经修饰的甘氨酸氧化酶的制作方法
【技术领域】
[0001 ] 本发明涉及经修饰的甘氨酸氧化酶、使用该经修饰的甘氨酸氧化酶分析甘氨酸的 方法等。
[0002] 发明背景
[0003] 已知氨基酸作为活体中的组成是非常重要的，并且一些氨基酸可以变为健康状况 的指示物。例如，提示了血浆中的甘氨酸浓度与肥胖症有关（非专利文献1)。甘氨酸是各 种食物中天然含有的，并且用作食物添加剂。因此，氨基酸（特别是甘氨酸）的测量在一大 批领域（诸如生物学调查、健康营养、医学治疗和食物制造）中具有重要的意义。
[0004] 使用诸如氨基酸分析仪、高效液相层析（HPLC)或LC-MS等仪器的方法广泛用作分 析包括甘氨酸在内的氨基酸的方法。然而，这些仪器是大型且昂贵的，并且需要维护和操作 仪器的技术知识和熟练程度，如此其引入、维护和利用需要高成本。还有，由于原则上有必 要序贯分析每份样本，分析多份样本花费较长的时间。为了解决这些问题，已经开发出使用 催化特定氨基酸的特异性反应的酶来分析氨基酸的方法，并且用于测量一些氨基酸的其试 剂盒已经是商品化的。还已经实现了利用酶在电化学或光学上测量特定氨基酸的生物传感 器（例如专利文献1，非专利文献2至4)。
[0005] 已知甘氨酸氧化酶是对甘氨酸起作用的酶（例如非专利文献5)。
[0006] 现有技术参考文献
[0007] 专利文献
[0008] 专利文献1 :国际公开文本W02005/075970
[0009] 非专利文献
[0010] 非专利文献 I :P. Felig, E. Marliss, G. F. Cahill Jr. (1969)N. Engl-j-MecUSlSll-Sie.
[0011] 非专利文献2 :A. Guerrieri, T. R. I. Cataldi, R. Ciriello. (2007) Sens. Actuators B Chem. 126, 424-430.
[0012] 非专利文献 3 :H. Olschewski，A. Erlenkotter，C. Zaborosch，G. -C. Chemnitius. (2000)Enzyme Microb. Technol. 26, 537-543.
[0013] 非专利文献 4 :H. Endo, Y. Hayashi, Y. Kitani, H. Ren, T. Hayashi, Y. Nagashima. (2008) Anal. Bioanal. Chem. 391, 1255-1261.
[0014] 非专利文献 5 :L. Caldinelli, M. Pedotti, L. Motteran, G. Molla, L. Pollegioni (2009)Biochimie 91,1499-1508.
[0015] 非专利文献 6 :S. E. Carpenter, D. J. Merkler (2003) Anal. Biochem. 323, 242-246.
【发明内容】
[0016] 本发明要解决的问题
[0017] 在使用酶的前述氨基酸测量中，期望的是与氨基酸测量有关的酶的特性（例如酶 的活性、稳定性和底物特异性）是卓越的。特别对于活性，在要在样本中检测的对象（诸如 血液中的氨基酸）的浓度较低时，在底物浓度较低的条件下需要高活性。甘氨酸氧化酶的 利用对于分析含有甘氨酸的样本是有希望的，但是它已经是有问题的，即迄今为止已经知 道其性质的甘氨酸氧化酶在活性和稳定性上较低（例如非专利文献6)。还有，尚未对许多 类型的氨基酸调查底物特异性。如上文描述，不可获得能够实际进行甘氨酸测量的酶。如 此，尚未实现使用酶的测量甘氨酸的实际方法或用于测量甘氨酸的试剂盒和生物传感器。
[0018] 用于解决问题的手段
[0019] 作为一项广泛的研究，本发明人已经想到仅必须通过使用具有与甘氨酸测量有关 的改善的特性的酶测量甘氨酸浓度，成功开发出具有此类改善的特性的甘氨酸氧化酶，并 且如此完成本发明。
