包括表达植物分裂素氧化酶的修饰植物形态学、生物化学和生理学的方法

专利名称：包括表达植物分裂素氧化酶的修饰植物形态学、生物化学和生理学的方法
技术领域：
一般地，本发明涉及修饰诸如一个或多个发育过程和/或环境适应过程等植物形态学、生物化学和生理学性质或特性的方法，所述修饰包括但不限于根生长的起始、刺激或增加，和/或不定根形成，和/或侧根形成，和/或根向地性，和/或枝条生长，和/或顶端优势，和/或分支，和/或衰老时机安排，和/或开花时机安排，和/或花形成，和/或种子发育，和/或种子产量的修饰。也提供了增加种子大小和/或重量，增加胚大小和/或重量和增加子叶大小和/或重量的方法。该方法包括在植物中表达可操作地处于可调节启动子序列，如细胞特异性启动子、组织特异性启动子或器官特异性启动子序列控制下的细胞分裂素降解控制蛋白质，特别是细胞分裂素氧化酶。优选地，本发明修饰的特征是细胞分裂素介导和/或植物生长素介导的特征。本发明延及用于进行本发明方法的基因构建体和延及随之产生的转基因植物，与转基因植物在其它方面等基因的对应植物比较，该转基因植物具有改变的形态学和/或生物化学和/或生理学性质。
背景技术：
根是高等植物的重要器官。它们的主要功能是在土壤中固定植物和吸收水分和营养物(N-营养，矿物质等)。因此，特别是在营养物限制的情况下，根的生长对地上器官有直接或间接的影响。根也与次级植物产物，如防御化合物和植物激素的产生有关。
根也是许多重要大宗作物中的贮藏器官。在欧洲，甜菜是最重要的产糖植物(2.6×108吨/年；占世界产量的38％)。树薯(木薯)、薯蓣、甘薯(batate)是重要的淀粉生产者(约1.5×108吨/年)。其淀粉含量可以高达马铃薯的两倍。根也是许多蔬菜(例如，胡萝卜、小萝卜)，草本植物(姜、Kukuma)和药用植物(例如，人参)中消耗的相关器官。此外，根中发现的次级植物产物对于化学和制药工业具有经济重要性。以薯蓣为例，其包含甾类激素合成的基本分子。另一个例子是紫草素，其通过发根培养物中紫草(Lithospermum erythrorhizon)根产生。可利用紫草素的抗炎性、抗肿瘤和伤口愈合的性质。
而且，通过增加水分的可利用性和吸收，农作物植物改良的根生长也将增强与杂草植物的竞争性和改进在干旱地区的生长。
改良的根生长也与生态学目的，如生物治疗和土壤侵蚀的预防/阻止有关。
因为在大田中评估根体系结构性状的困难，根体系结构是通过传统育种大部分未探索的领域。因此，生物技术对这种性状的改进可能有显著的影响，因为生物技术不依赖于大田中的大规模筛选。相反，生物技术方法需要决定植物特定特征的分子成分的基本理解。今天，该知识仅仅是部分的，因此，目前为止，生物技术不能实现在该领域的突破。
明确确定的根生长调节剂是植物生长素。给生长的植物施用吲哚-3-乙酸(IAA)刺激侧根发育和侧根伸长(Torrey，Am J Bot 37257-264，1950；Blakely等Bot Gaz 143341-352，1982；Muday和Haworth，PlantPhysiol Biochem 32193-203，1994)。暴露于一定范围IAA的根引起了增加数量的侧根(Kerk等，Plant Physiol，122925-932，2000)。而且，当对特定浓度外源植物生长素应答而产生了侧根的根随后暴露于更高浓度IAA时，在存在的侧根间隔发现了许多额外的侧根(Kerk等.，Plant Physiol，122925-932，2000)。相反地，在含有植物生长素转运抑制剂，包括NPA的琼脂上，根的生长减少了侧根的数量。(Muday和Haworth，Plant Physiol Biochem 32193-203，1994)。
已经分离了含有增加的内源IAA水平的拟南芥(Arabidopsis)突变体(Boerjan等，Plant Cell 71405-141，1995；Celenza等，Gene Dev92131-2142，1995；King等，Plant Cell 72023-2037，1995；Lehman等，Cell 85183-194，1996)。现在已知它们是位于2号染色体上的单基因座的等位基因。这些突变的幼苗有额外的不定根和侧根，这与上述外部植物生长素施用的作用一致。
植物生长素对不定根和侧根形成的刺激作用表明转基因植物中植物生长素的过量产生是增加根生长的有效策略。然而，也怀疑是否这将产生具有改良特征的商品。除了植物生长素对不定根和侧根形成的刺激作用外，植物生长素的过量产生引起了其它作用，如叶数的降低，异常的叶形态(狭窄、卷曲的叶片)，发育不全的花序、增加的顶端优势，茎上不定根的形成，从农艺学角度讲，这些作用的大多数都是不期望的(Klee等，Genes Devel 186-96，1987；Kares等，Plant Mol Biol 15225-236，1990)。因此，依赖于增加的植物生长素合成的方法的主要问题是限制问题，即，将植物生长素的作用限制于根。通过利用组织特异性的启动子不可能克服限制的问题植物生长素在植物中转运，因此它们的作用不限于合成位点。另一个问题是是否植物生长素将一直增加总的根生物量。对于琼脂上生长的植物，注意到增加的浓度逐步刺激侧根形成，但同时抑制这些根的过度生长(Kerk等，Plant Physiol，122925-932，2000)。
种子是高等植物的繁殖单位。植物种子含有发芽后确保胚营养的储藏化合物。这些贮藏器官显著地贡献于人类营养和家畜饲养。种子包含三个主要部分，即胚、胚乳和种皮。储藏化合物存贮在贮藏器官，该贮藏器官或者是胚乳(由双受精产生，例如在所有谷类植物中)，所谓的外胚乳(来源于珠心组织)或子叶(例如，豆类品种)。贮藏化合物是脂类(含油种子油菜)、蛋白质(例如谷类植物的糊粉中)或碳水化合物(淀粉、寡糖如棉子糖)。
淀粉是谷类植物种子的贮藏化合物。最重要的物种是玉米(根据FAO1995，年产量是约570mio t)，水稻(540mio t p.a.)和小麦(530mio tp.a.)。蛋白质丰富的种子是不同种类的豆类(菜豆属(Phaseolus spec.)，蚕豆(Vicia faba)，豇豆属(Vigna spec.)；约20mio t p.a.)，豌豆(Pisum sativum；14mio t p.a.)和大豆(Glycine max；136mio t p.a.)。大豆种子也是脂类的重要来源。脂类丰富的种子也是不同芸苔属(Brassica species)(约30mio t p.a.)、棉花、芝麻、亚麻、罂粟、蓖麻、向日葵、花生、椰子、油棕和一些其它较少经济重要性植物的种子。
受精后，发育的种子变成了从植物源器官吸收营养化合物的吸收器官，并且利用它们在贮藏器官中产生储藏化合物。对于许多不同农作物物种而言，期望种子大小和重量的增加。除了增加的淀粉、蛋白质和脂类储藏和因此增加的摄取的营养外，种子大小和/或重量和子叶大小和/或重量的增加与发芽后快速生长(早期活力)和增加的胁迫耐受性相关。细胞分裂素是测定吸收强调的重要因子。通常的概念预测，细胞分裂素是吸收强度的正调节物。
许多报道把不同发育过程诸如根生长和分支、枝条中顶端优势的控制、叶绿体发育和叶片衰老中的刺激或抑制功能归因于细胞分裂素(MokM.C.(1994)在“细胞分裂素化学、活性和功能”，Mok，D.W.S.& Mok，M.C.编辑(CRC Boca Raton，F1)，155-166页)。关于细胞分裂素生物学功能的结论主要来源于外源细胞分裂素施用或内源增加细胞分裂素水平的结果的研究(Klee，H.J.& Lanehon，M.B.(1995)在“植物激素生理学、生物化学和分子生物学”，Davies，P.J.编辑(Kluwer，Dordrdrocht，the Netherlands)，340-353页，Smulling，T.，Rupp，H.M.Frank，M&Schafer，S.(1999)植物生长和发育调节的进展，Surnad，M.Pac P.&Beck，E.编辑(Peres，Prague)，85-96页)。到现在为止，还不可能回答相反的问题如果降低内源细胞分裂素的浓度，植物生长和发育的结果是什么？预期具有降低细胞分裂素含量的植物产生关于细胞分裂素限制因此可能进行调节的过程的更准确的信息。不同于其它植物激素诸如脱落酸、赤霉素和乙烯，还没有分离出细胞分裂素生物合成突变体(Hooykens，P.J.J.，Hall，M.A.& Libbeuga，K.R.，编辑(1999)植物激素的生物化学和分子生物学(Elsevier，Amsterdam)。
分解代谢酶细胞分裂素氧化酶(CKX)在控制植物组织中细胞分裂素的水平中起主要作用。在大量高等植物和不同植物组织中已经发现了CKX活性。该酶是含有FAD的氧化还原酶，其催化具有不饱和类异戊二烯侧链的细胞分裂素的降解。游离碱基iP和Z，及它们各自的核糖核苷是优选的底物。iP分解代谢的反应产物是腺嘌呤和不饱和醛3-甲基-2-butonal(Armstrong，D.J.(1994)在“细胞分裂素化学，活性和功能”，Mok.D.W.S & Mok，M.C.编辑(CRC Boca Raton，FL)，139-154页)。最近，已经分离了来源于玉米(Zea mays)的细胞分裂素氧化酶基因(Morris，R.O.，Bilyeu，K.D.，Laskey，J.G.& Cherich，N.N.(1999)Biochem.Biophys.Res.Commun.255，328-333，Houba-Heria，N.，Pethe，C.d’Alayer，J & Lelouc，M.(1999)Plant J.17615-626)。CKX基因表达的操作可以部分地克服细胞分裂素生物合成突变体的缺乏，并且可以用作研究高等植物整个生命周期期间iP和Z-型细胞分裂素相关性的有力工具。
通过内源细胞分裂素浓度的降低，本发明克服了与植物生长素作用的限制，根过度生长(outgrowth)的维持和增加的种子、胚和子叶大小和/或重量的提高有关的问题。
发明概述
本发明提供了植物细胞分裂素氧化酶蛋白质，编码这种蛋白质的核酸序列，和载体，宿主细胞和包含该蛋白质、核酸序列和载体的转基因植物细胞，植物和植物部分。例如，本发明涉及基因构建体，其包含编码具有拟南芥(Arabidopsis thaliana)细胞分裂素氧化酶活性的蛋白质的基因。可以在调节型启动子控制下表达该基因。可以通过内源组织特异性或环境特异性因子调节该启动子，或者，可替代地，可以通过特异性化学试剂的施用诱导该启动子。
本发明也涉及通过在植物或植物部分中细胞分裂素氧化酶基因的表达或编码降低活性细胞分裂素水平的蛋白质的核酸表达，修饰根系体系结构(root architecture)和生物量的方法。优选地，表达受对根或根的一些组织或细胞类型特异的启动子控制。
此外，本发明涉及增加种子大小和/或重量，胚大小和/或重量，和子叶大小和/或重量的方法。该方法涉及在植物或植物部分中细胞分裂素氧化酶基因的表达或编码降低活性细胞分裂素水平的蛋白质的核酸的表达。优选地，表达受优先引导在种子、胚或子叶中表达的启动子控制。


图1植物细胞分裂素氧化酶基因的图示。
所示的是从玉米(ZmCKX1，记录号AF044603，Biochem.Biophys.Res.Com.255328-333，1999)和拟南芥属(Arabidopsis)(AtCKX1到AtCKX4)分离的不同细胞分裂素氧化酶基因的结构。用′E′命名外显子，用阴影盒子表示。用白色盒子表示内含子。进一步标明了基因大小(在每个结构的上部，以kb表示)，基因的记录号(在名称下面)和表示0.5kb的大小棒。
图2植物细胞分裂素氧化酶氨基酸序列的比对(alignment)
比对来源于玉米(ZmCKX1)和拟南芥(Arabidopsis)(AtCKX1到AtCKX4)的细胞分裂素氧化酶的氨基酸序列。通过黑色盒子标记相同的氨基酸残基，用灰白盒子标记相似的氨基酸残基。氨基酸相似性组(M，I，L，V)，(F，W，Y)，(G，A)，(S，T)，(R，K，H)，(E，D)，(N，Q)。
图3表达AtCKX1的烟草和拟南芥植物的Northern印迹分析
(A)与野生型SNN烟草(泳道9)比较，组成地表达的烟草植物(泳道1-8)的Northern印迹分析，
(B)12小时诱导后叶片中四环素诱导的基因表达和组成型表达克隆的比较。泳道2-9，4个不同AtCKX1-W38TetR克隆(+，-，有或无四环素处理)的叶，泳道1，组成地表达35S::AtCKX1克隆，
(C)组成地表达AtCKX1基因的拟南芥(Arabidopsis)植物的Northern印迹分析。泳道2-4，与野生型拟南芥(Arabidopsis)植物(泳道1)比较，3个不同组成型表达35S::AtCKX1克隆。
图4 35S::AtCKX1转基因拟南芥(Arabidopsis)植物的生长特征
(A)两株野生型幼苗(左)与两株35S::AtCKX1表达幼苗(右)比较。注意到转基因幼苗中增加的不定根形成和增加的根分支。在发芽后14天照的该照片。植物以垂直位置体外生长在培养皿中的MS培养基上。
(B)除了根用甲苯胺蓝染色外，与A类似。
(C)发芽后3周，具有35S::AtCKX1转基因幼苗的培养皿俯视图。
(D)液体培养中生长的35S::AtCKX1转基因植物。在这些条件下，野生型幼苗的根生长不好(未显示)。
(E)表达35S::AtCKX1基因的转化体(T0)(右侧的3株植物)，左侧所示的是野生型植物。
(F)土壤中生长的T1植物的表型。野生型植物(左)与两株35S::AtCKX1转基因植物比较。
图5过量表达AtCKX2的拟南芥(Arabidopsis)植物的表型表达35S::AtCKX2的拟南芥(Arabidopsis)植物的T1代(右侧两株植物)与野生型(左侧植物)比较。
图6表达AtCKX2的烟草和拟南芥(Arabidopsis)植物的Northern印迹分析
(A)与野生型SNN烟草(泳道8)比较，组成地表达的烟草植物(泳道1-7)的Northern印迹分析。
(B)组成地表达AtCKX2基因的拟南芥植物的Northern印迹分析。与野生型拟南芥(Arabidopsis)植物(泳道1)比较，泳道2-8，7个不同组成地表达35S::AtCKX2的克隆。
图7表达AtCKX1和AtCKX2的烟草植物的枝条表型
(A)6周龄植物的俯视图。
(B)开花期的烟草植物。
(C)茎伸长的动力学。箭头标出了开花的开始。在箭头上方标出了在此时期的植物年龄(发芽后天数)和叶片数。棒表示SD；n＝12。
(D)发芽后68天到100天之间形成的叶数(n＝12)和这些叶片的最终表面面积(100％野生型是3646±144cm2；n＝3)。
(E)叶片大小和衰老的比较。叶来自从上部开始第4，9，12，16和20个节点(从左到右)。
图8表达AtCKX的转基因烟草植物的根表型
(A)发芽后17天的幼苗。
(B)开花期土壤生长植物的根系统。
(C)发芽后10天，根长度、侧根(LR)和不定根(AR)数。
(D)外源细胞分裂素对根生长抑制的剂量-应答曲线。棒表示±SD；n＝30。
图9表达35S::AtCKX1的烟草植物中腋生枝分生组织的生长
图10过量表达AtCKX1的烟草植物与野生型(WT)烟草比较的枝分生组织、叶和根分生组织的组织学
(A)通过营养枝顶端分生组织的纵向正中切面。P，叶原基。
(B)叶片的次级叶脉中的维管组织。X，木质部，PH，韧皮束。
(C)完全发育叶片的横截面。
(D)叶片上表皮的扫描电子显微术。
(E)用DAPI染色的根端。RM，根分生组织。
(F)发芽后10天，根分生组织的纵向正中切面。RC，根冠；PM，原分生组织。
(G)离顶端10mm的横向根切面。E，表皮，C1-C4，皮层细胞层，X，木质部，PH，韧皮部。棒是100μm。
图11表达AtCKX3和AtCKX4的烟草植物的Northern即迹分析
(A)组成地表达AtCKX3的烟草植物的Northern印迹分析。泳道名称表示各个转基因植物号，WT是野生型SNN烟草。上部印迹是用AtCKX3特异性探针探测的，下部印迹是用25S rRNA特异性探针探测的，并且作为RNA加样的对照。
(B)组成地表达AtCKX4的烟草植物的Northern印迹分析。泳道名称表示各个转基因植物号，WT是野生型SNN烟草。上部印迹是用AtCKX4特异性探针探测的，下部印迹是用25S rRNA特异性探针探测的，并且作为RNA加样的对照。
图12 AtCKX2转基因烟草植物和野生型植物的交互嫁接
(A)左侧的两株植物对照(嫁接在WT砧木上的WT接穗)。右侧的两株植物嫁接在AtCKX2-38转基因砧木上的WT接穗。
(B)左侧对照(嫁接在WT砧木上的WT接穗)。右侧嫁接在WT砧木上的AtCKX2-38植物接穗。
(C)根面积的放大。左侧对照(嫁接在WT砧木上的WT接穗)。右侧嫁接在AtCKX2-38转基因砧木上的WT接穗。
(D)不定根的形成。左侧对照(嫁接在WT砧木上的WT接穗)。右侧嫁接在AtCKX2-38转基因砧木上的WT接穗。
图13拟南芥(Arabidopsis)种子、胚和幼苗的表型
(A)AtCKX1转基因系种子和野生型种子。棒条大小1mm。
(B)AtCKX1，AtCKX2，AtCKX3和AtCKX4转基因系种子和野生型种子。棒条大小1mm。
(C)AtCKX1转基因拟南芥(Arabidopsis)和野生型植物的成熟胚。棒条大小是200μm。成熟种子在20％ EtOH中吸收12小时，从种皮挤出胚，用水合氯醛清洗胚而获得胚，并且用Nomarski光学器件照相。
(D)发芽后4天野生型和表达AtCKX1的拟南芥(Arabidopsis)幼苗。
(E)D的近距离照片。
图14野生型和4个研究的AtCKX基因每一个基因的2个单独克隆的种子重量。通过分析每个克隆的5个不同批次的200粒种子获得平均重量。
发明详述
为了绕过与增加植物生长素生物合成有关的上述问题，决定进行可替代的方法。我们推理，与增加的植物生长素水平比较，植物生长素生物拮抗剂的下调可能引起对根生长相似或者甚至更优越的作用。尽管激素作用和相互作用是极其复杂的，但是我们假定细胞分裂素可以起到对根生长而言的植物生长素拮抗剂的作用。植物组织培养的激素研究已经表明，植物生长素对细胞分裂素的比率比这些激素的每种激素的绝对水平对器官发生更重要，实际上，这表明了这些激素至少在一些生物过程中起拮抗剂的作用。而且，通过细胞分裂素的外源施用抑制侧根形成。有趣地，根伸长也受细胞分裂素处理负影响，这表明细胞分裂素控制根分支和根过度生长。
综合起来，目前的文献数据表明增加的细胞分裂素水平负面地影响根生长，但是还不理解该过程的机理。植物中细胞分裂素合成位点是根尖和枝条幼年组织。细胞分裂素的内源浓度在nM范围。然而，因为它们定量是困难的，所以需要提取相对大的组织量，并且不知道实际局部浓度。细胞分裂素的亚细胞区室化还不清楚。一般地认为游离碱和核糖核苷定位在细胞质和核中，而葡糖苷定位在液泡中。也存在具有稍微不同化学结构的不同细胞分裂素。结果，不知道是否应该将外源细胞分裂素的作用归因于总的细胞分裂素浓度的增加还是归因于与植物带有的细胞分裂素的其它形式(其在结构、细胞或亚细胞定位上不同)对受体、转运蛋白、运载蛋白和修饰酶的竞争。
为了检验根中细胞分裂素水平实际上超过了根生长最佳水平的假设，从拟南芥(Arabidopsis thaliana)克隆编码细胞分裂素氧化酶(其是细胞分裂素代谢酶)的新的基因(命名为AtCKX)，随后在转基因烟草和拟南芥(Arabidopsis)中，在强组成型启动子控制下表达该基因。显示AtCKX mRNA表达和增加的细胞分裂素氧化酶活性的转化体也显示了增加的根形成和生长。也观察到对枝生长的负作用。后者与这些植物中细胞分裂素氧化酶基因的组成表达一致，说明了细胞分裂素氧化酶基因的限制表达对一般植物生长性质的重要性。通过利用细胞、组织或器官特异性启动子可以获得细胞分裂素氧化酶活性的限制，因为细胞分裂素降解是受限于表达CKX蛋白质的组织和细胞的过程，这与上述依赖于激素合成的方法形成了对比。
观察到细胞分裂素氧化酶表达对枝条生长的负作用证明细胞分裂素氧化酶是促进生长的化学试剂设计或筛选的目的靶。这种化学试剂应该抑制细胞分裂素氧化酶活性，优选地，应该不转运到根，并且应该快速在土壤中降解，这样这些化学试剂的施用将不会抑制根生长。细胞分裂素也延迟了叶衰老，这意味着积极的作用将包括光合组织的生长和维持。此外，细胞分裂素延迟叶衰老、增加变绿(叶绿体含量)和减少枝条顶端优势的观察资料表明以抑制植物地上部分CKX活性为基础的策略(如反义、核酶和共抑制技术)可能引起延迟的衰老、增加的叶片变绿和增加的分支。
类似地，观察到细胞分裂素氧化酶表达对根生长的积极作用证明细胞分裂素氧化酶是除草剂设计或筛选的目的靶。这种除草剂应该抑制细胞分裂素氧化酶活性，优选地应该不转运到枝条、并且在可以通过土壤施用到根的溶剂中应该是可溶及相对稳定的。
至今仍然不知道细胞分裂素氧化酶过量表达对植物发育和体系结构(architecture)的这些作用，因此不可能设想本发明和其实施方式。
观察到的对枝条生长的不利作用证明细胞分裂素氧化酶的操作可以用于获得矮化表型。例如，在商品农作物，如谷类植物和果树中，矮化表型特别有用。
根据本发明，出人意料地发现过量表达细胞分裂素氧化酶基因的转基因植物生长出了增加大小和/或重量的种子(包括胚)和子叶。因为曾经预期降低的细胞分裂素含量与降低的器官生长相关，所以这些结果是令人惊奇的。
本发明优选的实施方式涉及细胞分裂素氧化酶表达对植物生长和体系结构，特别是根生长和体系结构，种子大小和重量，胚大小和重量及子叶大小和重量的积极作用。拟南芥属(Arabidopsis)中细胞分裂素氧化酶基因家族包含至少6个成员(参见下面的实施例)，并且本发明人已经表明用这些基因中的一些基因在转基因植物中达到的作用存在量的差异。因为在许多绿色植物中(Hare和van Staden，Physiol Plant91128-136，1994；Jones和Schreiber，Plant Growth Reg 23123-134，1997)，和其它生物体中(Armstrong，在“细胞分裂素化学，活性和功能”，Mok and Mok编辑，CRC Press，pp139-154，1994)存在细胞分裂素氧化酶活性的证据，期望可以从其它生物体分离所述拟南芥(Arabidopsis)细胞分裂素氧化酶的功能性同系物。因此，在本发明中有作用的细胞分裂素的序列不需要与这里所述的这些相同。本发明特别用于谷类农作物和一般而言单子叶农作物，并且例如，也可以利用来源于小麦或玉米的细胞分裂素氧化酶基因(Morris等，1999；Rinaldi andComandini，1999)。设想具有细胞分裂素活性或具有任何其它细胞分裂素代谢活性的其它基因(参见Za
ímalová等，植物激素的生物化学和分子生物学，Hooykaas，Hall和Libbenga(编辑)，ElsevierScience，141-160页，1997)也可以用于本发明的目的。类似地，编码将增加内源细胞分裂素代谢活性的蛋白质的基因也可以用于本发明的目的。原则上，通过干扰在细胞分裂素下游起作用的基因，如参与细胞分裂素信号转导途径的受体或蛋白质，也可以获得类似的表型。
对于本发明的目的，应该理解术语“根生长”包括在单子叶植物和双子叶植物中，在根不同发育阶段，组成根系的不同部分的所有生长方面。应该理解，一个或多个根的部分包括初生根、侧根、不定根等的增加的生长可以引起增加的根生长，所有这些都落入本发明范围内。
对于本发明的目的，应该理解，种子重量或种子大小的增加可以包括胚、胚乳、糊粉和种皮之中一个或多个大小的增加。而且，胚大小和/或重量的增加可以包括与其有关的不同器官诸如子叶、下胚轴和根的增加。
根据第一实施方式，本发明涉及刺激根生长和/或增加侧根和/或不定根形成和/或改变根向地性的方法，该方法包括植物细胞分裂素氧化酶的表达或者包括降低植物或植物部分中活性细胞分裂素水平的另一种蛋白质的表达。
在另一个实施方式中，本发明涉及通过增加植物中细胞分裂素氧化酶活性或水平或者通过降低植物或植物部分中活性细胞分裂素水平的另一种蛋白质的表达增加植物种子大小和/或重量的方法。优选地，增加的细胞分裂素氧化酶水平或活性或者降低植物或植物部分中活性细胞分裂素水平的另一种蛋白质的表达定位于种子包括种子的不同组织或细胞类型中。
在另一种实施方式中，本发明涉及通过增加植物中细胞分裂素氧化酶活性或水平或者通过降低植物或植物部分中活性细胞分裂素水平的另一种蛋白质的表达增加植物胚大小和/或重量的方法。优选地，在种子中定位增加的细胞分裂素氧化酶水平或活性或者降低植物或植物部分中活性细胞分裂素水平的另一种蛋白质的表达。甚至更优选地，在胚中定位增加的细胞分裂素氧化酶水平或活性或者降低植物或植物部分中活性细胞分裂素水平的另一种蛋白质的表达。
在另一实施方式中，本发明涉及通过增加植物中细胞分裂素氧化酶活性或水平或者通过降低植物或植物部分中活性细胞分裂素水平的另一种蛋白质的表达增加植物子叶大小和/或重量的方法。优选地，在子叶中定位增加的细胞分裂素氧化酶水平或活性或者降低植物或植物部分中活性细胞分裂素水平的另一种蛋白质的表达。
在本发明上下文中，应该理解可以可交换地利用术语“表达”和/或“过量表达”，并且两个术语都涉及植物细胞分裂素氧化酶或减低活性细胞分裂素水平的任何其它蛋白质在植物中“增加和/或异位的表达”。应该清楚，在此意指植物细胞分裂素氧化酶增加的表达及植物细胞分裂素或所述其它蛋白质的“从头”表达。做为可替代方案，所述其它蛋白质增加植物细胞分裂素氧化酶的细胞分裂素代谢活性。
进一步，应该理解，在本发明上下文中，表述“侧根和/或不定根”可以意指“侧根和不定根”，但是也可以意指“侧根或不定根”。增加可以存在于侧根形成中或不定根形成中及在两种类型非初生根形成中，但不是必需的。
此外，如这里所用的“增加的种子大小和/或重量”可以意指增加的种子大小和重量，但也可以指增加的种子大小或重量。因此，增加可以存在于种子大小或种子重量或者两者的增加中。类似的解释应该应用于“增加的胚大小和/或重量”和“增加的子叶大小和/或重量”。
可以可交换地使用术语“植物”和“植物部分”与术语“多株植物”和“多个植物部分”。
根据进一步实施方式，本发明涉及刺激根生长和/或增加侧根或不定根形成和/或改变根向地性和/或增加产量和/或增强早期活力(earlyvigor)和/或修饰根/冠比率和/或改进对倒伏的抗性和/或增加干旱耐受性和/或促进外植体体外繁殖的方法，包括植物细胞分裂素氧化酶的表达或包括降低植物或植物部分中活性细胞分裂素水平的另一种蛋白质的表达。
根据优选的实施方式，本发明涉及通过细胞分裂素氧化酶，优选本发明细胞分裂素氧化酶或降低植物或植物部分，优选根中活性细胞分裂素水平的另一种蛋白质的过量表达刺激引起根质量增加的根生长的方法。
由于生长促进序列的过量表达引起的较高的根生物量产生对产量有直接的作用和对由根细胞或转基因根细胞或所述转基因根细胞的细胞培养物产生的化合物产生有间接的作用。根培养物中产生的目的化合物的一个例子是紫草素，通过所述的方法可以有利地增加其产生。
根据更具体的实施方式，本发明涉及刺激根生长或增加侧根和/或不定根形成或改变根向地性或增加种子大小和/或重量，或者增加胚大小和/或重量，或者增加子叶大小和/或重量的方法。该方法包括编码植物细胞分裂素氧化酶的核酸的表达，所述核酸选自
(a)包含如任一SEQ ID NOs27，1，3，5，7，9，11，25，26，28到31，33或34或其互补序列中给出的DNA序列的核酸，
(b)包含与任一SEQ ID NOs27，1，3，5，7，9，11，25，26，28到31，33或34或其互补序列对应的RNA序列的核酸，
(c)与任一SEQ ID NOs27，1，3，5，7，9，11，25，26，28到31，33或34或其互补序列特异性杂交的核酸，
(d)编码包含如任一SEQ ID NOs2，4，6，8，10，12，32或35中给出的氨基酸序列的蛋白质的核酸或其互补序列，
(e)如(a)到(d)中任何一个所定义的核酸，其特征在于所述核酸是DNA，基因组DNA，cDNA，合成DNA或其中用U置换T的RNA。
(f)作为遗传密码的结果，与如任一SEQ ID NOs27，1，3，5，7，9，11，25，26，28到31，33或34中给出的核酸简并的核酸或者与(a)到(e)任一个所定义的核酸简并的核酸，
(g)由于生物体间密码子使用的差异，与编码如任一SEQ ID NOs2，4，6，8，10，12或35中给出的蛋白质的核酸不同的核酸或与如(a)到(e)任一个中所定义的核酸不同的核酸，
(h)由于等位基因间的差异，与编码如SEQ ID NOs2，4，6，8，10，12或35中给出蛋白质的核酸或者如(a)到(e)中所定义的核酸不同的核酸，
(i)编码如任一SEQ ID NOs2，4，6，8，10，12或35中给出的蛋白质的核酸，
(j)如(a)到(i)任一个中所定义的核酸的具有细胞分裂素氧化酶生物活性的功能性片段，
(k)编码植物细胞分裂素氧化酶的核酸，
或者包括优选在根中或种子(包含种子的部分如胚、胚乳、种皮或糊粉)中或子叶中表达编码降低植物或植物部分中活性细胞分裂素水平的蛋白质的核酸。
在本发明中，已经分离了编码新的拟南芥(Arabidopsis thaliana)细胞分裂素氧化酶的核酸，本发明人第一次惊奇地证明了转基因植物或植物部分中细胞分裂素氧化酶的表达引起上述根和种子相关特征。为了实现根相关的特征，应该在根中优选在根特异性启动子控制下发生(一种或多种)细胞分裂素氧化酶的表达。为了实现种子(包括胚)相关的特征，应该在种子中优选在种子特异性启动子控制下发生(一种或多种)细胞分裂素氧化酶的表达。在序列SEQ ID NO36中提供了这种根特异性启动子的一个例子。种子特异性启动子的例子包括但不限于表4中列出的种子特异性启动子。
为了实现子叶相关的特征，应该在子叶中优选在在子叶中优先表达的启动子控制下发生(一种或多种)细胞分裂素氧化酶的表达。
应该清楚，尽管在实施例部分通过几个新的AtCKX基因和蛋白质支持本发明，但是本发明概念也涉及从其它植物中分离和在其它植物中表达的其它细胞分裂素氧化酶的用途，优选在所述其它植物根和/或种子和/或子叶中分离和表达其它细胞分裂素氧化酶，以获得如实施例部分中所述的类似作用。
因此，本发明更一般地涉及编码植物细胞分裂素氧化酶或编码降低植物或植物部分中活性细胞分裂素水平的蛋白质的核酸用于刺激根生长或用于增加侧根或不定根形成或用于改变根向地性的用途。本发明也涉及编码植物细胞分裂素氧化酶或编码降低植物或植物部分中活性细胞分裂素水平的蛋白质的核酸用于增加种子大小和/或重量，或用于增加胚大小和/或重量，或用于增加植物子叶大小和/或重量的用途。编码上述细胞分裂素氧化酶的核酸及下文所定义的本发明新的核酸编码所用的优选细胞分裂素。
本发明涉及编码新的具有细胞分裂素氧化酶活性的植物蛋白质的分离的核酸，所述核酸选自
(a)包含如任一SEQ ID NOs29，3，5，9，26，27，31，33或34或其互补序列中给出的DNA序列的核酸，
(b)包含与任一SEQ ID NOs29，3，5，9，26，27，31，33或34或其互补序列对应的RNA序列的核酸，
(c)与如任一SEQ ID NOs29，3，5，9，26，27，31，33或34或其互补序列中给出的核酸特异性杂交的核酸，
(d)编码具有氨基酸序列的蛋白质的核酸，所述氨基酸序列包含如在SEQ ID NO32中给出的多肽，并且该氨基酸序列与SEQ ID NO4中给出的氨基酸序列至少70％相似，优选至少75％，80％或85％，更优选至少90％或95％，最优选至少99％相似，
(e)编码具有氨基酸序列的蛋白质的核酸，该氨基酸序列与如在SEQ IDNO6中给出的氨基酸序列至少35％相似，优选37％，40％，45％，47％或50％相似，更优选55％，60％，65％，70％，75％或80％相似，最优选85％，90％或95％相似，
(f)编码具有氨基酸序列的蛋白质的核酸，该氨基酸序列与如在SEQ IDNO10或35中给出的氨基酸序列至少35％相似，优选37％，40％，45％，47％或50％相似，更优选55％，60％，65％，70％，75％或80％相似，最优选85％，90％或95％相似，
(g)编码包含如任一SEQ ID NOs4，6，10，32或35中给出的氨基酸序列的蛋白质的核酸，
(h)作为遗传密码结果，与任一SEQ ID NOs29，3，5，9，26，27，33或34中给出的核酸简并的核酸或者与(a)到(g)任一个中所定义的核酸简并的核酸，
(i)由于生物体间密码子使用的差异，与编码如任一SEQ ID NOs4，6，10或35中给出的蛋白质的核酸不同的核酸或与如在(a)到(g)任一个中所定义的核酸不同的核酸，
(j)由于等位基因间的差异而不同的编码如在SEQ ID NOs4，6，10或35中给出的蛋白质的核酸，或如在(a)到(g)中所定义的核酸，
(k)编码如任一SEQ ID NOs29，3，5，9，26，27，31，33或34中给出的核酸编码的细胞分裂素氧化酶的免疫活性片段的核酸，或者如在(a)到(j)中任一个所定义的核酸的免疫活性片段，
(l)编码如任一SEQ ID NOs29，3，5，9，26，27，31，33或34中给出的核酸编码的细胞分裂素氧化酶功能性片段的核酸，或者如在(a)到(j)任一个中所定义的核酸的功能性片段，其中所述片段具有细胞分裂素生物学活性，和
(m)编码如在SEQ ID NOs4，6，10或35中所定义蛋白质的核酸，
