供给我们 关于背后的炎症机制以及如何操作这些机制以帮助解决感染的重要线索。
[0005]目前，检测和定性感染微生物需要经典的微生物学培养技术、基于光谱的分析和/ 或高度复杂的核苷酸鉴定方法。Mohan et al. 2011描述了核苷酸检测和免疫分析检测的组 合使用，例如，"针对在37°C杂交所优化的寡核苷酸探针便于与免疫分析整合"来诊断尿路 感染[5] C3Podsiadly et al. 2005 描述了检测特异性肺炎衣原体（Chlamydia pneumoniae) IgM、IgG和IgA血清抗体的水平以诊断尿路感染[6]。这些后面的分析被认为是不可靠的。
[0006] 而且，与对常规培养技术依赖相关的固有延迟明显地阻碍病原体鉴定。治疗医生 获得结果以能够特异性的和靶向的治疗通常需要两天或甚至更久。在一些疾病中，如肺结 核，这需要高达两个月。更重要地，在很多情况下，通过传统的方法不能培养细菌，这意味着 患者临床症状背后的原因依然未知。
[0007] 通常，当明显的临床症状出现时，感染只是表面的。有效的和特异的治疗干预取决 于致病微生物的早期检测和鉴定。照惯例，基于症状、起初的临床发现和炎症的其他基本实 验室标志物（如C-反应蛋白）确定患者处理。该方法通常是欠佳的因为太笼统并且缺乏 特异性。通过微生物鉴定和抗生素敏感性试验通常仅获得增加的特异性，并且这可伴随感 染最佳处理的延迟。使用广谱抗生素以覆盖多种可能的发病原因的趋势促成其他严重问题 如艰难梭菌（C. difficile)感染，以及细菌耐药性的发展。因此，存在明显的临床需求以实 现感染的较早和较好的检测和定性以1)改善患者结果；2)改善特异性抗感染药的使用；以 及3)降低抗菌素耐药性和其他严重感染的发展。能够实现这种效果的技术会提高患者体 验，并且确保患者处理的更持久更经济有效的方法。
[0008] 腹膜透析（PD)为用于具有严重慢性肾脏疾病的患者的治疗。疗法涉及经 Tenckhoff管将专门的透析液引入腹腔，目标是通过流体产生的透析梯度去除累积在肾脏 上的难以扩散的毒素和水。两个过程同时地发生在半渗透的腹膜上。富含葡萄糖的透析液 的感染导致腹膜炎，为ro的主要并发症，其具有明显的发病率和死亡率牵连。
[0009] 腹膜炎可具有对短期和长期患者健康的不利影响。在短期内，严重的腹膜炎发作 可导致需要立即去除Tenckhoff管，并且，因此，治疗失败。在长期内，复发或严重的腹膜炎 可导致腹膜增厚（纤维化）和膜通透性/功能的明显改变，其导致治疗失败。腹膜炎发作 的早期确认加上快速检查、诊断和有效的治疗对成功的结果是必要的。由于相对低的细菌 数量和培养它们所需的时长（通常很多天），使用标准技术鉴别致病微生物可能是困难的。 这导致"培养阴性"腹膜炎的现象，即，所有临床和实验室参数确认诊断结果，但是在0-50% 的情况下从没有鉴定到微生物[3]。因此，考虑到微生物确认中的延迟，所有患者开始双重 抗生素治疗以涵盖革兰氏-阳性和革兰氏-阴性细菌。只有当（如果）鉴别到微生物，改 进抗生素方案。如果ro流体样本依然是培养阴性的，然后需要患者经受延长的双重、广谱 的抗生素治疗。
[0010] 如上所述，尽管鉴别生物流体中的微生物的分子试验是可用的，它们通常遭受特 异性的缺乏、不可接受的假阳性高比率、和由于样品的污染或无症状携带者的非病原种类 的频繁鉴定。
[0011] 由此可见，迫切地需要指导疗法的医疗点方法，尤其是在微生物种类或毒性是结 果的决定因素的情况下。
[0012] 本公开涉及快速诊断腹膜疾病中感染的方法。在本研究中，我们在呈现急性腹膜 炎的第一天对ro患者进行详细的免疫和微生物分析。该技术的关键是发现复杂的细胞和 体液免疫应答的诱导紧随免疫系统对感染原的暴露。意外地，这种应答在暴露的几个小时 内时是显而易见的，并且在呈现有特性但不是诊断的"浑浊包"的时候可在具有急性临床症 状的腹膜透析患者的排出物中检测到这种应答。按照这样的方法，这些结果对具有疑似感 染的患者的鉴别诊断具有深远影响，并且可通过快速的基于生物标志物的诊断，较好地预 测风险建模，和改善的治疗靶向及其最终功效来帮助指导患者处理。