[0020] 因而，本发明如下：
[0021] [1]. -种经修饰的酶，其中至少一个氨基酸残基突变以改善与甘氨酸测量有关的 甘氨酸氧化酶的一种或多种特性，其中所述一种或多种特性选自下组：
[0022] (a)所述甘氨酸氧化酶对甘氨酸的活性；
[0023] (b)所述甘氨酸氧化酶的热稳定性；和
[0024] (C)所述甘氨酸氧化酶对甘氨酸的底物特异性。
[0025] [2]. [1]的经修饰的酶，其中所述突变是所述甘氨酸氧化酶的氨基酸序列中的一 种或多种选自下组的取代：(a) TTS基序中的第一苏氨酸的取代，（b) TTS基序中的丝氨酸的 取代，（c) HCY基序中的半胱氨酸的取代，（d) LRP基序中的亮氨酸的取代，（e) GML基序中的 甲硫氨酸的取代，（f) SG基序中的丝氨酸的取代，和（g)PGT基序中的甘氨酸的取代。
[0026] [3]. [2]的经修饰的酶，其中所述TTS基序中的第一苏氨酸被取代为丙氨酸、丝氨 酸、半胱氨酸或甘氨酸。
[0027] [4]. [2]或[3]的经修饰的酶，其中所述TTS基序中的丝氨酸被取代为赖氨酸。
[0028] [5]. [2]_[4]中任一项的经修饰的酶，其中所述HCY基序中的半胱氨酸被取代为 丙氨酸、天冬氨酸、甘氨酸、组氨酸、天冬酰胺、色氨酸、酪氨酸、或丝氨酸。
[0029] [6]. [2]_[5]中任一项的经修饰的酶，其中所述LRP基序中的亮氨酸被取代为异 亮氨酸、缬氨酸、半胱氨酸、苏氨酸、或脯氨酸。
[0030] [7]. [2]-[6]中任一项的经修饰的酶，其中所述GML基序中的甲硫氨酸被取代为 异亮氨酸。
[0031] [8]. [2-7中任一项的经修饰的酶，其中所述SG基序中的丝氨酸被取代为精氨酸。
[0032] [9]. [2]_[8]中任一项的经修饰的酶，其中所述PGT基序中的甘氨酸被取代为酪 氨酸或谷氨酰胺。
[0033] [10]. [1]_[9]中任一项的经修饰的酶，其中所述甘氨酸氧化酶源自芽孢杆菌属 (Bacillus)〇
[0034] [11]. [1]_[10]中任一项的经修饰的酶，其是下述（1)或⑵的蛋白质：
[0035](1)蛋白质，其包含在SEQ ID N0:2的氨基酸中具有选自下组的一个或多个氨基酸 残基的一个或多个取代的氨基酸序列：TTS基序中的第一苏氨酸、TTS基序中的丝氨酸、HCY 基序中的半胱氨酸、LRP基序中的亮氨酸、GML基序中的甲硫氨酸、SG基序中的丝氨酸和PGT 基序中的甘氨酸，所述一个或多个氨基酸残基取代为下述（i)-(vii)的一个或多个氨基酸 残基：
[0036] (i)对于TTS基序中的第一苏氨酸的取代的丙氨酸、丝氨酸、半胱氨酸、或甘氨酸；
[0037] (ii)对于TTS基序中的丝氨酸的取代的赖氨酸；
[0038] (iii)对于HCY基序中的半胱氨酸的取代的丙氨酸、天冬氨酸、甘氨酸、组氨酸、天 冬酰胺、色氨酸、酪氨酸或丝氨酸；
[0039] (iv)对于LRP基序中的亮氨酸的取代的异亮氨酸、缬氨酸、半胱氨酸、苏氨酸、或 脯氨酸；
[0040] (V)对于GML基序中的甲硫氨酸的取代的异亮氨酸；
[0041] (vi)对于SG基序中的丝氨酸的取代的精氨酸；和
[0042] (vii)对于PGT基序中的甘氨酸的取代的酪氨酸或谷氨酰胺；或
[0043] (2)蛋白质，其包含在SEQ ID N0:2的氨基酸序列中具有选自下组的一个或多个氨 基酸残基的一个或多个取代的氨基酸序列中具有氨基酸残基的一个或几个补充突变的氨 基酸序列：TTS基序中的第一苏氨酸、TTS基序中的丝氨酸、HCY基序中的半胱氨酸、LRP基 序中的亮氨酸、GML基序中的甲硫氨酸、SG基序中的丝氨酸、和PGT基序中的甘氨酸，所述一 个或多个氨基酸残基取代为上述（i)-(vii)的一个或多个氨基酸残基，并且具有选自下组 的一种或多种改善的特性：
[0044] (a)所述甘氨酸氧化酶对甘氨酸的活性；
[0045] (b)所述甘氨酸氧化酶的热稳定性；和