条件是所述核酸不是如下面任何一个Genbank记录号所存放的核酸AC005917，AB024035和AC023754。
本发明也涉及本发明分离的核酸，该核酸是DNA，cDNA，基因组DNA或合成DNA，或用U置换T的RNA。
本发明也涉及至少15个核苷酸长度的核酸分子，该核酸分子特异地杂交或特异地扩增本发明的核酸。
不同的细胞分裂素形式可能在不同发育过程中起不同的作用。因此，CKX1，CKX2，CKX3和CKX4的不同作用可能与对不同细胞分裂素混合物的不同作用有关。例如CKX1和CKX3大多数促进根伸长和分支，而CKX2和CKX4主要刺激不定根形成。此外，CKX1和CKX3比CKX2和CKX4增加种子大小和重量的程度大。不被特定的作用方式所束缚，这种对于细胞分裂素混合物的差别的作用可能由底物特异性的一些差异或细胞分裂素氧化酶在细胞中差别区室化所引起(预测对于CKX1和CKX3是线粒体，而对于CKX2，CKX4，CKX5，和CKX6是细胞外)。
根据另一个实施方式，本发明也涉及包含本发明核酸的载体。在优选实施方式中，所述载体是表达载体，其中核酸可操作地与一个或多个控制序列连接，该控制序列使得所述序列能够在原核生物和/或真核生物宿主细胞中表达。
应该理解，为了对于本发明细胞分裂素氧化酶基因在单子叶植物中表达，应当使用对应于cDNA序列的核酸序列以避免单子叶植物中内含子的错误剪接(mis-splicing)。优选的在单子叶植物中表达的cDNA序列有如在SEQ ID NOs25到30和34的任一个中表示的核酸序列。
本发明也涉及含有任何本发明核酸分子或载体的宿主细胞。所述宿主细胞选自细菌、昆虫、真菌、植物或动物细胞。
本发明另一个实施方式涉及本发明核酸可编码的分离的多肽，或其同系物或衍生物，或其免疫活性或功能片段。本发明优选的多肽包含如在任一SEQ ID NOs2，4，6，8，10，12，32和35中表示的氨基酸序列，或其同系物或衍生物，或其免疫活性和/或功能性片段。在甚至更优选的实施方式中，本发明涉及具有如在任一SEQ ID NOs2，4，6，8，10，12或35中给出的氨基酸序列的多肽，或其同系物或衍生物，或其免疫活性和/或功能性片段。其优选的功能性片段是无它们信号肽的那些片段。
根据另一个实施方式，本发明涉及产生本发明多肽的方法，包括在允许多肽表达的条件下培养本发明宿主细胞，和从培养物回收产生的多肽。
本发明也涉及特异性识别本发明多肽或其特异性表位的抗体。
本发明进一步涉及转基因植物、植物细胞或植物组织的生产方法，包括以可表达形式或本发明载体向所述植物、植物细胞或植物组织中引入本发明核酸分子。
本发明也涉及改变的植物、植物细胞或植物组织的生产方法，包括将本发明多肽直接引入所述植物的细胞、组织或器官。
根据另一个实施方式，本发明涉及实现本发明多肽表达的方法，包括向植物细胞基因组中稳定引入可操作连接一个或多个控制序列的本发明核酸分子或本发明载体。本发明进一步涉及上述的方法，进一步包括从所述植物细胞再生植物。
本发明也涉及包含本发明核酸序列的转基因植物细胞，本发明核酸序列可操作地连接调节元件，该调节元件允许所述核酸在植物细胞中转录和/或表达；或者通过上述方法可获得的转基因植物细胞。
根据另一个优选实施方式，本发明涉及上述的转基因植物细胞，其中本发明核酸稳定地整合进入所述植物细胞的基因组中。
本发明进一步涉及包含这里所述植物细胞的转基因植物或植物组织，也涉及所述转基因植物的可收获部分，可收获部分优选选自种子、叶、果实、茎培养物、根、块茎、根茎和鳞茎。本发明还涉及来自任何所述转基因植物或植物部分的后代。
根据另一实施方式，本发明涉及刺激根生长的方法，包括本发明核酸的表达或者包括降低植物或植物部分中活性细胞分裂素水平的另一种蛋白质的表达。
在本发明的另一方面，提供了增加种子大小和/或重量的方法。该方法包括增加植物中细胞分裂素氧化酶的水平或活性或者增加降低植物或植物部分，优选种子中活性细胞分裂素水平的蛋白质的水平或活性。
也可以增加种子不同部分(器官)诸如、例如胚、胚乳、种皮或糊粉的大小和/或重量。例如，根据本发明，提供了增加胚大小和/或重量的方法。该方法包括增加植物中细胞分裂素氧化酶的水平或活性或者增加降低植物或植物部分，优选胚中活性细胞分裂素水平的蛋白质的水平或活性。
本发明的另一方面，提供了增加子叶大小和/或重量的方法。该方法包括增加植物中细胞分裂素氧化酶的水平或活性或者增加降低植物或植物部分，优选子叶中活性细胞分裂素水平的蛋白质的水平或活性。
根据增加种子大小和/或重量的方法，导致幼苗生长速度的增加或早期活力的增加。也获得了产量的增加。相似地，根据增加胚大小和/或重量，或子叶大小和/或重量的方法，导致幼苗生长速度的增加或早期活力的增加。在许多情况下，也获得产量的增加。幼苗生长或早期活力的增加常常与增加的胁迫耐受性有关。例如，幼苗、包括发芽后幼苗根系的较快发育对于特别是在逆境条件如干旱下的生存至关重要。
可以在本发明方法中利用编码具有细胞分裂素氧化酶活性的多肽的任何核苷酸序列。例如，这里提供的编码具有分裂素氧化酶活性的多肽的各种序列的任一序列都可以用在增加种子、胚、或子叶大小和/或重量的方法中。
优选地，产生表达如在SEQ ID NOs1，5，25，或27的任一中所述核酸或所述核酸的直向同源物(Ortholog)的转基因植物。优选地，该直向同源物来源于转基因植物的相关物种。甚至更优选地，直向同源物对转基因植物物种是特定的(天然或内源的)。
如上所述，特异地或优先地控制表达的启动子可以用在本发明方法中。因此，当期望种子大小或重量增加时，可以利用种子特异性启动子。当期望胚大小或重量增加时，可以利用胚特异性启动子。当期望子叶大小或重量增加时，优选控制在子叶中表达的启动子。这种启动子是公知的、广泛可获得的并且在例如这里表4中列出了这种启动子。
在另一实施方式中，本发明涉及增加种子大小或种子重量或两者的方法，所述方法包括本发明核酸的表达或包括降低植物或植物部分中活性细胞分裂素水平的另一种蛋白质的表达。
在再另一实施方式中，本发明涉及增加胚大小或重量或两者的方法，该方法包括本发明核酸的表达或包括降低植物或植物部分中活性细胞分裂素水平的另一种蛋白质的表达。
在再另一实施方式中，本发明涉及增加子叶大小的方法，该方法包括本发明核酸的表达或包括降低植物或植物部分中活性细胞分裂素水平的另一种蛋白质的表达。所述细胞分裂素氧化酶基因或其部分，或者降低植物或植物部分中活性细胞分裂素水平的另一种蛋白质的定位表达引起子叶增加的生长。在有子叶做为贮藏器官的物种中，这种子叶的增加生长引起了增加的产量和/或幼苗增加的生长性能。进一步，在该方面，碳水化合物、脂类和蛋白质都贮藏在种子中，并且在发芽期间代谢以提供植物早期生长期间的能量和代谢物。种子大小常常与早期活力相关，因为更大的种子含有更多的碳水化合物、脂类和蛋白蛋，并因此赋予更快的生长。因此，本发明的方法引起了幼苗的快速生长。这种早期活力与增加的胁迫耐受性有关。例如，植物根系统的较快发育对特别是逆境条件(如干旱)下的生存至关重要。早期的活力也与增加的产量和缩短的到开花的时间有关。
植物细胞或培养物是人工产生的生长在特定培养基中的植物细胞或植物组织的培养物，该培养基是液体或固体，其提供给这些植物细胞或组织生长和/或产生一些化合物必需的所有必需物质。例如，植物细胞和/或组织培养物可以用于植物快速繁殖和转基因植物的产生。在所述培养基中，对于一些外植体或在一些条件下，根形成可能是困难的，在所述培养植物细胞或组织中细胞分裂素氧化酶的表达可以用于增加根形成。植物细胞和/或组织培养物也可以用于有价值化合物的工业生长。可能的生产化合物是药物、农药、色素、化妆品、香料、食品添加剂等。这种产品的一个例子是紫草素，其通过植物紫草(Lithospermumerythrorhizon)的根产生。植物组织培养的一个例子是发根培养物，其是人工产生的发根团。大量收集紫草(L.erythrorhizon)的根是困难的，并且通过制备发根培养物，可以以比正常情况更高的速率工业化制备最终产物紫草素。如这里所公开的，细胞分裂素氧化酶的表达增加了根生长和发育，因此可以有利地用在所述植物细胞和组织培养方法中。因此，根据本发明的另一个实施方式，提供了刺激根生长和发育的方法，该方法包括在转基因植物细胞或包含所述转基因植物细胞的组织培养物中编码植物细胞分裂素氧化酶，优选本发明细胞分裂素氧化酶的核酸的表达。
本发明还涉及增加侧根和不定根形成的方法，该方法包括本发明核酸的表达或者包括降低植物或植物部分中活性细胞分裂素水平的另一种蛋白质的表达。
本发明也涉及改变根向地性的方法，该方法包括改变本发明核酸的表达或者包括降低植物或植物部分中活性细胞分裂素水平的另一种蛋白质的表达。
本发明也涉及增加早期活力和/或改变根/冠比率和/或改进对倒伏抗性和/或增加干旱耐受性和/或促进外植体体外繁殖的方法，该方法包括本发明核酸的表达或者包括降低植物或植物部分中活性细胞分裂素水平的另一种蛋白质的表达。
本发明还涉及增加根大小或根分生组织大小的方法，该方法包括本发明核酸的表达或者包括降低植物或植物部分，优选根中活性细胞分裂素水平的另一种蛋白质的表达。
根据另一实施方式，本发明涉及增加枝条分生组织大小的方法，该方法包括(优选在枝条中)本发明核酸表达的下调。
根据另一个优选实施方式，本发明涉及延迟叶衰老的方法，该方法包括在叶中，优选在衰老叶中任何一种本发明细胞分裂素氧化酶表达的下调。本发明也涉及改变叶衰老的方法，该方法包括在衰老叶中细胞分裂素氧化酶之一的表达。
本发明也涉及增加叶厚度的方法，该方法包括本发明核酸的表达或者包括降低植物或植物部分，优选叶中活性细胞分裂素水平的另一种蛋白质的表达。
本发明也涉及减小导管大小的方法，包括本发明核酸的表达或者包括降低植物或植物部分，优选导管中活性细胞分裂素水平的另一种蛋白质的表达。
本发明还涉及增加导管大小的方法，该方法包括在植物或植物部分中本发明核酸表达的下调。
根据另一实施方式，本发明涉及改进幼苗直立性(standability)的方法，该方法包括本发明核酸的表达或包括降低幼苗中活性细胞分裂素水平的另一种蛋白质的表达。
而且，本发明涉及上述方法的任一种方法，所述方法引起了产量的增加。
本发明还涉及本发明方法的任何一种方法，其中在强组成型启动子控制下发生所述核酸的所述表达。关于本发明对植物根有作用的那些方面，如，例如刺激根生长，增加侧根或不定根形成，或者改变根向地性的方法，优选地，优选于在根中优先表达的启动子控制下发生主题核酸的表达。在表5中，包括了非穷尽地列出的根特异性启动子。用在本发明方法中优选的启动子是根clavata同系物启动子，其有如在SEQ ID NO36中给出的序列。
关于本发明对植物种子有作用的那些方面，如，例如增加种子大小或重量，胚大小或重量的方法，或者对植物子叶有作用的那些方面，如，增加子叶大小和重量的方法，主题核酸在优先在种子中表达的启动子控制下进行表达。种子特异性启动子可以是在所有种子器官中表达的启动子或者对一个或多个器官或组织如胚、胚乳或糊粉显示优先表达的启动子。这里，在表4中阐述了这种启动子的例子。
根据另一个实施方式，本发明涉及修饰细胞命运和/或修饰植物发育和/或修饰植物形态学和/或修饰植物生物化学和/或修饰植物生理学和/或修饰细胞周期前进速率(progression rate)的方法，该方法包括本发明核酸在植物特定细胞、组织或器官中表达的修饰。
本发明也涉及在植物中获得增加的生长，和/或增加的产量和/或植物细胞、组织和/或器官改变的衰老和/或增加的植物侧生器官形成频率的方法，该方法包括本发明核酸的异位表达。
本发明也涉及促进和延长逆境生长条件和/或胁迫情况下细胞中细胞分裂活性的方法，该方法包括本发明核酸序列的异位表达。
根据另一实施方式，本发明涉及鉴定和获得与本发明多肽相互作用的蛋白质的方法，该方法包括利用本发明多肽的筛选试验。
在更优选的实施方式中，本发明涉及鉴定和获得与本发明多肽相互作用的蛋白质的方法，该方法包括使用本发明多肽作为饵，cDNA文库作为捕获物的双杂交筛选试验。
本发明进一步涉及调节本发明多肽和通过上述方法可获得的相互作用蛋白质伴侣之间相互作用的方法。
在进一步实施方式中，本发明涉及鉴定和获得与本发明多肽相互作用的化合物的方法，该方法包括步骤
a)提供本发明多肽和通过上述方法可获得的相互作用的蛋白质伴侣的双杂交系统，
b)将所述化合物和a)中所定义的表达多肽形成的复合物相互作用，和
c)进行所述化合物与所述多肽或a)中所定义的表达多肽形成的复合物相互作用的(实时)测定。
本发明还涉及鉴定与本发明多肽特异结合的化合物或化合物混合物的方法，包括
(a)将本发明的多肽与所述化合物或化合混合物在适于允许复合物形成的条件下混合，和
(b)检测复合物形成，其中复合物的存在鉴定了与所述多肽特异结合的化合物或混合物。
本发明也涉及上述方法，其中所述化合物或混合物抑制本发明所述多肽的活性，并且可以用于化学试剂的合理设计。
根据另一实施方式，本发明涉及通过上述方法鉴定的化合物或混合物作为植物生长调节剂或除草剂的用途。
本发明也涉及植物生长调节剂或除草剂组合物的生产方法，该方法包括上述化合物筛选方法步骤和以适合形式配制从所述步骤获得的化合物用于在农业或植物细胞或组织细胞中应用。
本发明也涉及增加分支的方法，包括在植物或植物部分，优选茎或腋芽中本发明核酸的表达。
本发明也涉及改进倒伏抗性的方法，该方法包括在植物或植物部分，优选茎或腋芽中本发明核酸的表达。
本发明也涉及促进生长的化学试剂或除草剂的设计或筛选方法，该方法包括本发明核酸或本发明载体的应用。
根据另一个实施方式，本发明涉及本发明核酸分子，本发明载体或本发明多肽用于增加产量的用途。
本发明也涉及本发明核酸分子、本发明载体或本发明多肽用于刺激根生长的用途。
本发明也涉及本发明核酸分子、本发明载体或本发明多肽用于增加侧根或不定根形成的用途。
本发明也涉及本发明核酸分子、本发明载体或本发明多肽用于改变根向地性的用途。
本发明也涉及本发明核酸分子、本发明载体或本发明多肽用于增加种子大小、种子重量、胚大小、胚重量、子叶大小和子叶重量的至少之一的用途。
本发明也涉及本发明核酸分子、本发明载体或本发明多肽用于增加早期活力和/或用于改变根/冠比率和/或提高对倒伏抗性和/或增加干旱耐受性和/或促进外植体的体外繁殖的用途。
本发明也涉及本发明核酸分子、本发明载体或本发明多肽用于修饰植物发育和/或用于修饰植物形态学和/或用于修饰植物生物化学和/或用于修饰植物生理学的用途。
根据另一个实施方式，本发明涉及诊断组合物，其包含至少本发明核酸分子，本发明载体，本发明多肽或本发明抗体。
本发明另一实施方式涉及转基因砧木在与接穗(scion)嫁接以产生具有改进农学或园艺学特征的植物或树的过程中的应用，由于细胞分裂素氧化酶的表达，所述砧木有增加的根生长和发育。接穗可以是转基因或非转基因的。该实施方式设想的特定特征是由根系统赋予的那些特征，并且包括在土壤中植物/树改进的固着和/或改进的水分吸收，例如引起改进的干旱耐受性，和/或改进的从土壤的营养吸收和/或遍布整个植物的有机物改进的转运和/或增加的物质分泌到土壤中诸如，例如植物含铁细胞，和/或改进的呼吸作用和/或改进的疾病抗性和/或增加的产量。利用转化AtCKX的砧木嫁接的优点，除了它们增加的根系外，是嫁接植物上叶片延迟的衰老，如这里所公开的(参见图12A)。用于这个特定实施方式的优选植物或树木包括在它们自己的根上生长不好的植物或树木，并且嫁接在载培背景(Cultivated Settings)中，如有商业利益的品种葡萄树、柑橘，杏树、扁桃、李子树、桃树、苹果树、梨树、樱桃树、胡桃树、无花果树、榛树和枇杷树。
如上文所述，植物生长素和细胞分裂素在一些生物过程中起拮抗剂作用。例如，细胞分裂素/生长素比率调节根和枝条的产生，高浓度的植物生长素引起有组织的根，而高浓度的细胞分裂素引起枝条产生。如本发明所公开的，烟草和拟南芥(Arabidopsis)中细胞分裂素氧化酶的表达引起了与增加的植物生长素作用一致的增加的根发育。植物生长素也参与果实的发育。用植物生长素处理雌性花部分在一些植物物种中引起了单性果实的发育。通过在雌性繁殖器官中增加植物生长素合成，已经在几种园艺作物植物中经基因工程改造了单性果实发育(WO0105985)。
因此，根据另一个实施方式，本发明涉及诱导植物单性性状的方法，所述方法包括下调一种或多种细胞分裂素氧化酶或降低植物或植物部分中优选雌性繁殖器官如胎座、胚珠和由此来源的组织中活性细胞分裂素水平的另一种蛋白质的表达。提供在胎座和胚珠中高度表达特异性的来源于金鱼草(Antirrhinum majus)的DefH9启动子区域或其同系物之一可以用于该目的。
本领域技术人员将意识到这里所述的本发明除了这些具体描述的以外，可以进行其它变通和修改。应该理解，这里所述的本发明包括所有这种变通和修改。本发明也包括该说明书中单个或集合性地提到或指明的所有这种步骤、特征、组合物和化合物，及任一或更多所述步骤或特征的任一和所有联合。
本发明可以应用于任何植物，特别是单子叶植物和双子叶植物，包括饲料或草料豆科植物，观赏植物，粮食作物，树木或灌木，其选自金合欢属(Acacia spp.)、槭树属(Acer spp.)、猕猴桃属(Actinidia spp.)、七叶树属(Aesculus spp.)、新西兰贝壳衫(Agathis australis)、合欢属(Albizia amara)、Alsophila tricolor、须芒草属(Andropogonspp.)、花生属(Arachis spp.)、槟榔(Areca catechu)、Astelia fragrans、Astragalus cicer、多小叶红苏木(Baikiaea plurijuga)、桦木属(Betulaspp.)、芸苔属(Brassica spp.)、木榄(Bruguiera gymnorrhiza)、Burkeaafricana、紫铆(Butea frondosa)、Cadaba farinosa、朱缨花属(Calliandra spp)、大叶茶(Camellia sinensis)、美人蕉(Cannaindica)、辣椒属(Capsicum spp.)、决明属(Cassia spp.)、Centroemapubescens、木瓜属(Chaenomeles spp.)、肉桂(Cinnamomum cassia)、小果咖啡(Coffea arabica)、Colophospermum mopane、变异小冠花(Coronillia varia)、栒子属serotina(Cotoneaster serotina)、山楂属(Crataegus spp.)、甜瓜属(Cucumis spp.)、柏木属(Cupressusspp.)、Cyathea dealbata、榅桲(Cydonia oblonga)、日本柳衫(Cryptomeria japonica)、香茅属(Cymbopogon spp.)、Cynthea dealbata，榅桲(Cydonia oblonga)、Dalbergia monetaria、大叶骨碎补(Davalliadivaricata)、山马蝗属(Desmodium spp.)、粗糙蚌壳蕨(Dicksoniasquarosa)、Diheteropogon amplectens、黎豆属(Dioclea spp)、镰扁豆属(Dolichos spp.)、Dorycnium rectum、Echinochloa pyramidalis、Ehrartia spp.、龙爪稷(Eleusine coracana)、Eragrestis spp.、刺桐属(Erythrina spp.)、桉树属(Eucalyptus spp.)、Euclea schimperi、Eulalia villosa、荞麦属(Fagopyrum spp.)、费约果(Feijoasellowiana)、草莓属(Fragaria spp.)、千斤拔属(Flemingia spp)、Freycinetia banksii、Geranium thunbergii、银杏(Ginkgo biloba)、野大豆(Glycine javanica)、Gliricidia spp、陆地棉(Gossypiumhirsutum)、银桦属(Grevillea spp.)、Guibourtia coleosperma、岩黄芪属(Hedysarum spp.)、牛鞭草(Hemarthia altissima)、扭黄茅(Heteropogon contortus)、大麦(Hordeum vulgare)、Hyparrheniarufa、小连翘(Hypericum erectum)、Hyperthelia dissoluta、Indigoincarnata、鸢尾属(Iris spp.)、Leptarrhena pyrolifolia、胡枝子属(Lespediza spp.)、Lettuca spp.、Leucaena leucocephala、Loudetiasimplex、Lotonus bainesii、百脉根属(Lotus spp.)、Macrotylomaaxillare、苹果属(Malus spp.)、Manihot esculenta、紫苜蓿(Medicagosativa)、水杉(Metasequoia glyptostroboides)、大蕉(Musasapientum)、Nicotianum spp.、驴食豆属(Onobrychis spp.)、Ornithopusspp.、稻属(Oryza spp.)、Peltophorum africanum、狼尾草属(Pennisetumspp.)、Persea gratissima、碧冬茄属(Petunia spp.)、菜豆属(Phaseolusspp.)、槟榔竹(Phoe nix canariensis)、Phormium cookianum、石楠属(Photinia spp.)、白云杉(Picea glauca)、松属(Pinus spp.)、豌豆(Pisum sativum)、新西兰罗汉松(Podocarpus totara)、Pogonarthria fleckii、Pogonarthria squarrosa、杨属(Populus spp.)、牧豆树(Prosopis cineraria)、花旗松(Pseudotsuga menziesii)、Pterolobium stellatum、西洋梨(Pyrus communis)、栎属(Quercus spp.)、Rhaphiolepsis umbellata、美味棒花棕(Rhopalostylis sapida)、Rhusnatalensis、欧洲醋栗(Ribes grossularia)、茶藨子属(Ribes spp.)、洋槐(Robinia pseudoacacia)、蔷薇属(Rosa spp.)、悬钩子属(Rubusspp.)、柳属(Salix spp.)、Schyzachyrium sanguineum、金松(Sciadopitys verticillata)、北美红杉(Sequoia sempervirens)、巨杉(Sequoiadendron giganteum)、两色蜀黍(Sorghum bicolor)、菠菜属(Spinacia spp.)、Sporobolus fimbriatus、Stiburusalopecuroides、Stylosanthos humilis、葫芦茶属(Tadehagi spp.)、落羽杉(Taxodium distichum)、阿拉伯黄背草(Themeda triandra)、车轴草属(Trifolium spp.)、小麦属(Triticum spp.)、异叶铁杉(Tsugaheterophylla)、越橘属(Vaccinium spp.)、野豌豆属(Vicia spp.)、葡萄(Vitis vinifera)、锥穗活森花(Watsonia pyramidata)、马蹄莲(Zantedeschia aethiopica)、玉米(Zea mays)、苋、朝鲜蓟、芦笋、嫩茎花椰芽、抱子甘蓝、甘蓝、芸苔、胡萝卜、花椰菜、芹菜、羽衣甘蓝绿、亚麻、羽衣甘蓝、扁豆、油籽油菜、黄秋葵、洋葱、马铃薯、稻、大豆、稻草、甜菜、甘蔗、向日葵、西红柿、南瓜和茶，等等，或上述具体列举的任何植物的种子或任一个上述物种的组织、细胞或器官培养物。
在整个说明书中，除非上下文有另外的要求，文字“包含”、“包括”和“含有”将理解为意思是包括所述实体或步骤，或实体或步骤组，但不排除其它任何实体或步骤，或实体或步骤组。
如这里所用，术语“来源于”应该理解为意指来源于特定物种的特定实体或实体组，但不必直接从该特定来源获得。
这里使用的术语“蛋白质”、“肽”或“寡肽”指任何长度的聚合形式的氨基酸。所述术语也包含已知氨基酸修饰诸如二硫键形式、半胱氨酸化、氧化、谷胱甘肽化、甲基化、乙酰化、法尼基化、生物素化、硬脂酰化、甲酰化、硫辛酸添加、磷酸化、硫酸化、遍在蛋白化、肉豆寇酰化、棕榈酰化、牻牛儿基牻牛儿基化、环化(例如，焦谷氨酸形成)、氧化、脱酰胺、脱水、糖基化(例如，戊糖、己糖胺、N-乙酰己糖胺、脱氧己糖、己糖、唾液酸等)和酰化作用及非天然存在的氨基酸残基，L-氨基酸残基和D-氨基酸残基。
本发明蛋白质的“同系物”是与和它们是同系物的所述蛋白质相比，包含氨基酸置换、缺失和/或添加，但不改变它的一种或多种功能特性，特别是不降低作为结果的活性的肽、寡肽、多肽、蛋白质和酶。例如，所述蛋白质的同系物将由所述蛋白质的生物活性氨基酸序列变异体组成。为了产生这种同系物，可以通过其它具有类似特性，例如疏水性、亲水性、疏水力矩(hydrophobic moment)、抗原性、形成或破坏α-螺旋结构或β-片层结构的倾向特性等的氨基酸置换所述蛋白质中存在的氨基酸。氨基酸物理化学特性的概述在表1中给出。
本发明蛋白质的置换变异体是除去所述蛋白质氨基酸序列中至少一个残基并在它的位置插入不同残基的变异体。氨基酸置换通常是单个残基，但是根据对该多肽的功能性限制因素，其可以是成簇的残基；插入通常是约1-10氨基酸残基，缺失的范围将是约1-20残基。优选地，氨基酸置换将包含保守性氨基酸置换，如上文所述氨基酸置换。
表1 天然存在的氨基酸的特性电荷特性/疏水性侧链氨基酸非极性的疏水的脂肪族脂肪族，含S芳香族亚氨基ala，ile，leu，valmetphe，trppro极性不带电荷脂肪族酰胺芳香族羟基巯基glyasn，glntyrser，thrcys带正电荷碱性arg，his，lys带负电荷酸性asp，glu
本发明蛋白质插入的氨基酸序列变异体是在所述蛋白质预先确定的位点引入一个或多个氨基酸残基的变异体。插入可以包含氨基末端和/或羧基末端融合及单或多个氨基酸的序列内插入。通常，氨基酸序列内的插入比氨基或羧基末端融合要少，约1到10个残基。氨基-或羧基-末端融合蛋白质或肽的例子包含在双杂交系统中所用的转录激活蛋白的结合域或激活域、噬菌体外被蛋白、(组氨酸)6-标记，谷光甘肽S-转移酶、蛋白质A、麦芽糖结合蛋白、二氢叶酸还原酶、Tag·100表位(EETARFQPGYRS)、c-myc表位(EQKLISEEDL)、FLAG-表位(DYKDDDK)，lacZ，CMP(钙调蛋白结合肽)、HA表位(YPYDVPDYA)、蛋白质C表位(EDQVDPRLIDGK)和VSV表位(YTDIEMNRLGK)。
本发明蛋白质缺失变异体特征在于从所述蛋白质氨基酸序列除去一个或多个氨基酸。
利用本领域公知的肽合成技术，如固相多肽合成等或者通过重组DNA操作可以容易地制备本发明蛋白质的氨基酸变异体。产生表现为置换、插入或缺失变异体的变异蛋白质的DNA序列操作是本领域公知的。例如，在具有已知序列的DNA中的预定位点进行置换突变的技术是本领域技术人员公知的，如通过M13诱变、T7-Gen体外诱变试剂盒(USB，Cleveland，OH)、QuickChange定点诱变试剂盒(Stratagene，San Diego，CA)、PCR-介导的定点诱变或其它定点诱变方法。
在本发明中，用本领域已知的计算机程序诸如DNAstar/MegAlign程序结合Clustal方法计算DNA序列和/或蛋白质之间的“同一性”和/或“相似性”百分数。
本发明蛋白质的“衍生物”是包含所述多肽至少约5个邻接氨基酸残基，但保留所述蛋白质生物活性的肽、寡肽、多肽、蛋白质和酶。与所述多肽天然存在形式的氨基酸序列比较，“衍生物”可以进一步包含另外天然存在、改变的糖基化、酰化或非天然存在的氨基酸残基。作为可替代方案或此外，与所述多肽天然存在形式的氨基酸序列比较，衍生物可以包含一个或多个非氨基酸取代基，例如共价或非共价连接氨基酸序列的报道分子或其它配体，如，例如与之结合的报道分子有利于它的检测。
“免疫活性”意指分子或其特定片段，如特定表位或半抗原被抗体识别，即结合。例如，利用Geysen等(1996)(Geysen，H.M.，Rodda，S.J.和Mason，T.J.(1986).模拟不连续抗原决定簇的肽的先验描述，Mol.Immunol.23，709-715.)中所述的肽扫描技术可以确定特定表位。
术语“序列片段”或“序列部分”意指所提到的原始序列截短的序列。被截短的序列(核酸或蛋白质序列)长度可以广泛变化；最小大小是足以提供给该序列至少与提到的原始序列相当的功能和/或活性的大小的序列(例如“功能性片段”)，而最大大小不是至关重要的。在一些应用中，最大大小常常不比提供原始序列期望活性和/或功能需要的大小显著大。典型地，截短的氨基酸序列长度范围将是约5到约60个氨基酸。更典型地，然而，该序列最大具有约50个氨基酸长度，优选，最大约60个氨基酸残基的长度。通常，期望选择至少约10，12或15个氨基酸，多到最大约20或25个氨基酸的序列。
功能性片段也可以包含含有对本发明蛋白质特异的表位的片段。优选的功能性片段有至少，例如5，10，25，100，150或200个氨基酸的长度。
因此，应该理解功能性片段也可以是免疫活性片段或不是。
在本发明上下文中具体包含上文所述细胞分裂素氧化酶的同系物、衍生物和/或免疫活性和/或功能性片段。考虑用在本发明中的特别优选的细胞分裂素氧化酶蛋白质的同系物、衍生物和/或免疫活性和/或功能性片段来源于植物，更具体来源于拟南芥(Arabidopsis thaliana)(At)CKX，或者具有在其中表达的能力。本发明清楚地考虑了AtCKX蛋白质的功能性同系物或衍生物和/或免疫活性片段的用途，并且在应用上，本发明不限于编码所述AtCKX蛋白质之一的核苷酸序列的用途。
任何所述蛋白质、多肽、肽和其片段都可以在生物系统，例如细胞培养物中产生。作为可替代方案，例如通过固相多肽合成，可以化学制备任何所述蛋白质、多肽、肽和其片段。所述蛋白质或其片段可以是融合蛋白质的部分，在例如双杂交测定法中就是这种情况，该双杂交测定法能够鉴定与本发明细胞分裂素氧化酶相互作用的蛋白质。
蛋白质或其片段还有，例如调节本发明细胞分裂素氧化酶和通过本发明方法获得的相互作用蛋白质伴侣之间相互作用的用途。化学合成的肽，例如作为用于抗血清和/或抗体产生的抗原源特别有用。
“抗体”包含单克隆、多克隆、合成或重链camel抗体及如Fab、Fv或scFv片段等的抗体片段。可以通过在例如Liddle和Cryer(1991)中所述的技术制备单克隆抗体，其包含小鼠骨髓瘤细胞和来源于免疫动物的脾脏细胞的融合。而且，可以通过利用在例如Harlow和Lane(1988)中所述的方法获得针对分子或其片段的抗体或其片段。在针对小肽，如本发明蛋白质的片段的抗体的情况下，在动物免疫前，所述肽通常与载体蛋白质偶联。这种蛋白质载体包括匙孔血蓝蛋白(KLH)、牛血清白蛋白(BSA)、卵白蛋白和破伤风毒素。载体蛋白质增强动物的免疫应答和提供T细胞受体结合位点的表位。术语“抗体”还包括其衍生物如标记的抗体。抗体标记包括碱性磷酸酶、PKH2、PKH26、PKH67、荧光素(FITC)、Hoechst33258、R-藻红蛋白(PE)、罗丹明(TRITC)、Quantum Red、Texas Red、Cy3、生物素、琼脂糖、过氧化物酶和金球体。根据抗蛋白质抗体的分子生物学工具包括蛋白质凝胶印迹分析、允许基因鉴定的表达文库筛选，蛋白质定量方法包括ELISA和RIA，蛋白质的免疫亲和纯化，蛋白质的免疫沉淀(参见，例如实施例6)和免疫定位。抗体，尤其是肽抗体的其它用途包括蛋白酶解加工研究(Loffler等，1994，Woulfe等，1994)，蛋白质活性位点的测定(Lerner 1982)，前体或翻译后加工的研究(Baron和Baltimore 1982，Lerner等，1981，Semier等，1982)，涉及蛋白质-蛋白质相互作用的蛋白质结构域的鉴定(Murakami等，1992)和基因表达中外显子使用的研究(Tamura等，1991)。
本发明中具体包括是特异识别上文所述细胞分裂素氧化酶或其同系物、衍生物或片段的抗体。优选地，所述细胞分裂素氧化酶是植物细胞分裂素氧化酶、更具体是拟南芥(Arabidopsis thaliana)细胞分裂素氧化酶(AtCKX)之一。