[0013] 发明概述
[0014] 根据本发明的第一方面，提供用于鉴别腹膜样品中的革兰氏-阴性细菌感染的方 法，所述方法包括：
[0015] (a)检验来自个体的所述腹膜样品以测定所述样品的总的T细胞群体内的V S 2+T 细胞的量，并且
[0016] (b)当总的T细胞群体内的VS2+T细胞的量相对于来自不具有革兰氏-阴性细菌 感染的个体的对照样品中总的T细胞群体内的V S 2+T细胞的量是增加的时；
[0017] (c)断定腹膜样品取自的个体具有革兰氏-阴性细菌感染。
[0018]本领域技术人员应了解，本文提及的革兰氏-阴性细菌感染涉及在革兰氏染色 方案中不能保留结晶紫染料的细菌的感染。革兰氏-阴性细菌的实例包括，但是不限于， 不动杆菌属（Acinetobacter)、气单胞菌属（Aeromonas)、拟杆菌属（Sacfero/cfes)、巴尔 通氏体属（Bartonella)、博代氏杆菌属（Bordetella)、布鲁氏菌属（Brucella)、伯克氏 菌属（Burkholderia)、弯曲杆菌属（Campylobacter)、衣原体属（Chlamydia)、金黄杆菌 属（Chryseobacterium)、梓檬酸杆菌属（Citrobacter)、肠杆菌属（Enterobacter)、埃希 氏杆菌属（Escherichia)、弗朗西斯氏菌属（Francisella)、梭菌属（Fusobacterium)、 嗜血杆菌属（Haemophilus)、哈夫尼菌属（Hafnia)、螺杆菌属（Helicobacter)、克雷伯 氏菌属（Klebsiella)、军团菌属（Legionella)、莫拉氏菌属（Moraxella)、摩根氏菌属 (Morganella)、奈瑟氏菌属（Neisseria)、泛菌属（Pantoea)、发光菌属（Photobacterium)、 变形杆菌属（Proteus)、普罗威登斯菌属（Providencia)、假单胞菌属（Pseudomonas)、沙 门氏菌属（Salmonella)、沙雷氏菌属（Serratia)、志贺氏杆菌属（Shigella)、寡养单胞 菌属（Stenotrophomonas)、韦荣球菌属（Veillonella)、弧菌属（Vibrio)、耶尔森氏菌属 (Yersinia)〇
[0019] 本文提及的腹膜样品指来自腹腔的流体样品，其包括腹腔流出物，通常来自ro患 者，或从腹腔内衬膜（腹膜）去除的组织。
[0020] 本文提及的来自不具有革兰氏-阴性细菌感染的个体的对照样品指使用任意一 项或多项鉴别革兰氏-阴性细菌感染的常规技术已表明不具有革兰氏-阴性细菌感染的样 品。
[0021 ] 在本发明的优选的实施方案中，可直接地或间接地进行检验来自个体的所述腹膜 样品以测定所述样品的总的T细胞群体内V S 2+T细胞的量。通过测定所述样品的总的T 细胞群体内V S 2+T细胞的量来进行来自个体的所述腹膜样品的直接检验，以测定所述样品 总的T细胞群体内V S 2+T细胞的量。通过测定所述样品的总的T细胞群体内的其他T细 胞的量，测定所述样品的总的T细胞群体，然后进行相减以确定所述样品的总的T细胞群体 内V S 2+T细胞的量，来进行来自个体的所述腹膜样品的间接检验，以测定所述样品的总的T 细胞群体内V 5 2+T细胞的量。备选地，通过分析替代标志物（即，代表V 5 2+T细胞的标志 物），例如通过测定V 丫 9+T细胞，pan- Y S +T细胞，pan- a 〃（ a / 阴性T细胞）或CD4_ ⑶8 _ ("双-阴性"或DN) T细胞，其通常全部或至少大多数细胞将为V S 2+T细胞，来进行来 自个体的所述腹膜样品的间接检验，以确定V S 2+T细胞的量。本领域技术人员将了解寻求 的细胞的性质以进行这种间接测定。
[0022] 优选地，所述腹膜的样品为来