[0046] (c)所述甘氨酸氧化酶对甘氨酸的底物特异性。
[0047] [12]. -种用于分析甘氨酸的方法，其包括使用[1]_[11]中任一项的经修饰的酶 测量测试样品中含有的甘氨酸。
[0048] [13. [12]的方法，其中除[1]_[11]中任一项的经修饰的酶外，使用4-氨基安体比 林和酚及过氧化物酶实施甘氨酸的测量。
[0049] [14]. -种生产乙醛酸的方法，其包括使用[1]_[11]中任一项的经修饰的酶，从 甘氨酸形成乙醛酸。
[0050] [15]?-种多核苷酸，其编码[1]_[11]中任一项的经修饰的酶。
[0051] [16] ?-种表达载体，其包含[15]的多核苷酸。
[0052] [17]. -种转化体，其包含[16]的表达载体。
[0053] [18]. -种生产经修饰的酶的方法，其包括使用[17]的转化体形成所述经修饰的 酶，在所述经修饰的酶中至少一个氨基酸残基突变以改善与甘氨酸测量有关的甘氨酸氧化 酶的特性。
[0054] [19]. -种用于分析甘氨酸的试剂盒，其包含[1]-[11]中任一项的经修饰的酶。
[0055] [20]. [19]的用于分析甘氨酸的试剂盒，其进一步包含下列至少一种：用于反应 的缓冲剂溶液或缓冲剂盐、用于检测过氧化氢的试剂、用于检测氨的试剂和用于检测乙醛 酸的试剂。
[0056] [21]. -种用于分析甘氨酸的检测系统，其包含（a)装置和（b) [1]_[11]中任一项 的经修饰的酶。
[0057] [22]. [21]的用于分析甘氨酸的检测系统，其进一步包含（c)用于反应的缓冲剂 溶液或缓冲剂盐、用于检测过氧化氢的试剂、用于检测氨的试剂和用于检测乙醛酸的试剂 中的至少一种，且其中所述装置是微通道芯片。
[0058] [23]. -种用于分析甘氨酸的酶传感器，其包含（a)用于检测的电极和（b) [1]_[11]中任一项的经修饰的酶，所述经修饰的酶是固定或保留在所述用于检测的电极上 的。
[0059] 发明效果
[0060]由于本发明的经修饰的酶对甘氨酸的活性得到增强，它可用于甘氨酸的快速且高 度灵敏性测量和/或乙醛酸生产。由于本发明的经修饰的酶在水性溶液中的热稳定性上是 卓越的，它在稳定性上也是卓越的。因此，本发明的经修饰的酶特别可用作液体试剂。此外， 本发明的经修饰的酶可以特异性测量甘氨酸，因为它在对甘氨酸的底物特异性方面是卓越 的。本发明的分析方法可用于一大批领域，诸如生物学调查、健康营养、医学治疗和食物制 造。
[0061] 附图简述
[0062] 图1显示了每种野生型甘氨酸氧化酶对甘氨酸的底物特异性。（I)Gly :lmM甘氨 酸，（2) 25mix :含有各ImM的标准20种氨基酸、胱氨酸、牛磺酸、瓜氨酸、鸟氨酸和a -氨基 丁酸的混合溶液，和（3) 25mix-Gly:从25混合物扣除Gly的混合溶液（其在下文应当适 用）。
[0063] 图2显示了针对甘氨酸的突变体甘氨酸氧化酶（T42A/C245S/L301V)的底物特异 性。
[0064] 图3显示了针对甘氨酸的突变体甘氨酸氧化酶（T42A/C245S/L301V/G304Q)的底 物特异性。
[0065] 图4显示了通过使用突变甘氨酸氧化酶（T42A/C245S/L301V)的端点方法获得的 吸光度与反应溶液中的Gly浓度之间的关系。
[0066] 图5显示了通过使用突变甘氨酸氧化酶（T42A/C245S/L301V/G304Q)的端点方法 获得的吸光度与反应溶液中的Gly浓度之间的关系。
【具体实施方式】
[0067] 本发明提供了经修饰的酶。本发明的经修饰的酶可以是如下的酶，其中甘氨酸氧 化酶中的至少一个氨基酸残基突变以改善与甘氨酸测量有关的甘氨酸氧化酶特性。
[0068] 氨基酸残基的突变的例子可以包括取代、缺失、添加和插入，并且取代是优选的。
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