术语“基因”、“多核苷酸”、“核酸”、“核酸序列”、“核苷酸序列”或“核酸分子”用在这里指任何长度的聚合形式的核苷酸，或者是核糖核苷酸或是脱氧核糖核苷酸或者两者的联合。所述的术语还包括双链和单链DNA和RNA。所述术语也包括已知的核苷酸修饰，如甲基化，环化和“帽结构”和用类似物如肌苷置换一个或多个天然存在的核苷酸。核苷酸的修饰包括添加吖啶、胺、生物素、cascade blue、胆固醇、Cy3、Cy5、Cy5.5Dabcyl、地高辛配基、二硝基苯酚基、Edans、6-FAM、荧光素、3′-甘油基、HEX、IRD-700、IRD-800、JOE、磷酸补骨脂素、罗丹明、ROX、巯基(SH)、间隔区、TAMRA、TET、AMCA-S、SE、BODIPY、Marina Blue、Pacific Blue、Oregon Green、Rhodamine Green、Rhodamine Red、Rhodol Green和Texas Red。多核苷酸骨架修饰包括甲基膦酸酯、2′-OMe-甲基膦酸酯RNA、硫代磷酸酯、RNA、2′-OMeRNA。碱基修饰包括2-氨基-dA、2-氨基嘌呤、3′-(ddA)、3′dA(蛹虫草菌素)、7-脱氮-dA、8-Br-dA、8-氧代-dA、N6-Me-dA、脱碱基位点(dSpacer)、生物素dT、2′-OMe-5Me-C、2′-OMe-炔丙基-C、3′-(5-Me-dC)、3′-(ddC)、5-Br-dC、5-I-dC、5-Me-dC、5-F-dC、羧基-dT、可转换的dA、可转换的dC、可转换的dG、可转换的dT、可转换的dU、7-脱氮-dG、8-Br-dG、8-氧代-dG、O6-Me-dG、S6-DNP-dG、4-甲基-吲哚、5-硝基吲哚、2′-OMe-肌苷、2′-dI、O6-苯基-dI、4-甲基-吲哚、2′-脱氧水粉草素、5-硝基吲哚、2-氨基嘌呤、dP(嘌呤类似物)、dK(嘧啶类似物)、3-硝基吡咯、2-硫代-dT、4-硫代-dT、生物素-dT、羧基-dT、O4-Me-dT、O4-三唑dT、2′-OMe-炔丙基-U、5-Br-dU、2′-dU、5-F-dU、5-I-dU、O4-三唑dU。所述术语也包括肽核酸(PNAs)，一种DNA类似物，其中骨架是假肽，由N-(2-氨基乙基)-甘氨酸单元而不是糖组成。PNAs模拟DNA的行为并且结合互补的核酸链。PNA的中性主链比正常链达到的结合和特异性产生了更强的结合和更大的特异性。此外，已经利用了PNA独特的化学、物理和生物学特性以产生有力的生物分子工具，反义和反基因试剂，分子探针和生物传感器。
有利地，本发明也提供了本发明核酸至少约15个邻接核苷酸，优选15到50个核苷酸的核酸序列。有利地，这些序列可以用作特异杂交上述本发明序列的探针，或用作起始上述本发明序列特异扩增或复制的引物等等。可以根据本领域公知的技术，如通过重组或合成方法产生这种核酸序列。它们可以用在诊断试剂盒等中用于检测本发明核酸的存在。一般地，这些试验包括在杂交条件下，用样品接触探针，检测探针和样品中任何核酸之间任何双螺旋或三螺旋形成的存在。
有利地，可以利用这种重组或合成方法，如，例如利用PCR克隆机理产生本发明核酸序列，所述PCR机理一般包括制备引物对，该引物对可以是期望克隆基因区域的约15到50个核苷酸，使引物与细胞mRNA，cDNA或基因组DNA接触，在引起期望区域扩增的条件下进行聚合酶链式反应，分离扩增的区域或片段，并回收扩增的DNA。一般地，这里所述的这种技术是本领域公知的，如描述在Sambrook等(分子克隆实验室指南，1989)。
“编码序列”或“开放读框”或“ORF”定义为当将其置于适合的控制序列或调节序列控制下时，即，当所述编码序列或ORF以可表达形式存在时，可以转录为mRNA和/或翻译为多肽的核苷酸序列。所述ORF编码序列被5’翻译起始密码子和3’翻译终止密码子所限制。ORF或编码序列可以包含，但不限于RNA、mRNA、cDNA，重组核苷酸序列，合成制备的核苷酸序列或基因组DNA。所述的ORF或编码序列可以通过间插核酸序列间断。
基本编码相同蛋白质，但是从不同来源分离的基因和编码序列可以由实质上相异的核酸序列组成。相互地，可以设计实质上相异的核苷酸序列以实现基本相同蛋白质的表达。这种核酸序列是，例如已经基因不同等位基因的存在，遗传密码简并或密码子使用差异的结果。因此，如表2所示，甲硫氨酸和色氨酸由单个密码子编码，而其它氨基酸如精氨酸、亮氨酸和丝氨酸可以分别由多达6种不同密码子翻译而成。在表3中示例了用于根瘤农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)(细菌)，拟南芥(A.thaliana)，M.sativa(两种双子叶植物)和水稻(Oryza sativa)(单子叶植物)的优选密码子使用的差异。为了摘录一个例子，密码子GGC(对于甘氨酸)是根瘤农杆菌(A.tumefaciens)中最常用的密码子(36.2‰)，是水稻(O.sativa)中第二最常用的密码子，但是其在拟南芥(A.thaliana)和M.sativa中使用的频率低得多(分别为9‰和8.4‰)。编码甘氨酸的4种可能密码子中(参见表2)，所述GGC密码子最优选在根瘤农杆菌(A.tumefaciens)和水稻(O.sativa)中使用。然而，在拟南芥(A.thaliana)中，这是GGA(和GGU)密码子，而在M.sativa中，这是GGU(和GGA)密码子。
可以通过间插序列间断本发明DNA序列。“间插序列”意指任何核酸序列，其中断包含所述本发明DNA序列的编码序列或其中断包含所述本发明DNA序列的DNA序列可表达形式。间插序列的去除恢复所述编码序列或所述可表达形式。
间插序列的例子包括内含子和可移动的DNA序列，如转座子。“可移动DNA序列”意指可以作为重组事件结果而移动的任何DNA序列。
表2 遗传密码的简并氨基酸3字母密码 一字母 密码 可能的密码子丙氨酸Ala A GCA GCC GCG GCU精氨酸Arg R AGA AGG CGA CGC CGG CGU天冬酰胺Asn N AAC AAU天冬氨酸Asp D GAC GAU半胱氨酸Cys C UGC UGU谷氨酸Glu E GAA GAG谷氨酰胺Gln Q CAA CAG甘氨酸Gly G GGA GGC GGG GGU组氨酸His H CAC CAU异亮氨酸Ile I AUA AUC AUU亮氨酸Leu L UUA UUG CUA CUC CUG CUU赖氨酸Lys K AAA AAG甲硫氨酸Met M AUG苯丙氨酸Phe F UUC UUU脯氨酸Pro P CCA CCC CCG CCU丝氨酸Ser S AGC AGU UCA UCC UCG UCU苏氨酸Thr T ACA ACC ACG ACU色氨酸Trp W UGG酪氨酸Tyr Y UAC UAU缬氨酸Val V GUA GUC GUG GUU可能的″终止″密码子UAAUAG UGA
表3 不同生物体中显示的密码子使用，
表示为每1000个密码子的频率(http//www.kazusa.or.jp/codon) 密码子 根瘤农杆菌 (Agrobacterium tumefaciens) 拟南芥 (Arabidopsis thaliana) 紫花苜蓿 (Medicago sativa) 水稻 (Oryza sativa) UUU 13.9 22.5 24.1 11.3 UUC 24.3 20.7 16.9 26.3 UUA 3.5 12.9 10.4 4.7 UUG 13.2 21.0 22.4 11.8 UCU 7.0 24.6 19.8 10.1 UCC 14.8 10.8 7.7 16.9 UCA 7.4 17.8 17.2 9.7 UCG 18.2 8.9 3.2 10.8 UAU 12.3 15.2 16.6 9.2 UAC 10.3 13.7 14.0 20.6 UAA 0.9 0.9 1.2 0.9 UAG 0.6 0.5 0.8 0.8 UGU 3.0 10.8 10.6 5.0 UGC 7.4 7.2 5.8 14.3 UGA 1.8 1.0 0.8 1.3 UGG 12.2 12.7 10.0 12.8 CUU 19.1 24.3 28.3 14.6 CUC 25.7 15.9 12.0 28.0 CUA 5.2 10.0 8.8 5.7 CUG 31.6 9.9 8.5 22.1 CCU 7.7 18.3 23.2 11.8 CCC 10.6 5.3 5.3 12.5 CCA 8.9 16.1 22.6 12.2 CCG 20.7 8.3 3.6 16.7 CAU 10.6 14.0 14.6 9.2 CAC 9.1 8.7 9.1 14.6 CAA 11.2 19.7 23.2 11.9 CAG 24.9 15.2 12.3 24.6 CGU 12.2 8.9 10.1 6.8 CGC 25.5 3.7 4.2 15.9 CGA 8.2 6.2 4.2 4.2 CGG 13.2 4.8 1.8 9.7 AUU 15.4 22.0 29.4 13.8 AUC 36.9 18.5 14.7 25.5 AUA 6.2 12.9 11.7 7.2 AUG 24.7 24.5 21.7 24.4 ACU 6.4 17.8 20.8 10.3 ACC 20.9 10.3 11.7 18.6 ACA 9.1 15.9 18.9 10.0 ACG 18.8 7.6 2.8 10.8 AAU 13.5 22.7 25.0 12.9 AAC 18.7 20.9 18.7 25.1 AAA 13.6 31.0 32.2 12.0 AAG 24.4 32.6 35.1 39.4 AGU 5.7 14.0 12.6 7.3 AGC 15.8 11.1 8.8 16.9 AGA 5.3 18.7 13.6 7.7 AGG 6.5 10.9 11.7 14.9 GUU 16.6 27.3 34.7 15.0 GUC 29.3 12.7 9.9 22.8 GUA 6.1 10.1 10.0 5.7 GUG 19.7 17.5 16.5 25.0 GCU 17.4 28.0 34.6 19.8 GCC 35.8 10.3 11.4 33.2 GCA 19.5 17.6 25.9 15.6 GCG 31.7 8.8 3.4 25.3 GAU 25.8 36.8 40.0 21.5 GAC 28.0 17.3 15.5 31.6 GAA 29.9 34.4 35.9 17.1 GAG 26.3 32.2 27.4 41.1 GGU 16.5 22.2 28.7 16.3 GGC 36.2 9.0 8.4 34.7 GGA 12.5 23.9 27.3 15.0 GGG 11.3 10.2 7.4 16.6
“杂交”是基本同源互补的核苷酸序列相互退火的过程。杂交过程可以完全在溶液中发生，即，两个互补核酸序列都在溶液中。根据这种过程的分子生物学工具包括PCR、扣除杂交和DNA序列测定。将互补核酸序列之一固定到基质如磁珠、Sepharose珠和任何其它树脂上也可以发生杂交过程。根据这种过程的分子生物学工具包括poly(A+)mRNA的分离。互补核酸之一固定到固相支持体，如硝酸纤维素或尼龙膜，或者通过例如光刻法固定到例如硅质玻璃支持体也可以发生杂交过程(后者称为核酸阵列或微阵列或称为核酸芯片)。根据这种过程的分子生物学工具包括RNA和DNA凝胶印迹分析，菌落杂交、噬菌斑杂交和微阵列杂交。为了允许杂交发生，通常热或化学(例如，通过NaOH)变性核酸分子解链双链成为两个单链和/或从单链核酸除去发夹或其它二极结构。杂交的严格性受条件，如温度、盐浓度和杂交缓冲液组成的影响。高严格性的杂交条件包括高温和/或低盐浓度(盐包括NaCl和Na3-柠檬酸盐)和/或杂交缓冲液中包含甲酰胺和/或杂交缓冲液中降低的化合物如SDS(去污剂)浓度和/或从杂交缓冲液中排除化合物，如葡聚糖硫酸酯或聚乙二醇(促进分子聚集)。例如，在Sambrook等，(1989)中描述了常规的杂交条件，但是本领域技术人员将理解可以根据已知或期望同源性和/或核酸序列的长度设计大量不同的杂交条件。特别优选严格性足够低的杂交条件分离与上文所述本发明DNA序列异源的核酸。引起上述异源性的因素包括上文所述等位性、遗传密码的简并性和优选密码子使用的差异。
术语“特异性杂交”或“特异杂交”指当序列存在于复杂混合物，例如总细胞DNA或RNA中时，分子与该特定核苷酸序列在中等到严格杂交条件下结合、形成双螺旋或杂交。
在核酸杂交试验如Southern和Northern杂交的上下文中“严格性杂交条件”和“严格性杂交冲洗条件”依赖于序列，并且它们在不同环境参数下不同。例如，较长序列在较高温度特异性杂交。Tm是限定离子强度和pH下的温度，在该温度50％靶序列与完全匹配的探针杂交。典型地，特异性是杂交后冲洗的函数。这种冲洗的至关重要因素包括终冲洗溶液的离子强度和温度。
一般地，在限定离子强度和pH情况下，选定严格性条件为比特定序列热解链温度(Tm)低约50℃。Tm是(限定离子强度和pH条件下)50％靶序列与完全匹配的探针杂交的温度。Tm依赖于溶液条件和探针的碱基组成，可以利用下面公式计算
Tm＝79.8℃+(18.5×Log[Na+])+(58.4℃×％[G+C])
-(820/双螺旋中的#bp)-(0.5×％甲酰胺)
更优选的严格性条件是温度在Tm以下20℃时，最优选的严格性条件是温度在Tm以下10℃时。利用大量已知技术中任何一种技术，如，例如用含有蛋白质的溶液封闭膜、向杂交缓冲液添加异源RNA、DNA和SDS和用RNase处理也可以控制非特异性结合。
典型地，在严格性条件或该条件以下进行冲洗条件。一般地，上文阐述了核酸杂交测定或基因扩增检测的适合的严格性条件。也可以选择或多或少严格性条件。
为了限定严格性水平的目的，可以方便地参考参考文献Sambrook，J.，E.F.Fritsch，等，1989“分子克隆实验室指南，第二版，ColdSpring Harbor，NY，Cold Spring Harbor Laboratory Press，11.45。低严格性条件的例子是4-6X SSC/0.1-0.5％w/v SDS，在37℃-45℃，进行2-3小时。根据参与杂交的核酸来源和浓度，可以利用可替代的严格性条件，如中等严格性条件。中等严格性条件的例子包括1-4X SSC/0.25％w/v SDS，在≥45℃，进行2-3小时。高严格性条件的例子包括0.1-1XSSC/0.1％w/v SDS，在60℃，进行1-3小时。本领域技术人员知道杂交和冲洗期间可以改变的各种参数，并且这些参数或者维持或者改变严格性条件。例如，另一个严格性条件是在65℃，4X SSC杂交，接着在65℃，0.1X SSC中洗涤约1小时。做为可替代方案，示例的严格性杂交条件是在42℃，50％甲酰胺，4XSSC中。严格性条件的另一个例子包括在62℃，6X SSC，0.05X BLOTTO中杂交和在62℃，2X SSC，0.1％SDS中洗涤。
清楚地，本发明包括了以上定义的编码细胞分裂素氧化酶、其同系物、衍生物或免疫活性和/或功能性片段的本发明DNA序列在任何杂交方法中的用途。而且，本发明也涉及与所述本发明DNA序列杂交的DNA序列。优选地，细胞分裂素氧化酶是植物细胞分裂素氧化酶，更具体是拟南芥(Arabidopsis thaliana)(At)CKX。
为了实现蛋白质在优选植物来源的细胞、组织或器官中的表达，或者通过例如微注射或轰击方法可以将蛋白质直接引入所述细胞，或者作为可替代方案，可以以可表达形式将编码所述蛋白质的分离的核酸分子引入所述细胞、组织或器官。
优选地，本发明DNA序列包含上文定义的编码细胞分裂素氧化酶蛋白质或其同系物或衍生物或其免疫活性和/或功能性片段的编码序列或开放读框(ORF)。本发明优选的蛋白质包含所述细胞分裂素氧化酶的氨基酸序列。优选地，所述细胞分裂素氧化酶是植物细胞分裂素氧化酶，并且更具体地是拟南芥(Arabidopsis thaliara)(At)CKX。
“载体”或“载体序列”意指可以通过转化引入生物体的DNA序列，并且可以在所述生物体中稳定维持它。在，例如大肠杆菌(Escherichiacoli)，根瘤农杆菌(A.tumefaciens)，酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)或粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)的培养物中载体维持是可能的。可以在细菌和/或病毒中维持和繁殖其它载体如噬菌粒和粘粒。一般地，载体序列包含一组限制酶识别的唯一位点，多个克隆位点(MCS)，其中可以插入一个或多个非载体序列。
“非载体序列”相应地意指在包含在载体内一个或多个MCS的位点整合的DNA序列。
“表达载体”形成载体的亚组，由于包含适合的调节或控制序列，其能够产生插入的非载体序列的可表达形式，因此允许所述非载体序列编码的蛋白质表达。表达载体是本领域已知的，其能使蛋白质在生物体，包括细菌(例如大肠杆菌(E.coli))、真菌(例如酿酒酵母(S.cerevisiae)，粟酒裂殖酵母(S.pombe)，巴氏毕赤酵母(Pichiapastoris))、昆虫细胞(例如杆状病毒表达载体)、动物细胞(例如，COS或CHO细胞)和植物细胞(例如，基于马铃薯病毒X的表达载体)中表达。
清楚地，本发明包含上文所述任何细胞分裂素氧化酶、其同系物、衍生物和/或免疫活性和/或功能性片段。优选地，所述细胞分裂素氧化酶是植物细胞分裂素氧化酶、更具体地是拟南芥(Arabidopsis thaliana)(At)CKX。
作为生物系统中表达载体介导的蛋白质产生的可替代方案，可以应用化学蛋白质合成。可以在液相中或固相中制备合成的肽。然而，固相肽合成(Merrifield 1963)是最常用的方法，包括顺序添加氨基酸以产生线性肽链。固相肽合成包括3个步骤的循环(i)将成长中肽链的羧基末端氨基酸固定到固相支持体或树脂；(ii)链组装，该过程包括待添加到成长链的氨基酸的激活，偶联和去保护；和(iii)切割，包括从树脂移下完整的肽链和从氨基酸侧链去除保护基团。固相肽合成的通常方法包括Fmoc/tBu(9-芴基甲氧羰基/叔丁基)和Boc(叔丁氧羰基)用作氨基酸氨基末端保护基。氨基酸侧链保护基团包括甲基(Me)、甲酰(CHO)、乙基(Et)、乙酰基(Ac)、叔丁基(t-Bu)、茴香基、苄基(Bzl)、三氟乙酰基(Tfa)、N-羟基琥珀酰亚胺(ONSu，OSu)、苯甲酰基(Bz)、4-甲苄基(Meb)、硫代茴香基、硫代羟甲苯基、苄氧基甲基(Bom)、4-硝基苯基(ONp)、苄氧基羰基(Z)、2-硝基苯甲酰(NBz)、2-硝基苯基巯基(Nps)、4-甲苯磺酰(Tosyl，Tos)、五氟苯基(Pfp)、二苯甲基(Dpm)、2-氯苄氧基羰基(Cl-Z)、2，4，5-三氯苯基、2-溴苄氧基羰基(Br-Z)、三苯甲基(Trityl，Trt)和2，5，7，8-五甲基-色满-6-碘酰(Pmc)。在链组装期间，除去Fmoc或Boc，产生了激活的与成长链结合的氨基酸残基氨基末端。例如，通过HBTU转化为高度反应活性的酯激活正在产生的氨基酸羧基末端。利用目前技术(例如，PerSeptive Biosystems 9050合成仪，Applied BiosystemsModel 431A肽合成仪)，可以制备达到50个残基的线性肽。可以得到许多指南以产生适于用在生物系统中的肽，包括(i)限制困难氨基酸如cys，met，trp(在肽合成期间容易氧化和/或降解)或arg的使用；(ii)最小化疏水性氨基酸(可以削弱肽的溶解性)；和(iii)避免氨基末端的谷氨酸(可以环化为焦谷氨酸)。
“可表达形式”意指分离的核酸分子是适于组成地，或通过细胞内或细胞外信号诱导后被转录为mRNA和/或被翻译以产生蛋白质的形式，所述细胞内外信号如环境刺激或胁迫(促细胞分裂剂、缺氧、低氧、温度、盐、光、干燥等)或者化学化合物如IPTG(异丙基-β-D-硫代吡喃型半乳糖苷)或如抗生素(四环素、氨苄青霉素、利福平、卡那霉素)、激素(例如赤霉素、植物生长素、细胞分裂素、糖皮质激素、油菜素类固醇、乙烯、脱落酸等)、激素类似物(吲哚乙酸(IAA)，2，4-D等)、金属(锌、铜、铁等)或地塞米松，或其它。如本领域技术人员所将知道的，功能性蛋白质的表达也可能需要一种或多种翻译后修饰，如糖基化、磷酸化、去磷酸化，或者一种或多种蛋白质-蛋白质相互作用等等。所有这些过程包含在本发明术语“可表达形式”范围内。
优选地，通过将编码所述蛋白质的分离的核酸分子，如cDNA分子、基因组基因、合成的寡核苷酸分子、mRNA分子或开放读框引入到所述细胞、组织或器官并在其中表达来实现优选植物来源的特定细胞、组织或器官中蛋白质的表达，其中放置所述核酸分子使其可操作地连接适合的调节或控制序列，包括启动子，优选植物可表达的启动子和终止子序列。
这里提到的“启动子”采用最广的范围，并且包含来源于经典真核生物基因组基因的转录调节序列，该转录调节序列包括精确转录起始所需的TATA盒子，有或无CCAAT盒子序列和应答发育和/或外部刺激，或以组织特异性方式改变基因表达的其它转录和调节元件(即，上游激活序列，增强子和沉默子)。
术语“启动子”也包含经典原核生物基因的转录调节序列，在这种情况下，其可以包含-35盒子序列和/或-10盒子转录调节序列。
术语“启动子”也可以用于描述赋予、激活或增强细胞、组织或器官中核酸分子表达的合成或融合分子，或者衍生物。
启动子可以含有一个或多个特定调节元件的额外拷贝以进一步增强与其可操作连接的核酸分子的表达，和/或改变空间表达和/或时间表达。可以邻接异源启动子序列放置这种调节元件以驱动核酸分子应答例如铜、糖皮质素、地塞米松、四环素、赤霉素、cAMP、脱落酸、植物生长素、创伤、乙烯、茉莉酮酸酯或水杨酸而表达，或者赋予核酸分子对特异性细胞、组织或器官，如分生组织、叶、根、胚、花、种子或果实的表达。
在本发明上下文中，优选地，启动子是植物可表达的启动子序列。本发明不排除在非植物细胞如细菌、酵母细胞和动物细胞中也起作用或仅在其中起作用的启动子。“植物可表达的”意指启动子序列，包括添加到它的或其中含有的任何调节元件，至少具有诱导、提供、激活或增强植物细胞、组织或器官，优选单子叶或双子叶植物细胞、组织或器官中表达的能力。
这里使用的术语“植物可操作的”和“植物中可操作的”，就启动子序列而言，应理解为植物可表达的启动子序列的等同物。
可调节的启动子作为双元病毒植物表达系统的部分也是本领域技术人员公知的(Yadav 1999-WO9922003；Yadav 2000-WO0017365)。
在本发明上下文中，“可调节的启动子序列”是能够可选地在特异性条件下赋予结构基因在植物特定细胞、组织或器官或者细胞、组织或器官组中表达，但是通常不赋予在所有条件下在整个植物中表达的启动子。因此，可调节的启动子序列可以是赋予在植物内特定位置中与之可操作地连接的基因表达的启动子序列，或者做为可替代方案，在一组特定的条件下，例如通过化学化合物或其它诱发剂诱导表达后，赋予整个植物表达的启动子序列。
优选地，用在本发明操作中的可调节的启动子组成地或者诱导后赋予了植物内特定位置中的表达，但是不是任何条件下整个植物中的表达。包括在这种启动子范围内的是细胞特异性启动子序列，组织特异性启动子序列，器官特异性启动子序列，细胞周期特异性基因启动子序列，诱导型启动子序列和组成型启动子序列，例如通过转座遗传因子(Ac，Ds，Spm，En或其它转座子)内所述组成型启动子的整合，已经修饰了该组成型启动子序列以赋予在任何时间，植物特定部分中的表达。
类似地，术语“组织特异性”应该理解为意指尽管表达不必仅在所述组织或组织类型中，但是表达主要是在优选植物来源的特定的组织或组织类型中。
类似地，术语“器官特异性”应该理解为意指尽管表达不必仅在所述器官中，但是表达主要是在优选植物来源的特定的器官中。
类似地，术语“细胞周期特异性”应该理解为意指尽管表达不必要仅在细胞周期细胞中，优选植物来源的周期细胞中，但是其主要是细胞周期性的，并在一或多个，不必要是连续的细胞周期时期中存在。
本领域技术人员将知道“诱导型启动子”是应答发育、化学、环境或物理刺激其转录活性被增加或诱导的启动子。类似地，本领域技术人员也将理解“组成型启动子”是在生物体生长和发育的大多数阶段，但不必是所有阶段期间，在生物体，优选植物的大多数部分，但不必是所有部分中有转录活性的启动子。
不用过度试验，本领域技术人员从公众可得到或容易得到的来源，将能够容易地选定用于调节细胞分裂素氧化酶蛋白质适当表达的适合启动子序列。
放置核酸分子受启动子序列调节控制或者与启动子序列可操作地连接意指定位所述的核酸分子，使其表述受启动子序列控制。启动子常常、但不是必需定位在其调节的核酸分子上游，或在5’-末端，并且在转录起始位点2kb内。在异源启动子/结构基因组合的构建中，一般地优选在距基因转录起始位点的如下距离处定位启动子，该距离大约与启动子和其在天然背景中控制的基因(即，启动子来源的基因)的距离相同。如本领域所公知，可以容纳该距离的一些变化，而启动子功能没有遗失。类似地，调节序列元件相对于置于其控制之下的异源基因的优选位置受其天然背景(即，其来源的基因)中该元件位置限定。而且，如本领域所知，该距离也可以出现一些变化。
适于用在本发明基因构建体中启动子的例子包括表4中列出的启动子和其它启动子。提供表4中列出的启动子仅仅为了举例说明的目的，本发明不受这里提供的列表限制。本领域技术人员将容易地提供用于进行本发明的其它启动子。
在组成型启动子或诱导整个植物中表达的启动子情况下，优选通过核苷酸添加来修饰这种序列，所说核苷酸序列来源于表4中所列的一种或多种组织特异性启动子，或者做为可替代方案，所述核苷酸序列来源于上述一种或多种组织特异性诱导型启动子，以赋予其组织特异性。如前所述(Ellis等，1987)，例如，可以通过玉米Adh1启动子序列的添加修饰CaMV 35S启动子，以赋予其厌氧调节的根特异性表达。另一个例子描述了通过将CaMV35S启动子与玉米富甘氨酸蛋白质GRP3基因的元件融合，赋予了根特异性或根高丰富度基因表达(Feix和Wulff 2000-WO0015662)。本领域技术人员通过常规试验可以获得这种修饰。
术语“终止子”(teminator)指在转录单元末端的DNA序列，其发出转录终止的信号。终止子是包含聚腺苷酸化信号的3’-非翻译DNA序列，该聚腺苷酸化信号有利于向初级转录物3’-末端添加聚腺苷酸序列。已知并且在文献中描述了在来源于病毒、酵母、霉菌、细菌、昆虫、鸟类、哺乳动物和植物的细胞中有活性的终止子。可以从细菌、真菌、病毒、动物和/或植物分离它们。
表4.示例的用在本发明实施中的植物可表达启动子I细胞特异性、组织特异性和器官特异性启动子基因来源表达模式参考文献α-淀粉酶(Amy32b)糊粉Lanahan，M.B.，等.，Plant Cell 4203-211，1992；Skriver，K.，等，Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)887266-7270，1991组织蛋白酶(-样基因糊粉Cejudo，F.J.，等.Plant Molecular Biology20849-856，1992.毛根农杆菌(Agrobacteriumrhizogenes)rolB形成层Nilsson等，Physiol.Plant.100456-462，1997AtPRP4花http//salus.medium.edu/mmg/tierney/html查耳酮合酶(chsA)花Van der Meer，等，Plant Mol.Biol.15，95-109，1990.LAT52花药Twell等，Mol.Gen Genet.217240-245(1989)apetala-3花几丁质酶果实(浆果、葡萄等)Thomas等.CSIRO Plant Industry，Urrbrae，South Australia，Australia；http//winetitles.com.au/gwrdc/csh95-1.htmlrbcs-3A绿色组织(例如叶)Lam，E.等，The Plant Cell 2857-866，1990.；Tucker等，Plant Physiol.1131303-1308，1992.叶片特异性基因叶Baszczynski，等，Nucl.Acid Res.164732，1988.AtPRP4叶http//salus.medium.edu/mmg/tierney/html小球藻病毒腺嘌呤甲基转移酶基因启动子叶Mitra和Higgins，1994，Plant MolecularBiology 2685-93稻的aldP基因启动子叶Kagaya等，1995，Molecular and GeneralGenetics 248668-674稻或番茄的rbcs启动子叶Kyozuka等，1993，Plant Physiology 102991-1000松属cab-6叶Yamamoto等，Plant Cell Physiol.35773-778，1994.核酮糖二磷酸羧化/加氧酶启动子叶cab(叶绿素a/b结合蛋白质叶SAM22衰老的叶Crowell，等，Plant Mol.Biol.18459-466，1992.Ltp基因(脂质转移基因)Fleming，等，Plant J.2，855-862.日本根瘤菌(R.japonicum)nif基因根瘤美国专利号4,803,165日本慢生根瘤菌(B.japonicum)nifH基因根瘤美国专利号5,008,194GmENOD40根瘤Yang，等，The Plant J.3573-585.PEP羧化酶(PEPC)根瘤Pathirana，等，Plant Mol.Biol.20437-450，1992.豆血红蛋白(Lb)根瘤Gordon，等，J.Exp.Bot.441453-1465，1993.Tungro bacilliform病毒基因韧皮部Bhattacharyya-Pakrasi，等，The Plant J.471-79，1992.花粉特异性基因花粉；小孢子Albani，等，Plant Mol.Biol.15605，1990；Albani，et al.，Plant Mol.Biol.16501，1991)Zm13花粉Guerrero等，Mol.Gen.Genet.224161-168(1993)apg基因小孢子Twell等，Sex.Plant Reprod.6217-224(1993)玉米花粉特异性基因花粉Hamilton等，Plant Mol.Biol.18211-218，1992.向日葵花粉表达的基因花粉Baltz，等，The Plant J.2713-721，1992.甘蓝型油菜(B.napus)花粉特异性基因花粉；花药；绒毡层Arnoldo等，J.Cell.Biochem.，Abstract No.Y101，204，1992.根可表达的基因根Tingey，等，EMBO J.61，1987.烟草植物生长素诱导型基因根尖Van der Zaal，等，Plant Mol.Biol.16，983，1991.β-微管蛋白根Oppenheimer，等，Gene 6387，1988.烟草根特异性基因根Conkling，等，Plant Physiol.931203，1990.甘蓝型油菜(B.napus)G1-3b基因根美国专利号5,401,836SbPRP1根Suzuki等，Plant Mol.Biol.21109-119，1993.AtPRP1；AtPRP3根；根毛http//salus.medium.edu/mmg/tierney/htmlRD2基因根皮层http//www2.cnau.edu/ncsu/researchTobRB7基因根维管结构http//www2.cnsu.edu/ncsu/researchAtPRP4叶片；花；侧根原基http//salus.medium.edu/mmg/tierney/html种子特异性基因种子Simon，等，Plant Mol.Biol.5191，1985；Scofield，等，J.Biol.Chem.26212202，1987.；Baszczynski，等，Plant Mol.Biol.14633，1990.巴西坚果白蛋白种子Pearson，等，Plant Mol.Biol.18235-245，1992.豆球蛋白种子Ellis，等，Plant Mol.Biol.10203-214，1988.谷蛋白(水稻)种子Takaiwa，等，Mol.Gen.Genet.20815-22，1986；Takaiwa，et al.，FEBS Letts.22143-47，1987.玉米醇溶蛋白种子Matzke等，Plant Mol Biol，14(3)323-321990NapA种子Stalberg，等，Planta 199515-519，1996.小麦LMW和HMW麦谷蛋白-1胚乳Mol Gen Genet 21681-90，1989；NAR17461-2，1989小麦tSPA种子Albani等，Plant Cell，9171-184，1997小麦α，β，γ-麦醇溶蛋白胚乳EMBO 31409-15，1984大麦Itr1启动子胚乳大麦B1，C，D，大麦醇溶蛋白胚乳Theor Appl Gen 981253-62，1999；Plant J4343-55，1993；Mol Gen Genet 250750-60，1996大麦DOF胚乳Mena等，The Plant Journal，116(1)53-62，1998blz2胚乳EP99106056.7合成的启动子胚乳Vicente-Carbajosa等，Plant J.13629-640，1998.水稻醇溶谷蛋白NRP33胚乳Wu等，Plant Cell Physiology 39(8)885-889，1998水稻α-球蛋白Glb-1胚乳Wu等，Plant Cell Physiology 39(8)885-889，1998水稻OSH1胚Sato等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，938117-8122，1996水稻α-球蛋白REB/OHP-1胚乳Nakase等，Plant Mol.Biol.33513-522，1997水稻ADP-葡萄糖PP胚乳Trans Res 6157-68，1997玉米ESR基因家族胚乳Plant J 12235-46，1997高梁γ-高梁醇溶蛋白胚乳PMB 321029-35，1996KNOX胚Postma-Haarsma等，Plant Mol.Biol.39257-71，1999水稻油质蛋白胚和糊粉Wu等，J.Biochem.，123386，1998向日葵油质蛋白种子(胚和干燥种子)Cummins，等，Plant Mol.Biol.19873-876，1992LEAFY枝条分生组织Weigel等，Cell 69843-859，1992.拟南芥(Arabidopsisthaliana)knat1枝条分生组织记录号AJ131822苹果(Malusdomestica)kn1枝条分生组织记录号Z71981CLAVATA1枝条分生组织记录号AF049870柱头特异性基因柱头Nasrallah，等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA855551，1988；Trick，等，Plant Mol.Biol.15203，1990.类型I patatin基因块茎Liu等，Plant Mol.Biol.153386-395，1991.PCNA水稻分生组织Kosugi等，Nucleic Acids Research191571-1576，1991；Kosugi S.和Ohashi Y，Plant Cell 91607-1619，1997.豌豆TubA1微管蛋白分裂细胞Stotz和Long，Plant Mol.Biol.41，601-614.1999拟南芥(Arabidopsis)cdc2a周期性细胞Chung和Parish，FEBS Lett，3；362(2)215-9，1995拟南芥(Arabidopsis)Rop1A花药；成熟花粉+花粉管Li等，1998 Plant Physiol 118，407-417.拟南芥(Arabidopsis)AtDMC1减数分裂相关Klimyuk和Jones 1997 Plant J.11，1-14.豌豆PS-IAA4/5和PS-IAA6植物生长素诱导的Wong等，1996 Plant J.9，587-599.豌豆法尼基转移酶分生组织；生长组织附近的韧皮部；光-和-糖抑制的Zhou等，1997 Plant J.12，921-930烟草(N.sylvestris)细胞周期蛋白B1；1分裂细胞/分生组织Trehin等，1997 Plant Mol.Biol.35，667-672.有丝分裂细胞周期蛋白CYS(A-型)和CYM(B-型)分裂细胞/分生组织Ito等，1997 Plant J.11，983-992拟南芥(Arabidopsis)cyc1At(＝cyc B1；1)和cyc3aAt(A-型)分裂细胞/分生组织Shaul，等，1996 Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A93，4868-4872.拟南芥(Arabidopsis)tef1启动子盒子分裂细胞/分生组织Regad等，1995 Mol.Gen.Genet.248，703-711.长春花(Catharanthusroseus)cyc07分裂细胞/分生组织Ito等，1994 Plant Mol.Biol.24，863-878. II示例的组成型启动子基因来源表达模式参考文献肌动蛋白组成型McElroy等，Plant Cell，2163-171，1990CAMV 35S组成型Odell等，Nature，313810-812，1985CaMV 19S组成型Nilsson等，Physiol.Plant.100456-462，1997GOS2组成型de Pater等，Plant J.2837-844，1992泛素组成型Christensen等，Plant Mol.Biol.18675-689，1992水稻亲环蛋白组成型Buchholz等，Plant Mol Biol.25837-843，1994玉米组蛋白H3组成型Lepetit等，Mol.Gen.Genet.231276-285，1992紫花苜蓿组蛋白H3组成型Wu等，Nucleic Acids Res.173057-3063，1989；Wu等，Plant Mol.Biol.11641-649，1988肌动蛋白2组成型An等，Plant J.10(1)；107-121，1996III示例的胁迫诱导型启动子名称胁迫参考文献P5CS(δ(1)-吡咯啉-5-羧酸合酶)盐、水Zhang等，Plant Science.12981-89，1997cor15a寒冷Hajela等，Plant Physiol.931246-1252，1990cor15b寒冷Wlihelm等，Plant Mol Biol.231073-1077，1993cor15a(-305到+78nt)寒冷、干旱Baker等，Plant Mol Biol.24701-713，1994rd29盐、干旱、寒冷Kasuga等，Nature Biotechnology18287-291，1999热激蛋白质，包括含有热激元件(HSE)的人工启动子热Barros等，Plant Mol Biol 19665-75，1992.Marrs等，DevGenet.1427-41，1993.Schoffl等，Mol Gen Gent，217246-53，1989.smHSP(小热激蛋白质)热Waters等，J Experimental Botany47325-338，1996wcs120寒冷Ouellet等，FEBS Lett. 423324-328，1998ci7寒冷Kirch等，Plant Mol Biol 33897-909，1997Adh寒冷、干旱、低氧Dolferus等，Plant Physiol 1051075-87，1994pwsi18水、盐和干旱Joshee等，Plant Cell Physiol 3964-72，1998ci21A寒冷Schneider等，Plant Physiol 113335-45，1997Trg-31寒冷Chaudhary等，Plant Mol Biol 301247-57，1996渗透蛋白渗透的Raghothama等，Plant Mol Biol 231117-28，1993Rab17渗透的，ABAVilardell等，Plant Mol Biol 17985-93，1991LapA创伤，环境的WO99/03977 University ofCalifornia/INRAIV示例的病原体诱导型启动子名称病原体参考文献RB7根癌线虫(Meloidogynespp.)US5760386-North Carolina StateUniversity；Opperman等，(1994)Science 263221-23.PR-1，2，3，4，5，8，11真菌、病毒、细菌Ward等，(1991)Plant Cell 31085-1094；Reiss等，1996；Lebel等，(1998)，Plant J，16(2)223-33；Melchers等，(1994)，Plant J，5(4)469-80；Lawton等，(1992)，Plant Mol Biol，19(5)735-43.HMG2线虫WO9503690-Virginia TechIntellectual Properties Inc.Abi3Cyst线虫(Heterodera spp.)未公开ARM1线虫Barthels等，(1997)The PlantCell 9，2119-2134.WO 98/31822植物遗传系统Att0728线虫Barthels等，(1997)The PlantCell 9，2119-2134.PCT/EP98/07761Att1712线虫Barthels等，(1997)The PlantCell 9，2119-2134.PCT/EP98/07761Gst1不同类型的病原体Strittmatter等，(1996)Mol.Plant-Microbe Interact.9，68-73.LEMMI线虫WO 92/21757植物遗传系统CLE双粒病毒组PCT/EP99/03445-CINESTAVPDF1.2真菌，包括芸苔链格孢(Alternariabrassicicola)和灰葡萄孢(Botrytiscinerea)Manners等，(1998)，Plant MolBiol，38(6)1071-80.Thi2.1真菌Fusariumoxysporum f sp.MatthiolaeVignutelli等，(1998)PlantJ；14(3)285-95DB#226线虫Bird和Wilson(1994)，植物-微生物相互作用分子生物学，7，419-42WO 95.322888DB#280线虫Bird和Wilson(1994)，植物-微生物相互作用分子生物学，7，419-42WO 95.322888Cat2线虫Niebel等，(1995)植物-微生物相互作用分子生物学，1995May-Jun；8(3)371-8Tub线虫Aristizabal等，(1996)，植物-微生物相互作用分子生物学第8次国际会议，Knoxville US B-29SHSP线虫Fenoll等，(1997)在植物-线虫相互作用的细胞和分子方面.Kluwer Academic，C.Fenoll，F.M.W.Grundler和S.A.Ohl(编辑)，Tsw12线虫Fenoll等，(1997)在植物-线虫相互作用的细胞和分子方面.Kluwer Academic，C.Fenoll，F.M.W.Grundler和S.A.Ohl(编辑)Hs1(pro1)线虫WO 98/122335-JungNsLTP病毒、真菌、细菌Molina & Garc ia-Olmedo(1993)FEBS Lett，316(2)119-22RIP病毒、真菌Tumer等，(1997)Proc Natl AcadSci USA，94(8)3866-71
特别适于用在本发明基因构建体中的终止子例子包括根瘤农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)胭脂碱合酶(NOS)基因终止子，根瘤农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)章鱼碱合酶(OCS)基因终止子序列，花椰菜花叶病毒(CaMV)35S基因终止子序列，水稻(Oryza sativa)ADP-葡萄糖焦磷酸化酶终止子序列(t3′Bt2)，玉米(Zea mays)玉米醇溶蛋白基因终止子序列，rbcs-1A基因终止子和rbcs-3A基因终止子序列，和其它终止子序列。
本发明优选的启动子序列包括根特异性启动子和种子特异性启动子，例如，但不限于表5，表4中所列出的启动子和如实施例中概述的启动子。
表5.用在本发明实施中的示例的根特异性启动子 名称来源参考文献 SbPRP1大豆Suzuki等，Plant Mol Biol，21109-119，1993 TobRB7 636bp片段烟草Yamamoto等，Plant Cell 3371-382，1991 GGPS3拟南芥(Arabidopsis)Okada等，Plant Physiol 1221045-1056，2000 prxEa 580bp片段拟南芥(Arabidopsis)Wanapu和Shinmyo，Ann N Y AcadSci 782107-114，1996 Ids2启动子大麦Okumura等，Plant Mol Biol 25705-719，1994 AtPRP3拟南芥(Arabidopsis)Fowler等，Plant Physiol 1211081-1092，1999
本领域技术人员将知道可以用于进行本发明的其它启动子序列和终止子序列。不需要任何过多的试验，可以容易地利用这些序列。
在本发明上下文中，基因或蛋白质的“异位表达”或“异位过量表达”指所述基因或蛋白质在天然条件下正常不出现的表达模式和/或表达水平，更具体地是指增加的表达和/或增加的表达水平。可以用许多方法包括将编码所述蛋白质的编码序列与分离的同源或异源启动子可操作地连接以产生嵌合基因和/或可操作地连接所述编码序列和其自身分离的启动子(即，天然地驱动所述蛋白质的表达的未分离的启动子)以产生重组基因重复或基因倍增作用来获得异位表达。“异位共表达”指两个或多个基因或蛋白质的异位表达或异位过量表达。
优选地，本发明中所用启动子序列可操作地连接上文所述编码细胞分裂素氧化酶蛋白质或其同系物，衍生物或免疫活性和/或功能性片段的编码序列或开放读框(ORF)。
这里所用的“表达的下调”指降低基因表达的水平和/或活性基因产物的水平和/或基因产物活性的水平。如Angell和Baulcombe(1998-WO9836083)，Lowe等，(1989-WO9853083)，Lederer等，(1999-WO9915682)或者Wang等(1999-WO9953050)所述，通过，例如以相对于启动子序列的有义方向(如果引起共抑制)或者反义方向添加编码序列或其部分，和通过，例如插入诱变(例如T-DNA插入或转座子插入)或通过基因沉默策略可以完成表达的降低。目的在于沉默基因表达的基因构建体可以有以相对于启动子序列有义和/或反义方向包含的所述基因的核苷酸序列(或其一个或多个部分)。另一个下调基因表达的方法包括核酶的应用。
可以通过将细胞、组织、器官或生物体施用或暴露于所述基因产物、其同系物、衍生物和/或免疫活性片段可以实现调节，包括降低，活性基因产物或基因产物活性的水平。免疫调节是具有下调活性基因产物和/或基因产物活性水平能力的另一种技术的例子，包括施用或暴露所述基因产物的抗体于其中要调节所述基因产物的水平和/或基因产物活性的细胞、组织、器官或生物体，或在这种细胞、组织、器官或生物体中表达所述基因产物的抗体。这种抗体包括“植物抗体(plantibodies)”，单链抗体、IgG抗体和重链camel抗体及其片段。
还可以通过将细胞、组织、器官或生物体施用或暴露于所述基因产物或其活性的拮抗剂(agonist)实现调节，包括降低，活性基因产物或基因产物活性的水平。这种拮抗剂包括上文所述本发明鉴定的蛋白质(包括例如，激酶和蛋白酶)和化学化合物。
在本发明上下文中设想了早先定义的细胞分裂素氧化酶基因表达的下调。优选地，所述细胞分裂素氧化酶是植物细胞分裂素氧化酶，更具体是AtCKX。本发明还包括细胞分裂素氧化酶蛋白质或细胞分裂素氧化酶活性水平的下调，在此，上文已经定义了所述细胞分裂素氧化酶蛋白质。优选地，所述细胞分裂素氧化酶蛋白质是植物细胞分裂素氧化酶蛋白质，更具体是AtCKX。
“修饰细胞命运和/或植物发育和/或植物形态学和/或生物化学和/或生理学”意指通过进行这里所述本发明的一个或多个步骤改变植物的一个或多个发育和/或形态学和/或生物化学和/或生理学特征。
“细胞命运”指植物发育期间或为此的细胞过程，特别是细胞周期期间或者作为细胞周期过程的结果产生的特定细胞的细胞类型或细胞特征。
这里使用的“植物发育”或术语“植物发育特征”应该理解为意指参与决定植物细胞发育命运，特别是祖细胞将发育成的特定组织或器官类型的植物的任何细胞过程。参与植物发育的细胞过程是本领域技术人员公知的。这种过程包括，例如形态发生、光形态发生、茎干发育、根发育、营养发育、繁殖发育、茎延长、开花和参与决定细胞命运的调节机理，特别是参与细胞周期的过程或调节过程。
当这里使用“植物形态学”或术语“植物形态学特征”时，本领域技术人员将理解为意指植物的外观，包括任何一种或多种结构特征或其结构特征的联合。这种结构特征包括植物任何细胞、组织或器官或者细胞、组织、器官组，包括根、茎、叶、枝条、叶柄、毛状体、花、花瓣、柱头、花柱、雄蕊、花粉、胚珠、种子、胚、胚乳、种皮、糊粉、纤维、果实、形成层、木材、心材、薄壁组织、通气组织、筛分子、韧皮部或维管组织等的形状大小、数量、位置、颜色、组织结构、排列和模式化。
当这里使用“植物生物化学”或术语“植物生物化学特征”或类似术语时，本领域技术人员将理解为意指植物的代谢和催化过程，包括初级和次级代谢和其产物，包括植物产生的任何小分子、大分子或化学化合物，如，但不限于淀粉、糖、蛋白质、肽、酶、激素、生长因子、核酸分子、纤维素、半纤维素、愈伤葡聚糖、凝集素、纤维、色素如花青苷、维生素、矿物质、微量营养物或者大量营养物。
这里使用的“植物生理学”或术语“植物生理学特征”或类似术语将理解为意指植物功能性过程，包括发育过程如生长、扩展和分化，有性发育、有性繁殖、结籽、种子发育、籽粒灌浆、无性繁殖、细胞分裂、休眠、发芽、光适应、光合作用、叶片扩展、纤维产生、次级生长或木材产生等等；植物对外加因子如金属、化学试剂、激素、生长因子、环境和环境胁迫因子(例如，缺氧，低氧、高温、低温、干燥、光、昼长、水淹、盐、重金属等)的应答，包括植物对所述外加因子的适应性应答。
将重组DNA引入植物组织或细胞的方法包括，但不限于利用CaCl2和其变化形式的转化，特别是Hanahan(1983)所述的方法，直接DNA摄取进入原始质体(Krens等，1982；Paszkowski等，1984)，PEG-介导的原生质体摄取(Armstrong等，1990)，微粒轰击，电穿孔(Fromm等，1985)，DNA的微注射(Crossway等，1986)，组织外植体或细胞的微粒轰击(Christou等，1988；Sanford，1988)，基本如An等，(1985)，Dodds等，(1985)，Herrera-Estrella等，(1983a，1983b，1985)所述的用核酸的组织真空渗入，或在植物的情况下，从农杆菌属(Agrobacterium)到植物组织的T-DNA介导的转化。单子叶植物转化的方法是本领域已知的，包括农杆菌属(Agrobacterium)介导的转化(Cheng等，1997-WO9748814；Hansen 1998-WO9854961；Hiei等，1994-WO9400977；Hiei等，1998-WO9817813；Rikiishi等，1999-WO9904618；Saito等，1995-WO9506722)，微射弹轰击(Adams等，1999-US5969213；Bowen等，1998-US5736369；Chang等，1994-WO9413822；Lundquist等，1999-US5874265/US5990390；Vasil和Vasil，1995-US5405765.Walker等，1999-US5955362)，DNA摄取(Eyal等，1993-WO9318168)，农杆菌属(Agrobacterium)细胞的微注射(von Holt，1994-DE4309203)和超声处理(Finer等，1997-US5693512)。
对于细胞的微粒轰击，将微粒推进细胞以产生转化的细胞。任何适合的弹道细胞转化方法学和仪器都可以用于进行本发明。Stomp等，(美国专利号5,122,466)和Sanford和Wolf(美国专利号4,945,050)公开了示例性的仪器和方法。当使用弹道转化方法时，基因构建体可以掺入在待转化的细胞中具有复制能力的质粒。适于用在这种系统中的微粒的例子包括1到5μm金球体。可以通过任何适合的技术，如通过沉淀在微粒上沉积DNA构建体。
根据本领域公知的方法，可以从转化或转染细胞再生整个植物。可以用本发明基因构建体转化具有无论通过器官发生还是胚发生随后无性繁殖能力的植物组织，由此再生整个植物。选定的特定组织将根据转化的特定物种可得到的和最适的无性繁殖系统而变化，示例的组织靶包括叶盘、花粉、胚、子叶、下胚轴、雌配子体、愈伤组织、存在的分生组织(例如，顶端分生组织、腋芽和根分生组织)和诱导的分生组织(例如子叶分生组织和下胚轴分生组织)。
这里所用术语“器官发生”意指芽和根从分生组织中心顺序发育的过程。
这里所用术语“胚发生”意指芽和根无论从体细胞还是配子，以协同方式(不是顺序地)一起发育的过程。
优选地，通过本领域知道的方法，如微射弹轰击、显微注射、农杆菌属(Agrobacterium)介导的转化(包括in planta转化)，原生质体融合或电穿孔、其它方法，根据用基因序列转染或转化或引入蛋白质的本发明方法产生植物。最优选地，通过农杆菌属(Agrobacterium)介导的转化产生所述的植物。
植物、酵母、霉菌或丝状真菌的农杆菌属(Agrobacterium)介导的转化或农杆菌弹击法转化(agrolistic transformation)是以将转化载体序列称为T-DNA的部分转移到核并且在所述真核生物基因组中整合所述T-DNA为基础。
“农杆菌属(Agrobacterium)”意指农杆菌科(Agrobacteriaceae)的成员，更优选地农杆菌属(Agrobacterium)和根瘤杆菌属(Rhizobacterium)，最优选根瘤农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)。
“T-DNA”或“转移DNA”意指以T-DNA边界为侧翼的转化载体部分，在农杆菌属(Agrobacterium)vir基因激活后，在T-DNA边界被切割，并且作为单链DNA转移到真核生物细胞的核中。
当这里用“T-DNA边界”，“T-DNA边界区域”或“边界区域”意指或者右T-DNA边界(RB)或者左T-DNA边界(LB)。这种边界包含核心序列，核心序列侧翼是作为边界侧翼T-DNA一部分的边界内部区域和/或作为边界侧翼载体骨架一部分的边界外部区域。在章鱼碱型载体的情况下，核心序列含有22bp，在胭脂碱型载体的情况下核心序列含有25bp。右边界区域和左边界区域的核心序列形成不完全重复。边界核心序列对于农杆菌属切口复合物的识别和加工必不可少，所述复合物至少包含VirD1和VirD2。T-DNA侧翼的核心序列足以促进所述T-DNA的转移。然而，利用携带有仅以所述核心序列为侧翼的所述T-DNA的转化载体，转化效率低。已知边界内和外部区域调节T-DNA转移的效率(Wang等，1987)。已经表征了一个增强T-DNA转移的元件，其位于右边界外部区域，并且称为overdrive(Peralta等，986，van Haaren等1987)。
“T-DNA转化载体”或“T-DNA载体”意指包含以右和左T-DNA边界为侧翼的T-DNA序列的任何载体，并且用于任何真核细胞的转化，该右和左T-DNA边界至少分别由右和左边界核心序列组成。
“T-DNA载体骨架序列”或“T-DNA载体骨架序列”意指含T-DNA载体位于T-DNA边界外，更具体地，位于边界核心不完整重复切口位点外的所有DNA。
本发明包括优化的T-DNA载体，使得真核生物细胞基因组中载体骨架整合最少或没有。“优化的T-DNA载体”意指设计的T-DNA载体或者降低或者消除了载体骨架序列向真核生物细胞基因组的转移。这种T-DNA载体对本领域技术人员是已知的，并且包括Hanson等，(1999)和Stuiver等，(1999-WO9901563)所述的T-DNA载体。
本发明清楚地考虑了在农杆菌弹击法转化所用的任何T-DNA载体，包含双元转化载体、超双元转化载体，共整合转化载体、Ri-来源的转化载体中及带有T-DNA的载体中包含上文所述编码细胞分裂素氧化酶，其同系物、衍生物或免疫活性和/或功能性片段的DNA序列。优选地，所述细胞分裂素氧化酶是植物细胞分裂素氧化酶，更具体地是拟南芥(At)CKX。
“双元转化载体”意指T-DNA转化载体，其包含
(a)T-DNA区域，其包含至少一个目的基因和/或至少一个在待转化真核生物细胞中有活性的选择标记；和
(b)载体骨架区域，其至少包含在大肠杆菌(E.coli)和农杆菌属(Agrobacterium)中有活性的复制起点和用于在大肠杆菌(E.coli)和农杆菌属(Agrobacterium)中选择的标记。
双元转化载体的T-DNA边界可以来源于章鱼碱型或胭脂碱型Ti质粒或者来源于这两个Ti质粒。双元载体的T-DNA仅联合辅助质粒被转移到真核生物细胞。
“辅助质粒”意指在农杆菌属(Agrobacterium)中稳定维持的质粒，并且至少带有一套使T-DNA能够转移必需的vir基因。所述一套vir基因可以来源于章鱼碱型或胭脂碱型Ti质粒或者来源于这两个Ti质粒。
“超双元转化载体”意指双元转化载体，它在载体骨架区域还带有
超级毒性根瘤农杆菌(A.tumefaciens)株系A281(EP0604662，EP0687730)的Ti质粒pTiBo542的vir区域。超双元转化载体与辅助质粒联合使用。
“共整合转化载体”意指T-DNA载体，它至少包含
(a)T-DNA区域，其包含至少一个目的基因和/或至少一个在植物中有活性的选择标记；和
(b)载体骨架区域，其至少包含在大肠杆菌(E.coli)和农杆菌属(Agrobacterium)中有活性的复制起点和用于在大肠杆菌(E.coli)和农杆菌属(Agrobacterium)中选择的标记，和一套使T-DNA转移必需的vir基因。
所述T-DNA载体的T-DNA边界和所述一套vir基因可以来源于章鱼碱型或胭脂碱型Ti质粒或者来源于这两个Ti质粒。
“Ri-来源的转化载体”意指双元转化载体，其中T-DNA边界来源于Ti质粒，所述双元转化载体与带有必需的一套vir基因的“辅助”Ri-质粒联合使用。
如这里所用的术语“选择标记基因”或“选择标记”或“用于选择的标记”包括赋予细胞表型的任何基因，其中，其表达有利于用本发明基因构建体或其衍生物转染或转化的细胞的鉴定和/或筛选。这里考虑的适合的选择标记基因包括氨苄青霉素抗性(Ampr)，四环霉素抗性基因(Tcr)，细菌卡那霉素抗性基因(Kanr)，膦丝菌素抗性基因，新霉素磷酸转移酶基因(nptII)，潮霉素抗性基因，β-葡糖醛酸酶(GUS)基因，氯霉素乙酰转移酶(CAT)基因，绿色荧光蛋白(gfp)基因(Haseloff等，1997)和萤光素酶基因和其它选择标记基因。
“农杆菌弹击法(agrolistics)”，“农杆菌弹击转化”或“农杆菌弹击转移”这里意指联合农杆菌属(Agrobacterium)介导的转化和生物弹击(biolistic)DNA递送的特征的转化方法。正因为如此，含有T-DNA的靶质粒与能够在植物中产生VirD1和VirD2，有或无VirE2的DNA/RNA共递送(Hansen和Chilton 1996；Hansen等，1997；Hansen和Chilton1997-WO9712046)。
“外源DNA”意指通过重组技术在宿主细胞基因组中引入的任何DNA序列。所述外源DNA包括例如T-DNA序列或其部分，如包含可表达形式的选择标记的T-DNA序列。而且，外源DNA包含上文所述的间插DNA序列。
“重组事件”意指位点特异性重组事件或由于转座子“跳跃”引起的重组事件。
“重组酶”意指位点特异性重组酶或转座酶。
“重组位点”意指位点特异性重组位点或转座子边界序列。
“位点特异性重组事件”意指由一般由3个元件一对DNA序列(位点特异性重组序列或位点)和特异性酶(位点特异性重组酶)组成的系统催化的事件。位点特异性重组酶根据位点特异性重组序列的方向，仅催化两个位点特异性重组序列间的重组反应。在位点特异性重组酶存在的情况下，当位点特异性重组序列以相互相反方向定向(即，反向重复)时，间插在两个位点特异性重组位点之间的序列将倒置。如果位点特异性序列以相互相同的方向定向(即，同向重复)，那么一旦与位点特异性重组酶相互作用，任何间插序列将缺失。因此，如果位点特异性重组序列做为同向重复在整合进入真核生物基因组中的外源DNA两个末端存在，那么所述序列的这种整合随后可以被位点特异性重组序列与相应的位点特异性重组酶的相互作用所逆转。
可以利用大量不同的位点特异性重组酶系统，包括但不限于噬菌体P1的Cre/lox系统，酵母的FLP/FRT系统，噬菌体Mu的Gin重组酶，大肠杆菌(E.coli)的Pin重组酶，志贺氏菌属(Shigella)的PinB，PinD和PinF，和pSR1质粒的R/RS系统。重组酶通常都是整合酶、解离酶或翻转酶(flippases)。而且，双特异性重组酶可以与对应双特异性重组酶的两个不同位点特异性重组位点的同向重复或不同向重复(indirectrepeats)联合使用(WO99/25840)。两个优选的位点特异性重组酶系统是噬菌体P1 Cre/lox和酵母FLP/FRT系统。在这些系统中，重组酶(Cre或FLP)与其各自位点特异性重组序列(分别是lox或FRT)相互作用以倒置或切除间插序列。这两个系统的每个系统的位点特异性重组序列都相对短(对于lox是34bp，对于FRT是47bp)。在植物如烟草(Dale等，1990)和拟南芥(Arabidopsis)(Osborne等，1995)中已经高效率地使用了这些系统的一些系统。位点特异性重组系统在植物分子生物学，包括控制同源重组(例如，US5527695)、靶向插入、基因堆积等方法(WO99/25821)和复合T-DNA整合模式的解离或选择标记的切除(WO99/23202)方法中有许多应用。
尽管位点特异性重组序列必须与待切除或待倒置的DNA的末端连接，但是编码位点特异性重组酶的基因可以定位在其它地方。例如，重组酶基因可以已经存在真核生物DNA中或者可以由后来引入的DNA片段提供，该DNA片段可以通过交换或通过异体授粉或直接引入细胞中。做为可替代方案，例如，可以通过显微注射或粒子轰击将基本纯化的重组酶蛋白质直接引入真核细胞。典型地，位点特异性重组酶编码区将可操作地连接调节序列，该调节序列能够使位点特异性重组酶在真核生物细胞中表达。
“转座子跳跃引起的重组事件”或“转座酶介导的重组”意指被由3个元件一对DNA序列(转座子边界序列)和特异性酶(转座酶)组成的系统催化的重组事件。转座酶仅催化做为反向重复排列的两个转座子边界序列之间的重组反应。
可以利用大量不同的转座子/转座酶系统，包括但不限于Ds/Ac系统、Spm系统和Mu系统。这些系统来源于玉米，但是已经表明至少Ds/Ac和Spm系统在其它植物中也起作用用(Fedoroff等，1993，Schlappi等，1993，Van Sluys等，1987)。优选的是Ds-和Spm-型转座子，描述其分别有11bp和13bp的边界序列。
尽管转座子边界序列必需与待切除的DNA的末端连接，但是编码转座酶的基因可以位于其它地方。例如，重组酶基因可以已经存在真核生物DNA中或者可以由后来引入的DNA片段提供，该DNA片段可以通过交换或通过异体授粉或直接引入细胞中。作为可替代方案，例如，可以通过显微注射或粒子轰击将基本纯化的转座酶蛋白质直接引入细胞。
作为本发明的一部分，转座子边界序列包含在外源DNA序列中，这样它们位于所述DNA序列的外侧，并且将所述DNA转化进入转座子样实体，该转座子样实体可以通过转座酶作用移动。
因为转座子常常在宿主基因组的另一个位点重新整合，其中转座酶允许起作用的宿主的子代的分离对于分离含有，例如仅仅转座子足迹的转化宿主和仍然含有外源DNA的转化宿主可能是必要的。
在实施本发明时，优选地，如，例如通过细胞中重组酶蛋白质的表达，该蛋白质接触遗传因子的整合位点，并促进其中重组事件，在原始整合位点完整地切除遗传因子或者可替代地留下“足迹”，通常约20个核苷酸长或更长，来诱导遗传因子运动。可以通过标准核酸杂交和/或扩增技术以检测可动遗传因子或包含其的基因构建体的存在鉴定根据本发明方法产生的这些宿主和宿主部分。做为可替代方案，在可动遗传因子已经切除的转化的宿主细胞、组织和宿主的情况下，可以用这种技术检测切除事件后留下的宿主基因组中足迹。如这里所用术语“足迹”应该理解为指这里所述可动遗传因子或含该因子的基因构建体的任何衍生物，通过先前所述基因构建体转化的细胞基因组中可动遗传因子的切除、缺失或其它去除可以产生它。通常地，足迹包含至少用于促进切除的转座子或重组位点的单拷贝。然而，足迹可以包含来源于基因构建体的其它序列，例如，如果使用，来源于左边界序列、右边界序列、复制起点、重组酶编码序列或转座酶编码序列的核苷酸序列，或其它载体来源的核苷酸序列。因此，根据所用基因构建体重组基因座或转座子的核苷酸序列，如，例如与lox位点或frt位点对应或互补的核苷酸序列，可鉴定足迹。
术语“细胞周期”意指与细胞生长和分裂有关，特别是与DNA复制和有丝分裂的调节有关的周期性生物化学和结构事件。细胞周期包括称为G0，间隔期1(G1)，DNA合成(S)，间隔期2(G2)和有丝分裂(M)的阶段。正常地，这4个阶段顺序出现，然而，细胞周期也包括修饰的周期，其中缺少一个或多个阶段，产生了修饰的细胞周期如，核内有丝分裂、acytokinesis、多倍性、多线性和核内再复制。
术语“细胞周期进程”指经过不同细胞周期阶段的过程。因此，术语“细胞周期进程速率”指穿过所述细胞周期阶段的速度或完成所述细胞周期阶段需要的时间跨度。
术语“双杂交测定法”意指以以下观察为基础的测定法，即，许多真核生物转录因子包含当物理分离(即，共价键的破坏)时不能实现靶基因表达的两个结构域，DNA结合结构域(DB)和激活结构域(AD)。能够与融合到DB的所述蛋白质的一种蛋白质和融合到AD的所述蛋白质的另一个蛋白质物理相互作用的两种蛋白质将重新结合转录因子的DB和AD结构域，引起靶基因表达。通常，酵母双杂交测定法中的靶基因是报道基因，如β-半乳糖苷酶基因。因此，可以通过测定报道基因产物的活性定量酵母双杂交测定中蛋白质伴侣间的相互作用(Bartel和Fields1997)。做为替代方案，可以利用包括例如，编码嵌合绿色荧光蛋白的报道基因的哺乳动物双杂交系统(Shioda等，2000)。
而且，利用适合的计算机程序可以进行本发明蛋白质结构基序的折叠模拟和计算机再设计(Olszewski，Proteins 25(1996)，286-299；Hoffman，Comput.Appl.Biosci.1(1995)，675-679)。蛋白质折叠的计算机模拟可以用于详细肽和蛋白质模型的构象和能量分析(Monge，J.Mol.Biol.247(1995)，995-1012；Renouf，Adv.Exp.Med.Biol.376(1995)，37-45)。特别地，通过计算机辅助检索互补肽序列，适合的程序可以用于细胞分裂素氧化酶、它的配体或其它相互作用蛋白质的相互作用位点的鉴定(Fassina，Immunomethods 5(1994)，114-120)。而且，在背景技术中，例如在Berry，Biochem.Soc.Trans.22(1994)，1033-1036；Wodak，Ann，N.Y.Acac.Sci.501(1987)，1-13；Pabo，Biochemistry 25(1986)，5987-5991中描述了用于蛋白质和肽设计的适合的计算机系统。从上述计算机分析获得的结果可以用于例如本发明蛋白质或其片段的肽模拟物的制备。这种蛋白质天然氨基酸序列的假肽类似物可以非常有效地模拟亲本蛋白质(Benkirane，J.Biol.Chem.271(1996)，33218-33224)。例如，本发明蛋白质或其片段中容易得到的非手性Ω-氨基酸残基的掺入引起了脂肪族链聚亚甲基单元对氨基键的置换，因此提供了构建肽模拟物的方便策略(Banerjee，Biopolymers 39(1996)，769-777)。在背景技术中描述了其它系统中的小肽激素的超活性肽模拟类似物(Zhang，Biochem.Biophys.Res.Commun.224(1996)，327-331)。也可以通过连续胺烷基化合成肽模拟物组合文库，和检测由此得到化合物，例如它们的结合，激酶抑制和/或免疫特性鉴定本发明蛋白质适合的肽模拟物。在背景技术，例如在Ostresh，Methods inEnzymology 267(1996)，220-234和Dorner，Bioorg.Med.Chem.4(1996)，709-715中描述了肽模拟物组合文库产生的方法和用途。
而且，本发明蛋白质的三维和/或晶体结构可以用于本发明蛋白质生物活性肽模拟物抑制剂的设计(Rose，Biochemistry 35(1996)，12933-12944；Ruterber，Bioorg.Med.Chem.4(1996)，1545-1558)。
本发明方法中将获得或鉴定的化合物可以是能结合本发明任何核酸、肽或蛋白质的化合物。将鉴定的其它目的化合物是调节基因或本发明蛋白质表达的化合物，这样通过所述化合物的作用增加或降低所述基因或蛋白质的表达。做为替代方案，该化合物可以通过增加或降低任何本发明蛋白质的活性发挥它的作用。在此，优选的蛋白质是新的细胞分裂素氧化酶。
例如在样品，例如来源于植物、动物或微生物的细胞提取物中可以包含所述一种化合物或所述多种化合物。而且，所述化合物可以是本领域已知的，但是迄今为止不知道其具有抑制或激活细胞分裂素氧化酶相互作用蛋白质的能力。反应混合物可以是无细胞提取物或可以包含细胞或组织培养物。用于本发明方法的适合设备是本领域技术人员已知的，并且，一般地，在Alberts等，Molecular Biology of the Cell，第3版(1994)，特别是17章中进行了描述。多种化合物可以，例如添加到反应混合物、细胞培养基中或者注射进入细胞中。
如果在本发明方法中鉴定了含有化合物或多种化合物的样品，那么可以从鉴定含有能起拮抗剂(agonist)作用的化合物的原始样品分离化合物，或者如果，例如原始样品由多种不同化合物组成，人们可以进一步细分原始样品，以降低每个样品的不同物质的数量，并且利用原始样品的细分部分重复该方法。根据样品的复杂性，可以进行上述步骤几次，优选地，直到根据本发明方法鉴定的样品仅仅含有有限数量或仅仅含有一种物质为止。优选地，所述样品含有具有类似化学和/或物理特性的物质，最优选所述物质相同。优选地，根据上述方法鉴定的化合物或其衍生物被进一步制成适于植物育种或植物细胞或组织培养物中施用的形式。
术语“早期活力”指植物在早期发育期间快速生长的能力，涉及发芽后，发育良好的根系和发育良好的光合器官的成功建成。
术语“倒伏抗性”或“直立能力(standability)”指植物固定其自身到土壤的能力。对于直立或半直立生长习性的植物，该术语也指在逆境(环境)条件下维持直立位置的能力。该性状涉及根系大小、深度和形态学。
这里所用术语“嫁接”指两个不同植物部分连接在一起，这样它们结合在一起，并且汁液可以流动，由此形成了可以生长和发育的单个新植物。因此，嫁接包含两个部分(i)下部是这里提到的砧木(rootstock)，基本上由根系和部分茎组成，和(ii)上部即接穗或嫁接枝条，其产生了植物地上部分。
如这里所用，tblastn指比对工具，其是BLAST(基本局部比对搜索工具)家族程序(http//www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)的一部分。BLAST目的是鉴定最佳局部对比的区域，即两个核酸或蛋白质序列的一些部分比对以检测仅共有分离的相似性区域的序列间的关系(Altschul等，1990)。在本发明中，利用BLAST 2.0程序包的tblastn，针对在所有读框中动态翻译的核苷酸序列数据库，比较玉米细胞分裂素氧化酶蛋白质序列(Altschul等，Nucleic Acids Res.253389-3402(1997)).
给出下面实施例用于举例说明本发明而非限制。这里，如同详尽阐述一样，并入包含在该申请中所有文献为参考文献。
实施例
实施例1 本发明序列的简要说明SEQ ID NO 说明1 AtCKX1基因组的2 AtCKX1蛋白质3 AtCKX2基因组的4 AtCKX2蛋白质5 AtCKX3基因组的6 AtCKX3蛋白质7 AtCKX4基因组的8 AtCKX4蛋白质9 AtCKX5基因组的(短的形式)10 AtCKX5蛋白质(短的形式)11 AtCKX6基因组的12 AtCKX6蛋白质13 5’引物AtCKX114 3’引物AtCKX1 15 5’引物AtCKX2 16 3’引物AtCKX2 17 5’引物AtCKX3 18 3’引物AtCKX3 19 5’引物AtCKX4 20 3’引物AtCKX4 21 5’引物AtCKX5 22 3’引物AtCKX5 23 5’引物AtCKX6 24 3’引物AtCKX6 25 AtCKX1 cDNA 26 AtCKX2 cDNA 27 AtCKX3 cDNA 28 AtCKX4 cDNA 29 AtCKX5 cDNA(短的形式) 30 AtCKX6 cDNA 31 AtCKX2 cDNA片段 32 AtCKX2肽片段 33 AtCKX5基因组的(长的形式) 34 AtCKX5 cDNA(长的形式) 35 AtCKX5蛋白质(长的形式) 36 根clavata同系物启动子
实施例2.拟南芥(Arabidopsis thaliana)的候选细胞分裂素氧化酶编码基因的鉴定
鉴定与玉米细胞分裂素氧化酶基因(Morris等，Biochem BiophysRes Comm 255328-333，1999；Houda-Herin等.Plant J 17615-626；WO99/06571)具有序列相似性的拟南芥(Arabidopsis thaliana)的6种不同基因。利用tblastn程序，通过用玉米蛋白质序列筛选公共基因组数据库核苷酸序列的6个读框翻译物，发现这些基因。将这序列命名为拟南芥(Arabidopsis thaliana)细胞分裂素氧化酶样基因或AtCKX。将它们随意地编号为AtCKX1到AtCKX6。下面的列表概述了这些基因的信息。标示了预测的ORF边界和蛋白质序列，以近似说明拟南芥(Arabidopsi)和玉米细胞分裂素氧化酶之间，以及不同拟南芥(Arabidopsi)细胞分裂素氧化酶之间的蛋白质序列差异。不应该将所示ORF边界和蛋白质序列当做这些AtCKX基因作用方式的结论性证据。利用了DNAstar的程序MegAlign进行DNA和蛋白质序列比较。这个程序利用Clustal方法进行比对。对于蛋白质和cDNA序列的多序列比对，空位罚值(gap penalty)和空位长度罚值(gap length penalty)设为每次10。对于蛋白质的成对序列比对，参数如下Ktuple为1；空位罚值3；视窗5；diagonals saved为5。对于cDNA的成对序列比对，参数如下Ktuple为2；空位罚值5；视窗4；diagonals saved为4。蛋白质比对的相似性组是(M，I，L，V)，(F，W，Y)，(G，A)，(S，T)，(R，K，H)，(E，D)，(N，Q)。在拟南芥(Arabidopsis)cDNA和蛋白质序列之间标出的值代表用所有组合发现的最低和最高值。
A.基因名称AtCKX1(拟南芥(Arabidopsis thaliana)细胞分裂素氧化酶样蛋白质1 SEQ ID NO1)
数据库中的位置(记录号，bac上位置)AC002510，拟南芥(Arabidopsisthaliana)染色体II，完整序列255的225部分。序列来源于克隆T32G6。数据库中预测的ORF
15517..16183，16415..16542，16631..16891，16995..17257，17344..17752
AtCKX1 cDNA序列列为SEQ ID NO25。
预测的蛋白质序列SEQ ID NO2
同源性
与玉米(Z.mays)cDNA的％同一性
31.5％(Dnastar/MegAlign-Clustal方法)
与玉米(Z.mays)蛋白质的％相似性
32.2％(Dnastar/MegAlign-Clustal方法)
与其它拟南芥(Arabidopsis)cDNA的％同一性(范围)
38.2％(AtCKX2)54.1％(AtCKX6)(Dnastar/MegAlign-Clustal方法)
与其它拟南芥(Arabidopsis)蛋白质的％相似性(范围)
37.1％(AtCKX2)58.1％(AtCKX6)(Dnastar/MegAlign-Clustal方法)
B.基因名称AtCKX2(拟南芥(Arabidopsis thaliana)细胞分裂素氧化酶样蛋白质2，SEQ ID NO3)
数据库中的位置(记录号，bac上位置)AC005917，拟南芥(Arabidopsisthaliana)染色体II，完整序列255的133部分。序列来源于克隆F27F23，F3P11。
数据库中预测的ORF
互补序列，40721..41012，41054..41364，41513..41770，42535..42662，43153..43711
注意利用基因预测程序NetPlantGene(http//www.cbs.dtu.dk/services/NetGene2/)，本发明人鉴定的cDNA序列不同于数据库中注释的cDNA序列。根据新的cDNA序列，修正了数据库中预测的ORF
互补序列，40721..41012，41095..41364，41513..41770，42535..42662，43153..43711
该cDNA编码的蛋白质序列列为SEQ ID NO4。用一步RT-PCR试剂盒(Qiagen，Hilden，德国)，通过RT-PCR从AtCKX2转基因植物组织的总RNA克隆AtCKX2T的cDNA，并且利用ABI PRISM Big Dye终止子循环测序反应试剂盒(Perkin Elmer Applied Biosystems Division)测序。证实了本发明人鉴定和预测的cDNA序列是正确的。此新的AtCKX2 cDNA列出为SEQ ID NO26。对应于AtCKX2 cDNA核苷酸1171到1254的84-bp片段列出为SEQ ID NO31。该84-bp cDNA序列的对应的肽序列列出为SEQ ID NO32。
同源性
与玉米(Z.mays)cDNA的％同一性
38.4％(Dnastar/MegAlign-Clustal方法)
与玉米(Z.mays)蛋白质的％相似性
37.5％(Dnastar/MegALIgn Clustal方法)
与其它拟南芥(Arabidopsis)cDNA的％同一性(范围)
34.9％(AtCKX6)64.5％(AtCKX4)(Dnastar/MegAlign-Clustal方法)
与其它拟南芥(Arabidopsis)蛋白质的％相似性(范围)
36.5％(AtCKX6)66.1％(AtCKX4)(Dnastar/MegAlignClustal方法)
C.基因名称AtCKX3(拟南芥(Arabidopsis thaliana)细胞分裂素氧化酶样蛋白质3，SEQ ID NO5)
数据库中的位置(记录号，bac上位置)AB024035，拟南芥(Arabidopsisthaliana)基因组DNA，染色体5，P1克隆MHM17，完整序列。
数据库中没有ORF预测。
利用几个基因预测程序，包括GRAIL(ftp//arthur.epm.ornl.gov/pub/xgrail)，Genscan(http//CCR-081.mit.edu/GENSCAN html)和NetPlantGene(http//www.cbs.dtu.dk/services/NetGene2/)，本发明人鉴定了该基因
互补序列，29415..29718，29813..30081，30183..30443，30529..30656，32107..32716
本发明人鉴定的新AtCKX3 cDNA序列列出为SEQ ID NO27。基于自己ORF预测，预测的蛋白质序列SEQ ID NO6。
同源性
与玉米(Z.mays)cDNA的％同一性
38.7％(Dnastar/MegAlign Clustal方法)
与玉米(Z.mays)蛋白质的％相似性
39.2％(Dnastar/MegAlign Clustal方法)
与其它拟南芥(Arabidopsis)cDNA的％同一性(范围)
38.8％(AtCKX6)51.0％(AtCKX2)(Dnastar/MegAlignClustal方法)
与其它拟南芥(Arabidopsis)蛋白质的％相似性(范围)
39.9％(AtCKX6)46.7％(AtCKX2)(Dnastar/MegAlignClustal方法)
D.基因名称AtCKX4(拟南芥(Arabidopsis thaliana)细胞分裂素氧化酶样蛋白质4，SEQ ID NO7)
数据库中的位置(记录号，bac上位置)
1)AL079344，拟南芥(Arabidopsis thaliana)DNA染色体4，BAC克隆T16L4(ESSA工程)
2)AL161575，拟南芥(Arabidopsis thaliana)DNA染色体4，毗连序列群片段号71。
数据库中预测的ORF
1)76187..76814，77189..77316，77823..78080，78318..78586，78677..78968
2)101002..101629，102004..102131，102638..102895，103133..103401，103492..103783
AtCKX4 cDNA序列列出为SEQ ID NO28。
预测的蛋白质序列SEQ ID NO8
同源性
与玉米(Z.mays)cDNA的％同一性
41.0％(Dnastar/MegAlign-Clustal方法)
与玉米(Z.mays)蛋白质的％相似性
41.0％(Dnastar/MegAlign-Clustal方法)
与其它拟南芥(Arabidopsis)cDNA的％同一性(范围)
35.2％(AtCKX6)64.5％(AtCKX2)(Dnastar/MegAlign-Clustal方法)
与其它拟南芥(Arabidopsis)蛋白质的％相似性(范围)
35.1％(AtCKX6)66.1％(AtCKX2)(Dnastar/MegAlign-Clustal方法)
E.基因名称AtCKX5(拟南芥(Arabidopsis thaliana)细胞分裂素氧化酶样蛋白质5，SEQ ID NO9)
数据库中的位置(记录号，bac上位置)AC023754，F1B16，完整序列，染色体1
数据库中没有ORF预测
利用几种基因预测程序，包括GRAIL(ftp//arthur.epm.ornl.gov/pub/xgrail)，Genscan(http//CCR-081.mit.edu/GEN SCAN.html)和NetPlantGene(http//www.cbs.dtu.dk/services/NetGene2/)，本发明人鉴定了该基因。
43756..44347，44435..44562，44700..44966，45493..45755，46200..46560
本发明人鉴定和预测的新AtCKX5 cDNA序列列出为SEQ ID NO29。该cDNA预测的蛋白质序列列出为SEQ ID NO10。在基因组序列更上游9个核苷酸处，存在第二个可能的ATG起始密码子。不清楚这2个起始密码子中哪个密码子编码蛋白质第一个氨基酸。因此，在本发明中，也将在该上游起始密码子起始的第二个可能AtCKX5 cDNA列出为SEQ ID NO34。相应基因组序列列出为SEQ ID NO33，编码的蛋白质列出为SEQ IDNO35。
同源性
与玉米(Z.mays)cDNA的％同一性
39.1％(Dnastar/MegAlign-Clustal方法)
与玉米(Z.mays)蛋白质的％相似性
36.6％(Dnastar/MegAlign-Clustal方法)
与其它拟南芥(Arabidopsis)cDNA的％同一性(范围)
40.1％(AtCKX2)44.0％(AtCKX3)(Dnastar/MegAlign-Clustal方法)
与其它拟南芥(Arabidopsis)蛋白质的％相似性(范围)
41.6％(AtCKX4)46.4％(AtCKX6)(Dnastar/MegAlign-Clustal方法)
F.基因名称AtCKX6(拟南芥(Arabidopsis thaliana)细胞分裂素氧化酶样蛋白质6，SEQ ID NO11)
数据库中的位置(记录号，bac上位置)AL163818，拟南芥(Arabidopsisthaliana)DNA染色体3，P1克隆MAA21(ESSA工程)。
数据库中预测的ORF
46630..47215，47343..47470，47591..47806，47899..48161，48244..48565
AtCKX6 cDNA序列列出为SEQ ID NO30。
预测的蛋白质序列SEQ ID NO12
同源性
与玉米(Z.mays)cDNA的％同一性
37.3％(Dnastar/MegAlign-Clustal方法)
与玉米(Z.mays)蛋白质的％相似性
36.1％(Dnastar/MegAlign-Clustal方法)
与其它拟南芥(Arabidopsis)cDNA的％同一性(范围)
34.9％(AtCKX2)54.1％(AtCKX1)(Dnastar/MegAlign-Clustal方法)
与其它拟南芥(Arabidopsis)蛋白质的％相似性(范围)
35.1％(AtCKX4)58.1％(AtCKX1)(Dnastar/MegAlign-Clustal方法)
在数据库中基因AtCKX3和AtCKX5没有注释为推定的细胞分裂素氧化酶，并且没有给出这些基因的ORFs。而且，预测的AtCKX2的ORF(和由此的蛋白质结构)不同于我们自己的预测，并且通过测序AtCKX2 cDNA证实了我们的预测。
图1中示出了拟南芥(Arabidopsis)AtCKX基因1到4和玉米CKX基因的基因结构比较。
拟南芥(Arabidopsis)AtCKX基因编码的预测的蛋白质显示了与玉米蛋白质32％到41％之间的相似性，而它们相互之间显示了35％到66％之间的序列相似性。因为该降低的序列保守性，事先不清楚是否拟南芥(Arabidopsis)AtCKX基因编码具有细胞分裂素氧化酶活性的蛋白质。在图2中示出了拟南芥(Arabidopsis)AtCKX预测的蛋白质1到4和玉米CKX基因的比对。
实施例3.过量表达AtCKX1的转基因植物显示了增加的细胞分裂素氧化酶活性和改变的植物形态学
1.克隆方法的说明
利用下面引物从拟南芥(Arabidopsis thaliana)，登录名ColumbiaPCR扩增AtCKX1基因(用于克隆的非同源序列为小写字母)，
5’引物的序列cggtcgacATGGGATTGACCTCATCCTTACG(SEQ ID NO13)
3’引物的序列gcgtcgacTTATACAGTTCTAGGTTTCGGCAGTAT(SEQ ID NO14)
在pUC19的SalI位点插入通过这些引物扩增的2235-bp PCR片段。测序该插入，并且证实PCR扩增产物不含有任何突变。在双元载体pBinHyg-Tx(Gatz等，1992)修饰的CaMV 35S启动子(带有3个四环素操纵基因序列)下游SalI位点中亚克隆该载体的SalI/SalI片段。通过农杆菌介导的转化，利用标准的转化方法，将由此得到的构建体引入烟草和拟南芥(Arabidopsis thaliana)。
2.转基因株系的分子分析
鉴定了以高水平合成AtCKX1转录物的几个转基因株系(图3)。表达AtCKX1转录物的转基因株系也显示了增加的细胞分裂素氧化酶活性，其中如所述(Motyka等，1996)，通过基于[2-3H]iP到腺嘌呤转化的细胞分裂素氧化酶活性的标准测定法测定所述活性。在表6中示例了2株烟草和2株拟南芥(Arabidopsis)株系。该结果证明AtCKX1基因编码具有细胞分裂素氧化酶活性的蛋白质。
表6.在AtCKX1转基因植物组织中细胞分裂素氧化酶活性叶片试样植物物种 植物株系 细胞分裂素氧化酶活性 (nmol Ade/mg蛋白质.h)拟南芥(Arabidopsis) Col-0野生型 0.009 CKX1-11 0.024 CKX1-22 0.026 CKX1-22 0.027烟草 SNN野生型 0.004 CKX1-SNN-8 0.016 CKX1-SNN-28 0.021
3.转基因株系的表型描述
3.1在烟草中
该植物具有降低顶端优势(图7A，B和C)和增加的根生长(图8)的矮化表型。
表型的5种分类
1)强的2个克隆
2)中等的3个克隆
3)弱的4个克隆
4)具有大花序的高大植物(如同WT(野生型))-5个克隆
5)与WT相似，9个克隆
高度(参见图7B和C)
-WT100-150cm之间
-弱的约75cm
-中等的约40-45cm(主茎约25cm，但是过分生长侧枝)
-强的约10cm
转基因植物AtCKX1-48和AtCKX1-50显示了强的表型。下面是与WT植物比较的茎伸长测定值株系野生型AtCKX1-48AtCKX1-50发芽后的天数高度(cm)高度(cm)高度(cm)479.5±0.51.3±0.31.2±0.25822.4±2.32.2±0.32.3±0.36835.3±2.63.1±0.52.6±0.5100113.3±9.87.1±0.84.8±0.9117138.6±8.18.7±0.76.6±0.9131139.0±9.39.3±0.78.6±1.0152136.6±10.410.9±1.110.0±1.016511.8±1.911.4±1.418116.5±1.714.9±1.219819.5±1.518.1±1.3
实验植物在温室土壤中生长。从每个株系至少10株植物收集数据。
叶(参见图7D和E)
AtCKX1转基因表达子的叶形状是披针形(较长而窄)成熟叶片的宽长比率从野生型植物的1∶2下降到AtCKX1转基因植物中的1∶3(图7E)。与野生型比较，叶数量和叶表面积减少了(参见图7D)。也注意到叶片衰老进程的显著差异。在WT烟草中，在最基部叶中开始叶衰老，并且引起叶片色素的均匀减少(图7E)。相反，强表达AtCKX1的植物衰老叶片沿着叶脉保持绿色，在脉间区域中变黄，表明改变的叶片衰老。老叶片的质地是更刚性。
根
通过形成密集的更多根(强的)(图8A)的能力和通过形成沿着茎的气生根，体外生长的高度表达所述基因的植物容易和WT相区分。
如图8C中示例的AtCKX1-50过量表达的幼苗，初生根更长，侧和不定根的数量更多(也参见实施例9)
外源细胞分裂素对根生长抑制的剂量-应答曲线表明转基因幼苗的根比WT根更具有细胞分裂素抗性(图8D)。AtCKX1转基因植物对iPR抗性不如AtCKX2转基因植物对iPR的抗性显著，这与后者iP型细胞分裂素较小的改变一致(参见表10)。
尽管地上植物部分生长高度地减少，但是观察到了生长在土壤中成熟植物根生物量的大量增加(参见图8B生长在土壤中4到5个月的植物)。
节间距
·中等表型与WT植物中花序下第5和第9节间距长度分别是5cm和2cm比较，花序下第5节间距约是2.5cm长，第9节间距约是0.5cm长。
·强的表型植物AtCKX1-50，在萌芽后131天测定的从底部起第20节间距长度是1.3±0.4mm，而相比之下WT是39.2±3.8mm。
顶端优势和分支
形成了更多侧枝，表明与WT比较，营养生长期间顶端优势减少(参见图9)。侧枝生长超过主茎，对于中等AtCKX1表达子，达到40-45cm高度。甚至出现次生枝。然而，芽没有从顶端优势完全释放，即，侧枝条不真正继续发育。减少的顶端优势可能是由于较小枝条顶端分生组织的植物生长素产生减少引起的(参见实施例10)。
繁殖发育
AtCKX1转基因植物中开花的开始被建迟，花数和每个蒴果(capsule)的种子产量降低。转基因植物中花的大小没有改变，并且单个种子重量与野生型植物种子的重量相当。下面概述了两个代表性AtCKX1转基因植物的数据
A.开花的开始株系野生型AtCKX1-48AtCKX1-50开花时间(DAG)106.2±3.3193.3±4.3191.8±3.8
实验每个株系至少10株植物收集数据。第一朵花的充分伸展定义为开花的开始。DAG＝发芽后的天数
B.每株植物的种子蒴果数株系野生型 AtCKX1-48 AtCKX1-50蒴果数83.33±5.13 2.00±1.00 2.60±1.67
实验至少从5个不同植物测定种子蒴果数。注意这些植物生长在冬季的温室条件下。这不利地影响形成的花数，特别是转基因克隆中形成的花数。然而，它们形成减少数量的花的基本概念是正确的。n.d.，没有测定。
C.种子产量/蒴果(mg)株系野生型AtCKX1-48 AtCKX1-50种子/蒴果(mg)87.41±28.7523.83±13.36 61.8±40.66
实验测定至少12个种子蒴果的种子产量。种子蒴果大小是变化很大的，因此标准差较大。n.d.，没有测定。
D.100粒种子的重量(mg)株系野生型 AtCKX1-48 AtCKX1-50种子重量(mg)9.73±0.44 10.70±1.60 9.54±0.94
实验种子生物量测定为至少5个不同种子蒴果的100粒种子重量。n.d.，没有测定。
3.2在拟南芥(Arabidopsis)中
-发芽开始与WT相同
-总的根系扩大，侧根和不定根数增加(参见图4A到D)。
-地上器官生长减弱，导致了矮化的表型(参见图4E和F)，叶生物量降低。叶片和花形成延迟。
-与WT相比生命周期变长，与WT比较，种子产量降低。
下面形态测定数据举例说明了这些表型
根发育
A.根系的总长株系野生型AtCKX1-11AtCKX1-15长度(mm)32.576.568.4
B.初生根长度株系野生型AtCKX1-11AtCKX1-15长度(mm)32.3±3.852.3±4.839.9±4.2
C.侧根(LR)长度株系野生型AtCKX1-11AtCKX1-15长度(mm)0.2±0.415.6±11.010.4±7.6
D.不定根长度株系野生型AtCKX1-11AtCKX1-15长度(mm)0.03±0.188.6±8.519.1±11.0
E.侧根(LR)数量株系野生型AtCKX1-11AtCKX1-15LR数量0.3±0.510.4±5.42.6±1.1
F.不定根(AR)数量株系野生型AtCKX1-11AtCKX1-15AR数量0.03±0.181.6±1.12.6±1.1
实验对在体外MS培养基上发芽后8天的植物上进行测定。对每个株系至少17株植物进行评分。
枝条发育
A.叶面积株系野生型AtCKX1-11-7T3纯合植物AtCKX1-11-12T3纯合植物AtCKX1-15-1T3纯合植物叶面积(cm2)21.16±1.732.28±0.582.62±0.281.66±0.22
实验测定发芽后30天后形成的主莲座叶片的叶面积。对每个克隆分析3株植物。
繁殖发育
开花的开始株系野生型AtCKX1-11T3杂合植物AtCKX2-2T2杂合植物AtCKX2-5T2杂合植物开花时间(DAG)43.6±5.869.7±9.451.2±4.145.1±6.9
实验植物在温室条件下生长。对每个克隆分析了至少13株植物。
DAG＝发芽后的天数。
结论AtCKX1转基因拟南芥(Arabidopsis)植物的分析基本上证实了从烟草获得的结果，并且显示了降低细胞分裂素含量的结果的一般特性。总根系扩大(在AtCKX1转基因植物中总根长增加约110-140％)，枝条发育更慢(延迟了开花)，并且叶生物量降低。转基因植物中种子的产量也降低。
实施例4.过量表达AtCKX2的转基因植物显示了细胞分裂素氧化酶活性增加和植物形态学上的改变
1.克隆方法的说明
利用下面的引物从拟南芥(Arabidopsis thaliana)，登录名Columbia PCR扩增AtCKX2基因(用于克隆的非同源序列为小写字母)
5’引物的序列gcggtaccAGAGAGAGAAACATAAACAAATGGC(SEQ ID NO15)
3’引物的序列gcggtaccCAATTTTACTTCCACCAAAATGC(SEQ ID NO16)。
在pUC19的KpnI位点中插入由这些引物扩增的3104-bp PCR片段。测序该插入以检查通过PCR方法没有引入不同于公开的序列的差异。在双元载体pBinHyg-Tx(Gatz等，1992)中修饰的CaMV 35S启动子(带有3个四环素操纵基因序列)下游的KpnI位点亚克隆该载体的KpnI/KpnI片段。利用标准转化方法，通过农杆菌属(Agrobacterium)介导的转化，将由此得到的构建体引入烟草和拟南芥(Arabidopsis thaliana)。
2.转基因株系的分子分析
鉴定了高水平合成AtCKX2转录物的几个转基因株系(图6)。表达AtCKX2转录物的转基因株系也显示了增加的细胞分裂素氧化酶活性。在表7中示例了2株烟草和3株拟南芥(Arabidopsis)株系。该结果证明AtCKX2基因编码具有细胞分裂素氧化酶活性的蛋白质。
表7.AtCKX2转基因植物组织中细胞分裂素氧化酶活性样品植物物种和组织 植物株系 细胞分裂素氧化酶活性 (nmol Ade/mg蛋白质.h)拟南芥(Arabidopsis)愈伤组织 Col-0野生型 0.037 CKX2-15 0.351 CKX2-17 0.380 CKX2-55 0.265烟草叶 SNN野生型 0.009 CKX2-SNN-18 0.091 CKX2-SNN-19 0.091
3.转基因株系的表型描述
3.1在烟草中(参见图7到10)
3类表型
1)强的15个克隆(与AtCKX1的中等表型相似)
2)弱的6个克隆
3)其它与WT植物相似，7个克隆
地上植物部分
除了一些一般性微小的定量差异，即在AtCKX1转基因植物中比AtCKX2转基因植物中矮化特征更严重外，关于植物高度、节间距、分支、叶形成和黄化的观察结果与AtCKX1转基因植物相似(在图7A和B中比较AtCKX1植物和AtCKX2植物)。下面示例了具有强表型克隆AtCKX2-38和AtCKX2-40的茎伸长和节间距测量值。
茎伸长株系野生型AtCKX2-38AtCKX2-40发芽后天数高度(cm)高度(cm)高度(cm)479.5±0.52.4±0.12.6±0.25822.4±2.35.5±0.75.3±0.56835.3±2.67.1±0.87.0±0.7100113.3±9.815.5±2.520.3±6.4117138.6±8.119.8±3.829.5±6.0131139.0±9.326.5±7.033.4±5.8152136.6±10.433.7±6.333.9±6.416536.2±4.3
实验植物生长在温室的土壤中。从至少每个株系的10株植物收集数据。
节间距株系野生型AtCKX2-38节间距(mm)39.2±3.87.2±1.6
实验发芽后131天测定从下部起的第20节间距的长度。
根
通过形成密集的更多根(强的)的能力和通过形成沿着茎的气生根，体外生长的高度表达所述基因的植物容易和WT相区分。
如图8C中所示例的AtCKX2-38过量表达的幼苗，初生根更长，侧根和不定根的数量更多(也参见实施例9)。
外源细胞分裂素对根生长抑制剂的量-应答曲线表明转基因幼苗的根比WT根更具有细胞分裂素抗性(图8D)。AtCKX1-28转基因植物对iPR的抗性不如AtCKX2-38对iPR的抗性显著，这与后者中iP型细胞分裂素较小改变一致(参见表10)。
与WT比较，从生长在土壤中的植物观察到，AtCKX2转基因植物T0株系根生物量鲜重和干重增加，如下表所示株系野生型AtCKX2(T0)鲜重(g)45.2±15.477.1±21.3干重(g)6.3±1.98.6±2.2
试验在土壤中生长6株WT植物和6株35S::AtCKX2克隆的独立T0株系。开花后，用水冲洗根系，尽可能地除去土壤，称量其鲜重和干重。与WT比较，也观察到水培法中生长的AtCKX2转基因植物F1子代的根生物量鲜重和干重的增加，如下表中所示
株系野生型AtCKX2-38AtCKX2-40根鲜重(g)19.76±6.7933.38±7.7650.04±15.59根干重(g)2.36±0.432.61±0.393.52±1.06枝条鲜重(g)159.8±44.5333.66±2.6748.84±11.83根冠鲜重比8.24±0.631.04±0.181.08±0.51
实验发芽后60天，将土壤生长的植物转移到水培系统(Hoagland溶液)，并且生长另外60天。水培溶液连续通气，每隔3天用新鲜溶液置换。
总之，水培溶液中生长的转基因植物比野生型植物多形成约65-150％的根生物量(鲜重)。干重增加10-50％。这种差异部分可能是由于转基因植物较大的细胞体积引起的。这减少了形成大部分干物质材料的细胞壁的相对比例。枝条生物量减少到野生枝条的20％-70％。鲜重的差异引起了根冠比的改变，其在野生型中约是8，而在转基因克隆中约是1。
结论
尽管地上植物部分生长减少，但是观察到与WT对照比较，生长在不同条件下的AtCKX2转基因幼苗和成熟植物的根生长和生物量的增加。观察到不同转基因植物之间的量差异观察到最强表达克隆的根生物量增加更大。
繁殖发育
AtCKX2转基因植物中开花的开始延迟，花数和每个蒴果的种子产量降低。这些结果与在AtCKX1转基因植物中观察到的结果非常相似，但是在AtCKX2转基因植物中它们较不显著，如下表中所示。转基因植物中花的大小没有改变。每个种子的重量可与野生型植物种子的重量相比。
A.开花的开始
株系野生型AtCKX1-48AtCKX1-50AtCKX2-38AtCKX2-40开花时间(DAG)106.2±3.3193.3±4.3191.8±3.8140.6±6.5121.9±9.8
实验每个株系收集至少10株植物的数据。定义第一朵花的充分伸展为开花的开始。DAG＝发芽后的天数
B.每株植物的种子蒴果数株系野生型 AtCKX1-48 AtCKX1-50AtCKX2-38 AtCKX2-40蒴果数83.33±5.13 2.00±1.00 2.60±1.674.30±2.58 n.d.
实验测定至少5株不同植物的种子蒴果数。注意这些植物生长在冬季温室条件下。这不利地影响了形成的花数，特别是转基因克隆中形成的花数。然而，它们形成减少数量的花的基本基本概念是正确的。n.d.，没有测定。
C.种子产量/蒴果(mg)株系野生型 AtCKX1-48 AtCKX1-50 AtCKX2-38 AtCKX2-40种子/蒴果(mg)87.41±28.75 23.83±13.36 61.8±40.66 46.98±29.30 n.d.
实验测定至少12个种子蒴果的种子产量。种子蒴果大小是非常可变的，因此标准偏差大。
D.100粒种子的重量(mg)株系野生型AtCKX1-48 AtCKX1-50 AtCKX2-38 AtCKX2-40种子重量(mg)9.73±0.4410.70±1.60 9.54±0.94 10.16±0.47 n.d.
实验测定种子生物量为至少5个不同种子蒴果的100粒种子的重量。n.d.，没有测定。
3.2在拟南芥(Arabidopsis)中
获得了AtCKX2转基因植物的下面形态测量数据
根发育
A.根系总长株系野生型AtCKX2-2AtCKX2-5长度(mm)32.550.648.5
B.初生根长度株系野生型AtCKX2-2AtCKX2-5长度(mm)32.3±3.830.7±4.831.6±6.8
C.侧根长度株系野生型AtCKX2-2AtCKX2-5长度(mm)0.2±0.45.5±9.01.9±2.5
D.不定根长度株系野生型AtCKX2-2AtCKX2-5长度(mm)0.03±0.1814.4±10.214.9±9.1
E.侧根(LR)数株系野生型AtCKX2-2AtCKX2-5LR数0.3±0.52.9±2.31.9±1.0
F.不定根(AR)数株系野生型AtCKX2-2AtCKX2-5AR数0.03±0.181.8±0.91.8±1.0
实验对体外MS培养基上发芽后8天的植物进行测定。每个株系评分至少17株植物。
枝条发育
叶面积株系野生型AtCKX2-2T2杂合植物AtCKX2-5T2杂合植物AtCKX2-9T2杂合植物叶面积(cm2)21.16±1.738.20±2.358.22±0.557.72±0.85
实验测定发芽后30天后形成的主莲座叶片的叶面积。每个克隆分析了3株植物。
繁殖发育
开花的开始株系野生型AtCKX1-11T3杂合植物AtCKX2-2T2杂合植物AtCKX2-5T2杂合植物开花时间(DAG)43.6±5.869.7±9.451.2±4.145.1±6.9
实验植物在温室条件下生长。每个克隆分析了至少13株植物。DAG＝发芽后的天数。
结论拟南芥(Arabidopsis)AtCKX2转基因植物有与AtCKX1转基因植物相似的降低的叶片生物量和矮化的表型(比较图5和图4F)。在AtCKX2转基因拟南芥(Arabidopsis)中也扩大了总根系。在AtCKX2转基因植物中总根长增加了约50％。AtCKX1转基因植物有更长的初生根，更多的侧根和形成更多的不定根。AtCKX2转基因植物缺乏初生根生长的增加，但是比WT形成了更多的侧根(side roots)和侧根(lateral roots)。
总结
观察到的AtCKX2转基因植物表型与AtCKX1转基因植物非常相似但是不同，接着其与烟草转基因植物获得的结果非常相似但不相同。这证实了在这两个植物物种中细胞分裂素含量减少的结果的一般特性，因此，在其它植物物种中也可以预期相似的表型。烟草和拟南芥(Arabidopsis)之间的主要不同是在AtCKX2过量表达的植物中缺乏初生根生长的增加。
实施例5.过量表达AtCKX3的转基因植物显示了增加的细胞分裂素氧化酶活性和改变的植物形态学
1.克隆方法的说明
利用下面引物从拟南芥(Arabidopsis thaliana)，登录名ColumbiaPCR扩增AtCKX3基因(用于克隆的非同源序列为小写字母)，
5’引物的序列gcggtaccTTCATTGATAAGAATCAAGCTATTCA(SEQ IDNO17)
3’引物的序列gcggtaccCAAAGTGGTGAGAACGACTAACA(SEQ ID NO18)在pBluescript的KpnI位点中插入该由PCR扩增产生的3397-bp PCR片段。测序该插入物以证实PCR产物与所述基因比较没有序列改变。在双元载体pBinHyg-Tx(Gatz等，1992)中修饰的CaMV 35S启动子(带有3个四环素操纵基因序列)下游的KpnI位点亚克隆该载体的KpnI/KpnI片段。利用标准转化方法，通过农杆菌(Agrobacterium)介导的转化，将由此得到的构建体引入烟草和拟南芥(Arabidopsis thaliana)。
2.转基因株系的分子分析
鉴定了高水平合成AtCKX3转录物的几株转基因烟草株系(图11A)。表达AtCKX3转录物的转基因烟草株系也显示了增加的细胞分裂素氧化酶活性。在表8中示例了3株植物。这证明AtCKX3基因编码具有细胞分裂素氧化酶活性的蛋白质。
表8.AtCKX4转基因植物组织中细胞分裂素氧化酶活性样品植物物种和组织 植物株系 细胞分裂素氧化酶活性 (nmol Ade/mg蛋白质.小时)烟草叶 SNN野生型 0.011 CKX3-SNN-3 0.049 CKX3-SNN-6 0.053 CKX3-SNN-21 0.05
3.植物表型分析
烟草和拟南芥(Arabidopsis)中AtCKX3基因过量表达产生的表型基本与表达AtCKX1和AtCKX2的植物表型相似，即，增加的生根和矮化。然而，烟草中AtCKX3基因的过量表达引起了比AtCKX2更强的表型。在这个意义上，AtCKX3过量表达与AtCKX1过量表达更相似。
实施例6.过量表达AtCKX4的转基因植物显示了增加的细胞分裂素氧化酶活性和改变的植物形态学
1.克隆方法的说明
利用下面引物从拟南芥(Arabidopsis thaliana)，登录名ColumbiaPCR扩增AtCKX4基因(用于克隆的非同源序列为小写字母)，
5’引物的序列gcggtaccCCCATTAACCTACCCGTTTG(SEQ ID NO19)
3’引物的序列gcggtaccAGACGATGAACGTACTTGTCTGTA(SEQ ID NO20)
在pBluescript的KpnI位点中插入该PCR扩增产生的2890-bp PCR片段。测序该插入物以证实PCR产物与该基因比较没有序列改变。在双元载体pBinHyg-Tx(Gatz等，1992)中修饰的CaMV 35S启动子(带有3个四环素操纵基因序列)下游的KpnI位点亚克隆该载体的KpnI/KpnI片段。利用标准转化方法，通过农杆菌(Agrobacterium)介导的转化，将由此得到的构建体引入烟草和拟南芥(Arabidopsis thaliana)。
2.转基因株系的分子分析
鉴定了高水平合成AtCK4转录物的几株转基因烟草株系(图11B)。表达AtCKX4转录物的转基因株系也显示了增加的细胞分裂素氧化酶活性。在表9中示例了3株拟南芥(Arabidopsis)和3株烟草株系。该结果证明AtCKX4基因编码具有细胞分裂素氧化酶活性的蛋白质。
表9.AtCKX4转基因植物组织中细胞分裂素氧化酶活性样品植物物种和组织 植物株系 细胞分裂素氧化酶活性 (nmol Ade/mg蛋白质.h)拟南芥(Arabidopsis)愈伤组织 Col-0野生型 0.037 CKX4-37 0.244 CKX4-40 0.258 CKX4-41 0.320烟草叶 SNN野生型 0.011 CKX4-SNN-3 0.089 CKX4-SNN-18 0.085 CKX4-SNN-27 0.096
总的来说，数据表明用iP做为底物，4种细胞分裂素氧化酶的表观Km值范围是0.2到9.5μM，其进一步证明由AtCKX1到4编码的蛋白质确实是如这里所公开的细胞分裂素氧化酶。
3.植物表型分析
AtCKX4基因在烟草和拟南芥(Arabidopsis)中过量表达产生的表型基本上与表达AtCKX1和AtCKX2的植物的表型相似，即，增加的生根、减少的顶端优势、矮化和烟草老叶中脉间区域的黄化。在烟草中的另一个表型是披针形叶(改变的长和宽比率)。
过量表达AtCKX的烟草植物的一般观察结果
总的来说，表型分析证明AtCKX基因过量表达引起了烟草植物枝条和根系剧烈的发育改变，包括增加的根系发育和地上植物部分的矮化。如本文所公开的，也观察到其它的结果如改变的叶衰老，茎上不定根的形成等。不同基因的改变非常相似，但是不同。在烟草中，AtCKX1和AtCKX3过量表达植物相似，就象AtCKX2和AtCKX4类似一样。一般地，这前两者，特别是在枝条中，显示了性状的更高表达。因此，为了获得本发明实施方式中所述表型，特定细胞分裂素氧化酶基因可能是优选的。
实施例7.AtCKX5基因的克隆
利用下面引物，从登录名Columbia的拟南芥(Arabidopsisthaliana)PCR扩增AtCKX5基因(用于克隆的非同源序列为小写字母)
5’引物的序列ggggtaccTTGATGAATCGTGAAATGAC(SEQ ID NO21)
3’引物的序列ggggtaccCTTTCCTCTTGGTTTGTCCTGT(SEQ ID NO22)
5’引物序列包含AtCKX5蛋白质两个可能的起始密码子，最可能的
5’起始密码子以下划线表示，第二ATG密码子以斜体表示。
该PCR扩增产生的2843-bp PCR片段做为平端产物插入pCR-BluntII-TOPO克隆载体(Invitrogen)中。
实施例8.AtCKX6基因的克隆
利用下面引物，从登录名Columbia的拟南芥(Arabidopsisthaliana)PCR扩增AtCKX6基因(用于克隆的非同源序列为小写字母)
5’引物的序列gctctagaTCAGGGAAAAGAACCATGCTTATAG(SEQ ID NO23)
3’引物的序列gctctagaTCATGAGTATGAGACTGCCTTTTG(SEQ ID NO24)
该PCR扩增产生的1949-bp PCR片段做为平端产物插入pCR-BluntII-TOPO克隆载体(Invitrogen)中。
实施例9.烟草幼苗的生长测定证明了AtCKX转基因植物的早期活力
在体外，在MS培养基上播种过量表达AtCKX1-50和AtCKX2-38的转基因植物和WT烟草的种子，冷处理后放到培养室4天，6天后发芽。发芽后10天对幼苗生长进行观察(也参见图8C)，概述如下。每个克隆评分至少20个个体。在2个其它试验中已经获得了相似的数据。
A.根系的总长株系野生型AtCKX1-50AtCKX2-38长度(mm)61.1122.0106.5
B.初生根长度株系野生型AtCKX1-50AtCKX2-38长度(mm)32.3±2.650.8±4.552.4±4.8
C.侧根长度株系野生型AtCKX1-50AtCKX2-38长度(mm)9.8±5.518.0±8.113.0±6.0
D.不定根长度株系野生型AtCKX1-50AtCKX2-38长度(mm)19.0±5.053.0±12.042.0±9.8
E.侧根(LR)数株系野生型AtCKX1-50AtCKX2-38LR数1.9±0.96.5±2.25.6±2.0
F.不定根(AR)数株系野生型AtCKX1-50AtCKX2-38AR数2.2±0.63.5±0.93.6±1.3
AtCKX1和AtCKX2植物，普遍的观察结果
发芽后10天，过量表达AtCKX1和AtCKX2的烟草植物幼苗比未转化的对照植物多60％的不定根和多3倍的侧根。初生根长度增加约70％。这和更多和更长的侧根和次生根一起引起了总根长70％-100％的增加。这些结果表明细胞分裂素氧化酶的过量表达增加了主根和不定根的生长和发育，引起了早期活力。
实施例10.过量表达AtCKX1的烟草植物中改变的植物形态学的组织学分析
不同组织的显微分析表明细胞数量和细胞形成速率的明显变化反映了AtCKX转基因植物中的形态学变化(参见图10)。尽管AtCKX1转基因植物枝条顶端分生组织(SAM)比野生型中的枝条顶端分生组织(SAM)小，并且较少数细胞占据侧生器官形成的中央区域和周围区域之间的空间，但是细胞具有相同的大小(图10A)。做为减少的细胞分裂素含量结果的减少的细胞数和SAM大小表明细胞分裂素在SAM增殖控制中有作用。在分化模式中没有显著的变化出现，表明SAM中分化区域的空间组织很大程度上独立于细胞数和局部细胞分裂素浓度。细胞分裂素过量表达植物中叶的总组织模式没有改变。然而，韧皮部和木质部的大小显著地减小(图10B)。相反，叶片薄壁组织和表皮细胞的平均细胞大小增加4到5倍(图10C，D)。AtCKX1转基因植物新的细胞以野生型叶3-4％速率形成，并且估计最终的叶细胞数是野生型的5-6％。这表明叶片中维持细胞分裂周期绝对需要细胞分裂素。花器官细胞大小或细胞形状都没有改变，并且野生型和AtCKX转基因植物中每个蒴果的种子产量相似。AtCKX1转基因植物根分生组织的细胞群扩大约4倍，并且在中和侧柱(columnella)中的细胞数增加(图10E，F)。由于所有类型根细胞直径的增加，最终的根直径增加了60％。除了常常在转基因的根中注意到皮层细胞第四层外，根径向模式在野生型和转基因植物中相同(图10G)。增加的细胞数和轻微降低的细胞长度表明根生长的增加是由于增加的进入细胞周期的细胞数，而不是增加的细胞生长引起的。在降低的细胞分裂素含量存在的情况下，根分生组织细胞离开分生组织并且开始伸长之前，它们必需进行额外的有丝分裂循环。因此从分生组织中退出被对细胞分裂素敏感的机理调节。明显地，细胞分裂素在根分生组织中有负的调节作用，并且野生型细胞分裂素浓度抑制最大根系的发育。因此，通过过量表达细胞分裂素氧化酶降低活性细胞分裂素的水平刺激根发育，与WT植物比较，其引起了具有更多侧根和不定根以及根大小上的增加。
实施例11.过量表达AtCKX1和AtCKX2的烟草植物具有降低的细胞分裂素含量
在检测的16种不同细胞分裂素代谢物中，最大的变化出现在AtCKX2过量表达子的iP型细胞分裂素中(表10)iP型细胞分裂素含量总的降低在表达AtCKX2的植物中比AtCKX1转基因植物中更显著。AtCKX1转基因植物在枝条中显示了较强的表型。不知道哪种细胞分裂素代谢物与分析的不同性状有关。可能不同细胞分裂素形式在各种发育过程中起不同的作用。注意到Z型细胞分裂素的改变较小，其可能是由于底物不同的可接近性或蛋白质的较低底物特异性引起的。各个转基因克隆中iP和Z代谢物的总含量是野生型的31％和63％之间。转基因植物中细胞分裂素O-葡糖苷的储藏库也降低了(表10)。转基因幼苗中N-葡糖苷和DHZ-型细胞分裂素的浓度非常低，并且没有改变或者仅仅微量地改变(未示出数据)。
表10.AtCKX转基因植物中细胞分裂素含量。如Faiss等，1997所述进行细胞分裂素提取、免疫纯化、HPLC分离和通过ELISA定量。分析每个克隆约100株2周龄幼苗的3个单独混合样品(2.5g/样品)。浓度是pmol x g鲜重-1。缩写iP，N6-(Δ2异戊烯基)腺嘌呤；iPR，N6-(Δ2异戊烯基)腺嘌呤核苷；iPRP，N6-(Δ2异戊烯基)腺嘌呤核苷5’-单磷酸；Z，反式-玉米素(ZR，玉米素核苷；ZRP，玉米素核苷5’-单磷酸；ZOG，玉米素O-葡糖苷；ZROG，玉米素核苷O-葡糖苷。
株系 WT AtCKX1-2 AtCKX1-28AtCKX2-38 AtCKX2-40
细胞分裂素
浓度 浓度 WT的％浓度 WT的％ 浓度 WT的％浓度 WT的％
代谢物
iP5.90±1.804.76±0.82814.94±2.62841.82±0.44312.85±0.6248
IPR 2.36±0.741.53±0.14650.75±0.27320.55±0.39230.89±0.0738
IPRP 3.32±0.730.87±0.26261.12±0.13340.80±0.48241.68±0.4551
Z 0.24±0.060.17±0.02710.22±0.03920.21±0.06880.22±0.0292
ZR0.60±0.130.32±0.12530.34±0.03570.34±0.15570.32±0.0553
ZRP 0.39±0.170.42±0.11107 0.28±0.15720.06±0.01150.17±0.0644
ZOG 0.46±0.200.32±0.09700.26±0.13570.20±0.07430.12±0.0226
ZROG 0.48±0.170.30±0.06630.47±0.02980.23±0.05480.30±0.1363
总计 13.75 8.69 638.38 614.21 316.55 48
实施例12.嫁接试验表明由于AtCKX过量表达引起的矮化和增加的根发育局限于转基因组织
为了研究细胞分裂素氧化酶过量表达的哪些表型效应局限于表达组织，即，是细胞或器官自主性状，进行嫁接试验。在AtCKX2转基因烟草和WT烟草之间进行交互嫁接。用在该试验中的转基因植物是AtCKX2-38，其显示了以根生长的增加和地上植物部分发育的减少为特征的强的表型。如实施例3到6所述，这是由烟草和拟南芥(arabidopsis)中细胞分裂素氧化酶过量表达引起的两种重要的表型。
当嫁接时，植物约15cm高，嫁接接合部约是土壤以上10cm。图12表示嫁接后15周的植物。主要的结果是(i)嫁接在转基因砧木上的WT接穗的地上表型与WT对照嫁接(＝WT砧木上WT接穗)相似。重要地，这表明AtCKX2转基因在砧木中的过量表达不诱导植物非转基因的地上部分的矮化(参见图12A)。转基因砧木根生长的改善被维持，表明AtCKX转基因植物根生长的改善是自主的，不依赖于AtCKX转基因枝条(图12C)。有趣地，嫁接在转基因砧木上的WT接穗看上去更健康，并且发育得更好。值得注意地，这些植物中基叶的衰老延迟(参见图12A)；(ii)嫁接在WT砧木上的转基因接穗看上去与其来源的转基因植物的地上部分相似，即，枝条的矮化表型也是自主的，并且不依赖于改善的根生长(参见图12B)。
除了上述嫁接在转基因砧木上WT枝条的更好外观外，注意到了WT枝条基部上不定根的形成(图12D，右侧植物)。不定根形成也在AtCKX转基因植物的茎上出现，但没有在WT对照嫁接植物茎上出现(图12D，左侧植物)，因此看起来是非自主性状。
概括地，本发明公开了过量表达AtCKX的烟草中根形成的增加和枝条矮化是自主的性状，并且可以由嫁接方法分离开。令人惊讶的是，AtCKX转基因砧木上WT接穗的嫁接产生了生长更有活力的植物和叶衰老的延迟。
作为嫁接的可替代方案，可以利用组织特异性启动子以解离细胞分裂素过量表达的自主表型效应。因此，本发明公开了组织特异性方式的细胞分裂素氧化酶过量表达可以用于改变植物如枝条或根系的形态学。
实施例13.转基因植物中根特异性启动子控制下AtCKX基因的表达引起了增加的根产生
在拟南芥(Arabidopsis)根clavata同系物启动子(SEQ ID NO36)控制下克隆AtCKX基因(参见实施例4)，所述启动子是驱动根特异性表达的启动子。其它根特异性启动子也可以用于本发明目的。参见表5示例的根特异性启动子。
在根中特异地表达AtCKX基因的转基因植物显示了增加的根产量，没有不利地影响植物地上部分的生长和发育。观察到了对叶衰老和地上植物部分生长的积极作用。
实施例14转基因植物中衰老诱导型启动子控制下的AtCKX基因抑制导致了延迟的叶片衰老和增加的种子产量
在衰老诱导型启动子控制下克隆来源于AtCKX基因，并设计为抑制内源细胞分裂素氧化酶基因表达的嵌合基因构建体。例如，可以利用来源于衰老相关基因(SAG)的启动子，如SAG12启动子(Quirino等，2000)。特异性在衰老叶中抑制内源细胞分裂素氧化酶基因的转基因植物显示了延迟的叶衰老和更高的种子产量，没有不利地影响植物的形态学及生长和发育。
实施例15.雌性繁殖器官中AtCKX基因的过量表达引起了单性果实发育
在赋予雌性繁殖器官过量表达的启动子控制下，克隆AtCKX基因的开放读框，所述启动子如，例如是来源于的金鱼草(Antirrhinum majus)的DefH9启动子或其同系物之一，其在胎座和胚珠中有高度表达特异性。这些组织中具有增加的细胞分裂素氧化酶活性的转基因植物显示了单性果实发育
实施例16.AtCKX基因过量表达引起了种子和子叶大小的增加
在35s启动子控制下过量表达细胞分裂素氧化酶(AtCKX)基因的转基因拟南芥(Arabidopsis thaliana)植物如上文所述。转基因植物，特别是那些表达AtCKX1和AtCKX3基因的转基因植物，发育成大小增加的种子，该大小增加几乎完全是由增大的胚引起的。在图13A到13E中示出了种子，胚和早期胚后期表型的细节。表11示出了野生型和4个研究的AtCKX基因的每个基因的2个独立克隆的种子重量。通过分析每个克隆5个不同批次的200粒种子获得平均重量。定量评估表明AtCKX1和AtCKX3表达克隆的种子重量比野生型高约1.8-2.3倍。AtCKX2和AtCKX4表达株系种子重量的增加范围是10-25％(表11和图14)。
由于曾预期减少的细胞分裂素含量将与减小的器官生长有关，因此种子、胚和子叶大小和重量的增加是意外的。种子、胚和子叶大小增加的一个可能原因是细胞分裂素在这些贮藏器官中以前未知的负调节功能。至今，仅知道根的细胞分裂素在器官生长控制中的负调节功能(Werner等，2001)。因此，我们提出在细胞分裂素负调节其生长的组织中，细胞分裂素氧化酶基因的定位表达引起该组织增加的生长。例如，在子叶发育期间CKX基因的定位表达可能引起子叶生长的增加，并且在子叶作为贮藏器官的物种中，引起增加的产量和幼苗增加的生长性能。在AtCKX1和AtCKX3表达子中种子总数减少。然而，以前还没有拟南芥(Arabidopsis)中减少的种子数与大小增加有关的报道。
实施例17
用带有CaMV 35S启动子控制下的AtCKX1基因或AtCKX2基因的载体Bin-Hyg-TX转化烟草(Nicotiana tabacum L.cv.Samsun NN)叶外植体。进一步栽培来源于这些转化植物的几个株系，并分析它们的种子大小(表12)。
具有转基因CKX1和CKX2的烟草都显示了作为种子大小参数的种子面积的增加。
表11 WTCKX1-11-7CKX1-15-1 CKX2-2-4CKX2-9-3CKX3-9-4CKX3-12-13CKX4-37-2CKX4-41-7种子重量 0.0158± 0.00090.0372±0.00150.0352±0.0023 0.0201± 0.00170.0180±0.00010.0340±0.00270.0280±0.00270.0185±0.00040.0179±0.0007WT的％ 100235.5222.6 126.7113.7215.0176.7116.8112.7
表12 烟草植物 描述 转基因平均种子面积2 T1 38无合子 (nullizygote)03 T1 38无合子0.2794 T1 38无合子0.2975 WT0.2486 WT0.2437 WT0.2648 WT0.2771 T1 38转基因的CKX20.3539 T1 38转基因的CKX20.28110 T1 38转基因的CKX20.29311 T1 38转基因的CKX20.32912 T1 38转基因的CKX20.28213 T1 8转基因的CKX10.27814 T1 8转基因的CKX10.31515 T1 8转基因的CKX10.32216 T1 8转基因的CKX10.312
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序列表
CROP005PCT2.ST25.txt
<110>Werner，Tomas
Schmulling，Thomas
<120>修饰植物形态学、生物化学和生理学的方法
<130>CROP-005-PCT2
<150>US 10/014,101
<151>2001-10-12
<160>36
<170>PatentIn version 3.1
<210>1
<211>2236
<212>DNA
<213>拟南芥(Arabidopsis thaliana)
<400>1
atgggattga cctcatcctt acggttccat agacaaaaca acaagacttt cctcggaatc 60
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tcactagatt tggagggtta tataagcttc gacgatgtcc acaatgtggc caaggacttt 240
ggcaacagat accagttacc acctttggca attctacatc caaggtcagt ttttgatatt 300
tcatcgatga tgaagcatat agtacatctg ggctccacct caaatcttac agtagcagct 360
agaggccatg gtcactcgct tcaaggacaa gctctagctc atcaaggtgt tgtcatcaaa 420
atggagtcac ttcgaagtcc tgatatcagg atttataagg ggaagcaacc atatgttgat 480
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ccaaagtcct ggacagacta ccttcatttg accgttggag gtacactatc taatgctgga 600
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CROP005PCT2.ST25.txt
attcagtccc aacgattcca cacaggcaag cagattcaag tcagatggga aaactcttta1320
ttgcctagaa gtggtcaaat atttcaaccc agaagaagct agctctatgg atcaggtaag1380
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agtaagtgag caaaatgcca aaagcaaatg cgtccagtga ttctgaaaca taaattacta1800
accatatcca acattttgtg gtttcaggtg gaagaaacat acatctttga taactccaaa1860
tgaagatata ttctatctcg tagcctttct cccctctgca gtgccaaatt cctcagggaa1920
aaacgatcta gagtaccttt tgaaacaaaa ccaaagagtt atgaacttct gcgcagcagc1980
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ctttggcaaa agatgggaaa catttgcaca gaggaaacaa gcctacgacc ctctagcgat2100
tctagcacct ggccaaagaa tattccaaaa gacaacagga aaattatctc ccatccaact2160
cgcaaagtca aaggcaacag gaagtcctca aaggtaccat tacgcatcaa tactgccgaa2220
acctagaact gtataa2236
<210>2
<211>575
<212>PRT
<213>拟南芥
<400>2
Met Gly Leu Thr Ser Ser Leu Arg Phe His Arg Gln Asn Asn Lys Thr
1 5 10 15
Phe Leu Gly Ile Phe Met Ile Leu Val Leu Ser Cys Ile Pro Gly Arg
20 25 30
Thr Asn Leu Cys Ser Asn His Ser Val Ser Thr Pro Lys Glu Leu Pro
35 40 45
Ser Ser Asn Pro Ser Asp Ile Arg Ser Ser Lau Val Ser Leu Asp Leu
50 55 60
Glu Gly Tyr Ile Ser Phe Asp Asp Val His Asn Val Ala Lys Asp Phe
65 70 75 80
CROP005PCT2.ST25.txt
Gly Asn Arg Tyr Gln Leu Pro Pro Leu Ala Ile Leu His Pro Arg Ser
85 90 95
Val Phe Asp Ile Ser Ser Met Met Lys His Ile Val His Leu Gly Ser
100 105 110
Thr Ser Asn Leu Thr Val Ala Ala Arg Gly His Gly His Ser Leu Gln
115 120 125
Gly Gln Ala Leu Ala His Gln Gly Val Val Ile Lys Met Glu Ser Leu
130 135 140
Arg Ser Pro Asp Ile Arg Ile Tyr Lys Gly Lys Gln Pro Tyr Val Asp
145 150 155 160
Val Ser Gly Gly Glu Ile Trp Ile Asn Ile Leu Arg Glu Thr Leu Lys
165 170 175
Tyr Gly Leu Ser Pro Lys Ser Trp Thr Asp Tyr Leu His Leu Thr Val
180 185 190
Gly Gly Thr Leu Ser Asn Ala Gly Ile Ser Gly Gln Ala Phe Lys His
195 200 205
Gly Pro Gln Ile Asn Asn Val Tyr Gln Leu Glu Ile Val Thr Gly Lys
210 215 220
Gly Glu Val Val Thr Cys Ser Glu Lys Arg Asn Ser Glu Leu Phe Phe
225 230 235 240
Ser Val Leu Gly Gly Leu Gly Gln Phe Gly Ile Ile Thr Arg Ala Arg
245 250 255
Ile Ser Leu Glu Pro Ala Pro His Met Val Lys Trp Ile Arg Val Leu
260 265 270
Tyr Ser Asp Phe Ser Ala Phe Ser Arg Asp Gln Glu Tyr Leu Ile Ser
275 280 285
Lys Glu Lys Thr Phe Asp Tyr Val Glu Gly Phe Val Ile Ile Asn Arg
290 295 300
Thr Asp Leu Leu Asn Asn Trp Arg Ser Ser Phe Ser Pro Asn Asp Ser
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Thr Gln Ala Ser Arg Phe Lys Ser Asp Gly Lys Thr Leu Tyr Cys Leu
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CROP005PCT2.ST25.txt
Glu Val Val Lys Tyr Phe Asn Pro Glu Glu Ala Ser Ser Met Asp Gln
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Glu Thr Gly Lys Leu Leu Ser Glu Leu Asn Tyr Ile Pro Ser Thr Leu
355 360 365
Phe Ser Ser Glu Val Pro Tyr Ile Glu Phe Leu Asp Arg Val His Ile
370 375 380
Ala Glu Arg Lys Leu Arg Ala Lys Gly Leu Trp Glu Val Pro His Pro
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Trp Leu Asn Leu Leu Ile Pro Lys Ser Ser Ile Tyr Gln Phe Ala Thr
405 410 415
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Ile Tyr Pro Val Asn Gln Ser Lys Trp Lys Lys His Thr Ser Leu Ile
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Thr Pro Asn Glu Asp Ile Phe Tyr Leu Val Ala Phe Leu Pro Ser Ala
450 455 460
Val Pro Asn Ser Ser Gly Lys Asn Asp Leu Glu Tyr Leu Leu Lys Gln
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Asn Gln Arg Val Met Asn Phe Cys Ala Ala Ala Asn Leu Asn Val Lys
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Gln Tyr Leu Pro His Tyr Glu Thr Gln Lys Glu Trp Lys Ser His Phe
500 505 510
Gly Lys Arg Trp Glu Thr Phe Ala Gln Arg Lys Gln Ala Tyr Asp Pro
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Leu Ala Ile Leu Ala Pro Gly Gln Arg Ile Phe Gln Lys Thr Thr Gly
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Gln Arg Tyr His Tyr Ala Ser Ile Leu Pro Lys Pro Arg Thr Val
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<210>3
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<213>拟南芥
<400>3
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aaataaaata taacctaacg gaaataatta ttttactaat cggataatgt ctgattaaaa1380
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cgagatccta aactgtacaa agaggcagaa cagcgactta tttaatggtg ttcttggtgg 780
tttaggtcag tttggcatca taacgcgggc aagaatagca ttggaaccag caccaaccat 840
ggtaaacaat aaataaataa aaaacttaaa aactgaacac gcgtgtgtcc tcctaactct 900
gtataatgga caggtaaaat ggataagagt gttatacctg gattttgcag cttttgccaa 960
ggaccaagag caactaatat ctgcccaggg ccacaaattc gattacatag aagggtttgt1020
gataataaac aggacaggcc tcctgaacag ctggaggttg tctttcaccg cagaagagcc1080
tttagaagca agccaattca agtttgatgg aaggactctg tattgtctgg agctagccaa1140
gtatttgaag caagataaca aagacgtaat caaccaggtg agaaaacaga gtagaagcaa1200
tcggtagaat cttctttggt agatgacatt cattggaact gaaaatatat atatatttgt1260
ccaatccagg aagtgaaaga aacattatca gagctaagct acgtgacgtc gacactgttt1320
acaacggagg tagcatatga agcattcttg gacagggtac atgtgtctga ggtaaaactc1380
cgatcgaaag ggcagtggga ggtgccacat ccatggctga acctcctggt accaagaagc1440
aaaatcaatg aatttgcaag aggtgtattt ggaaacatac taacggatac aagcaacggc1500
ccagtcatcg tctacccagt gaacaaatca aagtaagaaa gaaagaaaga aagagctagt1560
catgattttg tttcttttca cttgttgaca aaacaaaagc atgttggtga gcaggtggga1620
caatcaaaca tcagcagtaa caccggagga agaggtattc tacctggtgg cgatcctaac1680
atcggcatct ccagggtcgg caggaaagga tggagtagaa gagatcttga ggcggaacag1740
aagaatactg gaattcagtg aagaagcagg gatagggttg aagcagtatc tgccacatta1800
cacgacaaga gaagagtgga gatcccattt cggggacaag tggggagaat ttgtgaggag1860
gaaatccaga tatgatccat tggcaattct tgcgcctggc caccgaattt ttcaaaaggc1920
agtctcatac tcatga1936
<210>12
<211>504
<212>PRT
<213>拟南芥
<400>12
Met Leu Ile Val Arg Ser Phe Thr Ile Leu Leu Leu Ser Cys Ile Ala
1 5 10 15
Phe Lys Leu Ala Cys Cys Phe Ser Ser Ser Ile Ser Ser Leu Lys Ala
20 25 30
Leu Pro Leu Val Gly His Leu Glu Phe Glu His Val His His Ala Ser
CROP005PCT2.ST25.txt
35 40 45
Lys Asp Phe Gly Asn Arg Tyr Gln Leu Ile Pro Leu Ala Val Leu His
50 55 60
Pro Lys Ser Val Ser Asp Ile Ala Ser Thr Ile Arg His Ile Trp Met
65 70 75 80
Met Gly Thr His Ser Gln Leu Thr Val Ala Ala Arg Gly Arg Gly His
85 90 95
Ser Leu Gln Gly Gln Ala Gln Thr Arg His Gly Ile Val Ile His Met
100 105 110
Glu Ser Leu His Pro Gln Lys Leu Gln Val Tyr Ser Val Asp Ser Pro
115 120 125
Ala Pro Tyr Val Asp Val Ser Gly Gly Glu Leu Trp Ile Asn Ile Leu
130 135 140
His Glu Thr Leu Lys Tyr Gly Leu Ala Pro Lys Ser Trp Thr Asp Tyr
145 150 155 160
Leu His Leu Thr Val Gly Gly Thr Leu Ser Asn Ala Gly Ile Ser Gly
165 170 175
Gln Ala Phe Arg His Gly Pro Gln Ile Ser Asn Val His Gln Leu Glu
180 185 190
Ile Val Thr Gly Lys Gly Glu Ile Leu Asn Cys Thr Lys Arg Gln Asn
195 200 205
Ser Asp Leu Phe Asn Gly Val Leu Gly Gly Leu Gly Gln Phe Gly Ile
210 215 220
Ile Thr Arg Ala Arg Ile Ala Leu Glu Pro Ala Pro Thr Met Asp Gln
225 230 235 240
Glu Gln Leu Ile Ser Ala Gln Gly His Lys Phe Asp Tyr Ile Glu Gly
245 250 255
Phe Val Ile Ile Asn Arg Thr Gly Leu Leu Asn Ser Trp Arg Leu Ser
260 265 270
Phe Thr Ala Glu Glu Pro Leu Glu Ala Ser Gln Phe Lys Phe Asp Gly
275 280 285
CROP005PCT2.ST25.txt
Arg Thr Leu Tyr Cys Leu Glu Leu Ala Lys Tyr Leu Lys Gln Asp Asn
290 295 300
Lys Asp Val Ile Asn Gln Glu Val Lys Glu Thr Leu Ser Glu Leu Ser
305 310 315 320
Tyr Val Thr Ser Thr Leu Phe Thr Thr Glu Val Ala Tyr Glu Ala Phe
325 330 335
Leu Asp Arg Val His Val Ser Glu Val Lys Leu Arg Ser Lys Gly Gln
340 345 350
Trp Glu Val Pro His Pro Trp Leu Asn Leu Leu Val Pro Arg Ser Lys
355 360 365
Ile Asn Glu Phe Ala Arg Gly Val Phe Gly Asn Ile Leu Thr Asp Thr
370 375 380
Ser Asn Gly Pro Val Ile Val Tyr Pro Val Asn Lys Ser Lys Trp Asp
385 390 395 400
Asn Gln Thr Ser Ala Val Thr Pro Glu Glu Glu Val Phe Tyr Leu Val
405 410 415
Ala Ile Leu Thr Ser Ala Ser Pro Gly Ser Ala Gly Lys Asp Gly Val
420 425 430
Glu Glu Ile Leu Arg Arg Asn Arg Arg Ile Leu Glu Phe Ser Glu Glu
435 440 445
Ala Gly Ile Gly Leu Lys Gln Tyr Leu Pro His Tyr Thr Thr Arg Glu
450 455 460
Glu Trp Arg Ser His Phe Gly Asp Lys Trp Gly Glu Phe Val Arg Arg
465 470 475 480
Lys Ser Arg Tyr Asp Pro Leu Ala Ile Leu Ala Pro Gly His Arg Ile
485 490 495
Phe Gln Lys Ala Val Ser Tyr Ser
500
<210>13
<211>31
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明寡核苷酸引物或探针
CROP005PCT2.ST25.txt
<400>13
cggtcgacat gggattgacc tcatccttac g31
<210>14
<211>35
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明寡核苷酸引物或探针
<400>14
gcgtcgactt atacagttct aggtttcggc agtat 35
<210>15
<211>33
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明寡核苷酸引物或探针
<400>15
gcggtaccag agagagaaac ataaacaaat ggc 33
<210>16
<211>31
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明寡核苷酸引物或探针
<400>16
gcggtaccca attttacttc caccaaaatg c 31
<210>17
<211>34
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明寡核苷酸引物或探针
<400>17
gcggtacctt cattgataag aatcaagcta ttca 34
<210>18
<211>31
<212>DNA
<213>人工序列
CROP005PCT2.ST25.txt
<220>
<223>人工序列的说明寡核苷酸引物或探针
<400>18
gcggtaccca aagtggtgag aacgactaac a 31
<210>19
<211>28
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明寡核苷酸引物或探针
<400>19
gcggtacccc cattaaccta cccgtttg 28
<210>20
<211>32
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明寡核苷酸引物或探针
<400>20
gcggtaccag acgatgaacg tacttgtctg ta32
<210>21
<211>28
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明寡核苷酸引物或探针
<400>21
ggggtacctt gatgaatcgt gaaatgac 28
<210>22
<211>31
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明寡核苷酸引物或探针
<400>22
ggggtaccct ttcctcttgg ttttgtcctg t 31
<210>23
<211>32
<212>DNA
CROP005PCT2.ST25.txt
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明寡核苷酸引物或探针
<400>23
gctctagatc aggaaaagaa ccatgcttat ag32
<210>24
<211>32
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明寡核苷酸引物或探针
<400>24
gctctagatc atgagtatga gactgccttt tg 32
<210>25
<211>1728
<212>DNA
<213>拟南芥
<400>25
atgggattga cctcatcctt acggttccat agacaaaaca acaagacttt cctcggaatc 60
ttcatgatct tagttctaag ctgtatacca ggtagaacca atctttgttc caatcattct 120
gttagtaccc caaaagaatt accttcttca aatccttcag atattcgttc ctcattagtt 180
tcactagatt tggagggtta tataagcttc gacgatgtcc acaatgtggc caaggacttt 240
ggcaacagat accagttacc acctttggca attctacatc caaggtcagt ttttgatatt 300
tcatcgatga tgaagcatat agtacatctg ggctccacct caaatcttac agtagcagct 360
agaggccatg gtcactcgct tcaaggacaa gctctagctc atcaaggtgt tgtcatcaaa 420
atggagtcac ttcgaagtcc tgatatcagg atttataagg ggaagcaacc atatgttgat 480
gtctcaggtg gtgaaatatg gataaacatt ctacgcgaga ctctaaaata cggtctttca 540
ccaaagtcct ggacagacta ccttcatttg accgttggag gtacactatc taatgctgga 600
atcagcggtc aagcattcaa gcatggaccc caaatcaaca acgtctacca gctagagatt 660
gttacaggga aaggagaagt cgtaacctgt tctgagaagc ggaattctga acttttcttc 720
agtgttcttg gcgggcttgg acagtttggc ataatcaccc gggcacggat ctctcttgaa 780
ccagcaccgc atatggttaa atggatcagg gtactctact ctgacttttc tgcattttca 840
agggaccaag aatatctgat ttcgaaggag aaaacttttg attacgttga aggatttgtg 900
ataatcaata gaacagacct tctcaataat tggcgatcgt cattcagtcc caacgattcc 960
acacaggcaa gcagattcaa gtcagatggg aaaactcttt attgcctaga agtggtcaaa1020
CROP005PCT2.ST25.txt
tatttcaacc cagaagaagc tagctctatg gatcaggaaa ctggcaagtt actttcagag1080
ttaaattata ttccatccac tttgttttca tctgaagtgc catatatcga gtttctggat1140
cgcgtgcata tcgcagagag aaaactaaga gcaaagggtt tatgggaggt tccacatccc1200
tggctgaatc tcctgattcc taagagcagc atataccaat ttgctacaga agttttcaac1260
aacattctca caagcaacaa caacggtcct atccttattt atccagtcaa tcaatccaag1320
tggaagaaac atacatcttt gataactcca aatgaagata tattctatct cgtagccttt1380
ctcccctctg cagtgccaaa ttcctcaggg aaaaacgatc tagagtacct tttgaaacaa1440
aaccaaagag ttatgaactt ctgcgcagca gcaaacctca acgtgaagca gtatttgccc1500
cattatgaaa ctcaaaaaga gtggaaatca cactttggca aaagatggga aacatttgca1560
cagaggaaac aagcctacga ccctctagcg attctagcac ctggccaaag aatattccaa1620
aagacaacag gaaaattatc tcccatccaa ctcgcaaagt caaaggcaac aggaagtcct1680
caaaggtacc attacgcatc aatactgccg aaacctagaa ctgtataa 1728
<210>26
<211>1506
<212>DNA
<213>拟南芥
<400>26
atggctaatc ttcgtttaat gatcacttta atcacggttt taatgatcac caaatcatca 60
aacggtatta aaattgattt acctaaatcc cttaacctca ccctctctac cgatccttcc 120
atcatctccg cagcctctca tgacttcgga aacataacca ccgtgacccc cggcggcgta 180
atctgcccct cctccaccgc tgatatctct cgtctcctcc aatacgccgc aaacggaaaa 240
agtacattcc aagtagcggc tcgtggccaa ggccactcct taaacggcca agcctcggtc 300
tccggcggag taatcgtcaa catgacgtgt atcactgacg tggtggtttc aaaagacaag 360
aagtacgctg acgtggcggc cgggacgtta tgggtggatg tgcttaagaa gacggcggag 420
aaaggggtgt cgccggtttc ttggacggat tatttgcata taaccgtcgg aggaacgttg 480
tcgaatggtg gaattggtgg tcaagtgttt cgaaacggtc ctcttgttag taacgtcctt 540
gaattggacg ttattactgg gaaaggtgaa atgttgacat gctcgcgaca gctaaaccca 600
gaattgttct atggagtgtt aggaggtttg ggtcaatttg gaattataac gagagccaga 660
attgttttgg accatgcacc taaacgggcc aaatggtttc ggatgctcta cagtgatttc 720
acaactttta caaaggacca agaacgtttg atatcaatgg caaacgatat tggagtcgac 780
tatttagaag gtcaaatatt tctatcaaac ggtgtcgttg acacctcttt tttcccacct 840
tcagatcaat ctaaagtcgc tgatctagtc aagcaacacg gtatcatcta tgttcttgaa 900
gtagccaagt attatgatga tcccaatctc cccatcatca gcaaggttat tgacacatta 960
CROP005PCT2.ST25.txt
acgaaaacat taagttactt gcccgggttc atatcaatgc acgacgtggc ctacttcgat1020
ttcttgaacc gtgtacatgt cgaagaaaat aaactcagat ctttgggatt atgggaactt1080
cctcatcctt ggcttaacct ctacgttcct aaatctcgga ttctcgattt tcataacggt1140
gttgtcaaag acattcttct taagcaaaaa tcagcttcgg gactcgctct tctctatcca1200
acaaaccgga ataaatggga caatcgtatg tcggcgatga taccagagat cgatgaagat1260
gttatatata ttatcggact actacaatcc gctaccccaa aggatcttcc agaagtggag1320
agcgttaacg agaagataat taggttttgc aaggattcag gtattaagat taagcaatat1380
ctaatgcatt atactagtaa agaagattgg attgagcatt ttggatcaaa atgggatgat1440
ttttcgaaga ggaaagatct atttgatccc aagaaactgt tatctccagg gcaagacatc1500
ttttga 1506
<210>27
<211>1572
<212>DNA
<213>拟南芥
<400>27
atggcgagtt ataatcttcg ttcacaagtt cgtcttatag caataacaat agtaatcatc 60
attactctct caactccgat cacaaccaac acatcaccac aaccatggaa tatcctttca 120
cacaacgaat tcgccggaaa actcacctcc tcctcctcct ccgtcgaatc agccgccaca 180
gatttcggcc acgtcaccaa aatcttccct tccgccgtct taatcccttc ctccgttgaa 240
gacatcacag atctcataaa actctctttt gactctcaac tgtcttttcc tttagccgct 300
cgtggtcacg gacacagcca ccgtggccaa gcctcggcta aagacggagt tgtggtcaac 360
atgcggtcca tggtaaaccg ggatcgaggt atcaaggtgt ctaggacctg tttatatgtt 420
gacgtggacg ctgcgtggct atggattgag gtgttgaata aaactttgga gttagggtta 480
acgccggttt cttggacgga ttatttgtat ttaacagtcg gtgggacgtt atcaaacggc 540
ggaattagtg gacaaacgtt tcggtacggt ccacagatca ctaatgttct agagatggat 600
gttattactg gaaaaggaga gattgcaact tgttccaagg acatgaactc ggatcttttc 660
ttcgcggtgt taggaggttt gggtcaattc ggcattataa caagagccag aattaaactt 720
gaagtagctc cgaaaagggc caagtggtta aggtttctat acatagattt ctccgaattc 780
acaagagatc aagaacgagt gatatcgaaa acggacggtg tagatttctt agaaggttcc 840
attatggtgg accatggccc accggataac tggagatcca cgtattatcc accgtccgat 900
cacttgagga tcgcctcaat ggtcaaacga catcgtgtca tctactgcct tgaagtcgtc 960
aagtattacg acgaaacttc tcaatacaca gtcaacgagg aaatggagga gttaagcgat1020
agtttaaacc atgtaagagg gtttatgtac gagaaagatg tgacgtatat ggatttccta1080
CROP005PCT2.ST25.txt
aaccgagttc gaaccggaga gctaaacctg aaatccaaag gccaatggga tgttccacat1140
ccatggctta atctcttcgt accaaaaact caaatctcca aatttgatga tggtgttttt1200
aagggtatta tcctaagaaa taacatcact agcggtcctg ttcttgttta tcctatgaat1260
cgcaacaagt ggaatgatcg gatgtctgcc gctatacccg aggaagatgt attttatgcg1320
gtagggtttt taagatccgc gggttttgac aattgggagg cttttgatca agaaaacatg1380
gaaatactga agttttgtga ggatgctaat atgggggtta tacaatatct tccttatcat1440
tcatcacaag aaggatgggt tagacatttt ggtccgaggt ggaatatttt cgtagagaga1500
aaatataaat atgatcccaa aatgatatta tcaccgggac aaaatatatt tcaaaaaata1560
aactcgagtt ag1572
<210>28
<211>1575
<212>DNA
<213>拟南芥
<400>28
atgactaata ctctctgttt aagcctcatc accctaataa cgctttttat aagtttaacc 60
ccaaccttaa tcaaatcaga tgagggcatt gatgttttct tacccatatc actcaacctt 120
acggtcctaa ccgatccctt ctccatctct gccgcttctc acgacttcgg taacataacc 180
gacgaaaatc ccggcgccgt cctctgccct tcctccacca cggaggtggc tcgtctcctc 240
cgtttcgcta acggaggatt ctcttacaat aaaggctcaa ccagccccgc gtctactttc 300
aaagtggctg ctcgaggcca aggccactcc ctccgtggcc aagcctctgc acccggaggt 360
gtcgtcgtga acatgacgtg tctcgccatg gcggctaaac cagcggcggt tgttatctcg 420
gcagacggga cttacgctga cgtggctgcc gggacgatgt gggtggatgt tctgaaggcg 480
gcggtggata gaggcgtctc gccggttaca tggacggatt atttgtatct cagcgtcggc 540
gggacgttgt cgaacgctgg aatcggtggt cagacgttta gacacggccc tcagattagt 600
aacgttcatg agcttgacgt tattaccgga aaaggtgaaa tgatgacttg ctctccaaag 660
ttaaaccctg aattgttcta tggagtttta ggaggtttgg gtcaattcgg tattataacg 720
agggccagga ttgcgttgga tcatgcaccc acaagggtga aatggtctcg catactctac 780
agtgacttct cggcttttaa aagagaccaa gagcgtttaa tatcaatgac caatgatctc 840
ggagttgact ttttggaagg tcaacttatg atgtcaaatg gcttcgtaga cacctctttc 900
ttcccactct ccgatcaaac aagagtcgca tctcttgtga atgaccaccg gatcatctat 960
gttctcgaag tagccaagta ttatgacaga accacccttc ccattattga ccaggtgatt1020
gacacgttaa gtagaactct aggtttcgct ccagggttta tgttcgtaca agatgttccg1080
tatttcgatt tcttgaaccg tgtccgaaac gaagaagata aactcagatc tttaggacta1140
CROP005PCT2.ST25.txt
tgggaagttc ctcatccatg gcttaacatc tttgtcccgg ggtctcgaat ccaagatttt1200
catgatggtg ttattaatgg ccttcttcta aaccaaacct caacttctgg tgttactctc1260
ttctatccca caaaccgaaa caaatggaac aaccgcatgt caacgatgac accggacgaa1320
gatgtttttt atgtgatcgg attactgcaa tcagctggtg gatctcaaaa ttggcaagaa1380
cttgaaaatc tcaacgacaa ggttattcag ttttgtgaaa actcgggaat taagattaag1440
gaatatttga tgcactatac aagaaaagaa gattgggtta aacattttgg accaaaatgg1500
gatgattttt taagaaagaa aattatgttt gatcccaaaa gactattgtc tccaggacaa1560
gacatattta attaa 1575
<210>29
<211>1611
<212>DNA
<213>拟南芥
<400>29
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ctaaacgtgg gccccagtga gctcctccgc atcggagcca tagatgtcga cggccacttc 120
accgtccacc cttccgactt agcctccgtc tcctcagact tcggtatgct gaagtcacct 180
gaagagccat tggccgtgct tcatccatca tcggccgaag acgtggcacg actcgtcaga 240
acagcttacg gttcagccac ggcgtttccg gtctcagccc gaggccacgg ccattccata 300
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gggacgccca agccactcgt ccgaccggat gaaatgtatg tggatgtatg gggtggagag 420
ttatgggtcg atgtgttgaa gaaaacgttg gagcatggct tagcaccaaa atcatggacg 480
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gactccgact ccgaaatcgt tgatcaggaa gttgagattc tgatgaagaa attgaatttc1020
ataccgacat cggtctttac aacggattta caatatgtgg actttctcga ccgggtacac1080
aaggccgaat tgaagctccg gtccaagaat ttatgggagg ttccacaccc atggctcaac1140
ctcttcgtgc caaaatcaag aatctctgac ttcgataaag gcgttttcaa gggcattttg1200
CROP005PCT2.ST25.txt
ggaaataaaa caagtggccc tattcttatc taccccatga acaaagacaa atgggacgag1260
aggagctcag ccgtgacgcc ggatgaggaa gttttctatc tggtggctct attgagatca1320
gctttaacgg acggtgaaga gacacagaag ctagagtatc tgaaagatca gaaccgtcgg1380
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<211>1515
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<213>拟南芥
<400>30
atgcttatag taagaagttt caccatcttg cttctcagct gcatagcctt taagttggct 60
tgctgcttct ctagcagcat ttcttctttg aaggcgcttc ccctagtagg ccatttggag 120
tttgaacatg tccatcacgc ctccaaagat tttggaaatc gataccagtt gatccctttg 180
gcggtcttac atcccaaatc ggtaagcgac atcgcctcaa cgatacgaca catctggatg 240
atgggcactc attcacagct tacagtggca gcgagaggtc gtggacattc actccaaggc 300
caagctcaaa caagacatgg aattgttata cacatggaat cactccatcc ccagaagctg 360
caggtctaca gtgtggattc ccctgctcca tatgttgatg tgtctggtgg tgagctgtgg 420
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ctgcatttaa ctgtaggtgg tactctgtcc aatgctggaa taagcggcca ggcattccga 540
catggaccac agatcagcaa tgttcatcaa ctggagattg tcacaggaaa aggcgagatc 600
ctaaactgta caaagaggca gaacagcgac ttatttaatg gtgttcttgg tggtttaggt 660
cagtttggca tcataacgcg ggcaagaata gcattggaac cagcaccaac catggaccaa 720
gagcaactaa tatctgccca gggccacaaa ttcgattaca tagaagggtt tgtgataata 780
aacaggacag gcctcctgaa cagctggagg ttgtctttca ccgcagaaga gcctttagaa 840
gcaagccaat tcaagtttga tggaaggact ctgtattgtc tggagctagc caagtatttg 900
aagcaagata acaaagacgt aatcaaccag gaagtgaaag aaacattatc agagctaagc 960
tacgtgacgt cgacactgtt tacaacggag gtagcatatg aagcattctt ggacagggta1020
catgtgtctg aggtaaaact ccgatcgaaa gggcagtggg aggtgccaca tccatggctg1080
aacctcctgg taccaagaag caaaatcaat gaatttgcaa gaggtgtatt tggaaacata1140
ctaacggata caagcaacgg cccagtcatc gtctacccag tgaacaaatc aaagtgggac1200
aatcaaacat cagcagtaac accggaggaa gaggtattct acctggtggc gatcctaaca1260
CROP005PCT2.ST25.txt
tcggcatctc cagggtcggc aggaaaggat ggagtagaag agatcttgag gcggaacaga1320
agaatactgg aattcagtga agaagcaggg atagggttga agcagtatct gccacattac1380
acgacaagag aagagtggag atcccatttc ggggacaagt ggggagaatt tgtgaggagg1440
aaatccagat atgatccatt ggcaattctt gcgcctggcc accgaatttt tcaaaaggca1500
gtctcatact catga 1515
<210>31
<211>84
<212>DNA
<213>拟南芥
<400>31
tcagcttcgg gactcgctct tctctatcca acaaaccgga ataaatggga caatcgtatg 60
tcggcgatga taccagagat cgat 84
<210>32
<211>28
<212>PRT
<213>拟南芥
<400>32
Ser Ala Ser Gly Leu Ala Leu Leu Tyr Pro Thr Asn Arg Asn Lys Trp
1 5 10 15
Asp Asn Arg Met Ser Ala Met Ile Pro Glu Ile Asp
20 25
<210>33
<211>2814
<212>DNA
<213>拟南芥
<400>33
atgaatcgta tgacgtcaag ctttcttctc ctgacgttcg ccatatgtaa actgatcata 60
gccgtgggtc taaacgtggg ccccagtgag ctcctccgca tcggagccat agatgtcgac 120
ggccacttca ccgtccaccc ttccgactta gcctccgtct cctcagactt cggtatgctg 180
aagtcacctg aagagccatt ggccgtgctt catccatcat cggccgaaga cgtggcacga 240
ctcgtcagaa cagcttacgg ttcagccacg gcgtttccgg tctcagcccg aggccacggc 300
cattccataa acggacaagc cgcggcgggg aggaacggtg tggtggttga aatgaaccac 360
ggcgtaaccg ggacgcccaa gccactcgtc cgaccggatg aaatgtatgt ggatgtatgg 420
ggtggagagt tatgggtcga tgtgttgaag aaaacgttgg agcatggctt agcaccaaaa 480
tcatggacgg attacttgta tctaaccgtt ggaggtacac tctccaatgc aggaatcagt 540
ggtcaagctt ttcaccatgg tcctcaaatt agtaacgtcc ttgagctcga cgttgtaact 600
CROP005PCT2.ST25.txt
ggttagtatt aaaacattca agttcatata ttttaaatgc ttttgtctga agttttacta 660
ataacaagaa attgatacca aaaagtaggg aaaggagagg tgatgagatg ctcagaagaa 720
gagaacacaa ggctattcca tggagttctt ggtggattag gtcaatttgg gatcatcact 780
cgagcacgaa tctctctcga accagctccc caaagggtaa tattttttta atgactagct 840
atcaaaaatc cctggcgggt ccatacgttg taatcttttt agtttttact gttgatggta 900
ttttttatat attttggata ataaaaccct aaaatggtat attgtgatga caggtgagat 960
ggatacgggt attgtattcg agcttcaaag tgtttacgga ggaccaagag tacttaatct1020
caatgcatgg tcaattaaag tttgattacg tggaaggttt tgtgattgtg gacgaaggac1080
tcgtcaacaa ttggagatct tctttcttct ctccacgtaa ccccgtcaag atctcctctg1140
ttagttccaa cggctctgtt ttgtattgcc ttgagatcac caagaactac cacgactccg1200
actccgaaat cgttgatcag gtcactttca ttattcactt agaaaaaagc gatattttca1260
ttttttatat tgatgaatat ctggaaggat ttaacgctat gcgactattg ggaaatcatt1320
atgaaaaaat atttagttta tatgattgaa agtggtctcc atagtatttt tgttgtgtcg1380
actttattat aacttaaatt tggaagagga catgaagaag aagccagaga ggatctacag1440
agatctagct tttccacctg aacttaataa tgcacattta tataattatt tttcttcttc1500
taaagtttag tttatcacta gcgaattaat catggttact aattaagtag tggacagggt1560
catggaccac tcactcacca aataatgatt cctctttact cttaagttta attttaataa1620
aaccaactct actggaatct taacttatcc ttggttttgg taggctttta tagcaacacg1680
gtttttttaa ttttcctatt ccagattttg tatattaaat gtcgattttt tttctttttg1740
tttcaggaag ttgagattct gatgaagaaa ttgaatttca taccgacatc ggtctttaca1800
acggatttac aatatgtgga ctttctcgac cgggtacaca aggccgaatt gaagctccgg1860
tccaagaatt tatgggaggt tccacaccca tggctcaacc tcttcgtgcc aaaatcaaga1920
atctctgact tcgataaagg cgttttcaag ggcattttgg gaaataaaac aagtggccct1980
attcttatct accccatgaa caaagacaag taagtcttga cattaccatt gattactact2040
tctaaatttc ttctctagaa aaaagaataa aacgagtttt gcattgcatg catgcaaagt2100
tacacttgtg gggattaatt agtggtccaa gaaaaaaagt ttgtcaaaat tgaaaaaaac2160
tagacacgtg gtacatggga ttgtccgaaa aacgttgtcc acatgtgcat cgaaccagct2220
aagattgaca acaacacttc gtcggctcgt atttctcttt ttgttttgtg accaaatccg2280
atggtccaga ttgggtttat ttgtttttaa gttcctagaa ctcatggtgg gtgggtccca2340
atcagattct cctagaccaa accgatctca acgaaccctc cgcacatcat tgattattac2400
attaatatag atattgtcgt tgctgacgtg tcgtaatttg atgttattgt cagatgggac2460
gagaggagct cagccgtgac gccggatgag gaagttttct atctggtggc tctattgaga2520
CROP005PCT2.ST25.txt
tcagctttaa cggacggtga agagacacag aagctagagt atctgaaaga tcagaaccgt2580
cggatcttgg agttctgtga acaagccaag atcaatgtga agcagtatct tcctcaccac2640
gcaacacagg aagagtgggt ggctcatttt ggggacaagt gggatcggtt cagaagctta2700
aaggctgagt ttgatccgcg acacatactc gctactggtc agagaatctt tcaaaaccca2760
tctttgtctt tgtttcctcc gtcgtcgtct tcttcgtcag cggcttcatg gtga 2814
<210>34
<211>1620
<212>DNA
<213>拟南芥
<400>34
atgaatcgta tgacgtcaag ctttcttctc ctgacgttcg ccatatgtaa actgatcata 60
gccgtgggtc taaacgtggg ccccagtgag ctcctccgca tcggagccat agatgtcgac 120
ggccacttca ccgtccaccc ttccgactta gcctccgtct cctcagactt cggtatgctg 180
aagtcacctg aagagccatt ggccgtgctt catccatcat cggccgaaga cgtggcacga 240
ctcgtcagaa cagcttacgg ttcagccacg gcgtttccgg tctcagcccg aggccacggc 300
cattccataa acggacaagc cgcggcgggg aggaacggtg tggtggttga aatgaaccac 360
ggcgtaaccg ggacgcccaa gccactcgtc cgaccggatg aaatgtatgt ggatgtatgg 420
ggtggagagt tatgggtcga tgtgttgaag aaaacgttgg agcatggctt agcaccaaaa 480
tcatggacgg attacttgta tctaaccgtt ggaggtacac tctccaatgc aggaatcagt 540
ggtcaagctt ttcaccatgg tcctcaaatt agtaacgtcc ttgagctcga cgttgtaact 600
gggaaaggag aggtgatgag atgctcagaa gaagagaaca caaggctatt ccatggagtt 660
cttggtggat taggtcaatt tgggatcatc actcgagcac gaatctctct cgaaccagct 720
ccccaaaggg tgagatggat acgggtattg tattcgagct tcaaagtgtt tacggaggac 780
caagagtact taatctcaat gcatggtcaa ttaaagtttg attacgtgga aggttttgtg 840
attgtggacg aaggactcgt caacaattgg agatcttctt tcttctctcc acgtaacccc 900
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aactaccacg actccgactc cgaaatcgtt gatcaggaag ttgagattct gatgaagaaa1020
ttgaatttca taccgacatc ggtctttaca acggatttac aatatgtgga ctttctcgac1080
cgggtacaca aggccgaatt gaagctccgg tccaagaatt tatgggaggt tccacaccca1140
tggctcaacc tcttcgtgcc aaaatcaaga atctctgact tcgataaagg cgttttcaag1200
ggcattttgg gaaataaaac aagtggccct attcttatct accccatgaa caaagacaaa1260
tgggacgaga ggagctcagc cgtgacgccg gatgaggaag ttttctatct ggtggctcta1320
ttgagatcag ctttaacgga cggtgaagag acacagaagc tagagtatct gaaagatcag1380
CROP005PCT2.ST25.txt
aaccgtcgga tcttggagtt ctgtgaacaa gccaagatca atgtgaagca gtatcttcct1440
caccacgcaa cacaggaaga gtgggtggct cattttgggg acaagtggga tcggttcaga1500
agcttaaagg ctgagtttga tccgcgacac atactcgcta ctggtcagag aatctttcaa1560
aacccatctt tgtctttgtt tcctccgtcg tcgtcttctt cgtcagcggc ttcatggtga1620
<210>35
<211>539
<212>PRT
<213>拟南芥
<400>35
Met Asn Arg Met Thr Ser Ser Phe Leu Leu Leu Thr Phe Ala Ile Cys
1 5 10 15
Lys Leu Ile Ile Ala Val Gly Leu Asn Val Gly Pro Ser Glu Leu Leu
20 25 30
Arg Ile Gly Ala Ile Asp Val Asp Gly His Phe Thr Val His Pro Ser
35 40 45
Asp Leu Ala Ser Val Ser Ser Asp Phe Gly Met Leu Lys Ser Pro Glu
50 55 60
Glu Pro Leu Ala Val Leu His Pro Ser Ser Ala Glu Asp Val Ala Arg
65 70 75 80
Leu Val Arg Thr Ala Tyr Gly Ser Ala Thr Ala Phe Pro Val Ser Ala
85 90 95
Arg Gly His Gly His Ser Ile Asn Gly Gln Ala Ala Ala Gly Arg Asn
100 105 110
Gly Val Val Val Glu Met Asn His Gly Val Thr Gly Thr Pro Lys Pro
115 120 125
Leu Val Arg Pro Asp Glu Met Tyr Val Asp Val Trp Gly Gly Glu Leu
130 135 140
Trp Val Asp Val Leu Lys Lys Thr Leu Glu His Gly Leu Ala Pro Lys
145 150 155 160
Ser Trp Thr Asp Tyr Leu Tyr Leu Thr Val Gly Gly Thr Leu Ser Asn
165 170 175
Ala Gly Ile Ser Gly Gln Ala Phe His His Gly Pro Gln Ile Ser Asn
180 185 190
CROP005PCT2.ST25.txt
Val Leu Glu Leu Asp Val Val Thr Gly Lys Gly Glu Val Met Arg Cys
195 200 205
Ser Glu Glu Glu Asn Thr Arg Leu Phe His Gly Val Leu Gly Gly Leu
210 215 220
Gly Gln Phe Gly Ile Ile Thr Arg Ala Arg Ile Ser Leu Glu Pro Ala
225 230 235 240
Pro Gln Arg Val Arg Trp Ile Arg Val Leu Tyr Ser Ser Phe Lys Val
245 250 255
Phe Thr Glu Asp Gln Glu Tyr Leu Ile Ser Met His Gly Gln Leu Lys
260 265 270
Phe Asp Tyr Val Glu Gly Phe Val Ile Val Asp Glu Gly Leu Val Asn
275 280 285
Asn Trp Arg Ser Ser Phe Phe Ser Pro Arg Asn Pro Val Lys Ile Ser
290 295 300
Ser Val Ser Ser Asn Gly Ser Val Leu Tyr Cys Leu Glu Ile Thr Lys
305 310 315 320
Asn Tyr His Asp Ser Asp Ser Glu Ile Val Asp Gln Glu Val Glu Ile
325 330 335
Leu Met Lys Lys Leu Asn Phe Ile Pro Thr Ser Val Phe Thr Thr Asp
340 345 350
Leu Gln Tyr Val Asp Phe Leu Asp Arg Val His Lys Ala Glu Leu Lys
355 360 365
Leu Arg Ser Lys Asn Leu Trp Glu Val Pro His Pro Trp Leu Asn Leu
370 375 380
Phe Val Pro Lys Ser Arg Ile Ser Asp Phe Asp Lys Gly Val Phe Lys
385 390 395 400
Gly Ile Leu Gly Asn Lys Thr Ser Gly Pro Ile Leu Ile Tyr Pro Met
405 410 415
Asn Lys Asp Lys Trp Asp Glu Arg Ser Ser Ala Val Thr Pro Asp Glu
420 425 430
Glu Val Phe Tyr Leu Val Ala Leu Leu Arg Ser Ala Leu Thr Asp Gly
CROP005PCT2.ST25.txt
435 440 445
Glu Glu Thr Gln Lys Leu Glu Tyr Leu Lys Asp Gln Asn Arg Arg Ile
450 455460
Leu Glu Phe Cys Glu Gln Ala Lys Ile Asn Val Lys Gln Tyr Leu Pro
465 470 475 480
His His Ala Thr Gln Glu Glu Trp Val Ala His Phe Gly Asp Lys Trp
485 490 495
Asp Arg Phe Arg Ser Leu Lys Ala Glu Phe Asp Pro Arg His Ile Leu
500 505 510
Ala Thr Gly Gln Arg Ile Phe Gln Asn Pro Ser Leu Ser Leu Phe Pro
515 520 525
Pro Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ala Ala Ser Trp
530 535
<210>36
<211>842
<212>DNA
<213>拟南芥
<400>36
aagcttaaat gacaatttag taccttgggt tggtcatgat ttagagcgga acaaatatac 60
catacatcaa acgaggatat acagagaaaa ttcatggaag tatggaattt agaggacaat 120
ttctcttctg ggctacaacg gaccggccca ttcgctcatt tacccagagg tatcgagttt 180
gtggactttt gatgccgcta gagactattg gcatcggatt gaaaaaaatg tttacttcgt 240
tgttaacaat tttctgaatg caatattttc cttgtcatga atatttaaac ttgttattac 300
tttcttttag cttaggtgtg gacaattatg gagtttactt caaacgagga agaatcttaa 360
acgctcggtt caggtctcga aaacaaacca actcacaatc ctgacttaat tgaggaaaac 420
aatgcaaaac cacatgcatg cttccatatt tctatcataa tcttataaga aaaaacacta 480
ctaagtgaaa tgattctgta tatatataac caatgccttt tgttttgtga tattttatgt 540
atatataact attgactttt gtcatctatg gatagtgtct cgggctcttg gcaaacatat 600
ttcaaagaaa agttaatgac tgtaattaat taatctgaag ctagaaacag aaccccgagg 660
taaaagaaaa agacagagca catgaagttt agtactttta tatatttaat atatcattct 720
ttcttattgc ttatctctaa agcaaaaact tccctaaacc ctaagccaaa ggactcagat 780
cgatgcagaa ccaagaaggc ttgttttgga tttgagagcc aaatgcaaag aaaaaaactc 840
tt84权利要求
1、一种刺激根生长或增加侧根或不定根形成或改变根向地性的方法，该方法包括增加植物或植物部分中植物细胞分裂素氧化酶或其它蛋白质的水平，所述其它蛋白质降低植物或植物部分中活性细胞分裂素的水平。
2、一种刺激根生长或增加侧根或不定根形成或改变根向地性的方法，该方法包括表达编码植物细胞分裂素氧化酶的核酸，所述核酸选自
(a)包含SEQ ID NOs27，1，3，5，7，9，11，25，26，28到31，33或34任一个或其互补序列中给出的DNA序列的核酸，
(b)包含与SEQ ID NOs27，1，3，5，7，9，11，25，26，28到31，33或34任一个或其互补序列对应的RNA序列的核酸，
(c)与SEQ ID NOs27，1，3，5，7，9，11，25，26，28到31，33或34任一个或其互补序列特异性杂交的核酸，
(d)编码包含SEQ ID NOs2，4，6，8，10，12，32或35任一个中给出的氨基酸序列的蛋白质的核酸或其互补序列，
(e)如(a)到(d)中任何一个所定义的核酸，其特征在于所述核酸是DNA，基因组DNA，cDNA，合成DNA或其中用U置换T的RNA。
(f)由于遗传密码的原因，与SEQ ID NOs27，1，3，5，7，9，11，25，26，28到31，33或34任一个中给出的核酸简并或者与(a)到(e)任一个所定义的核酸简并的核酸，
(g)由于生物间密码子使用的差异，与编码SEQ ID NOs2，4，6，8，10，12或35任一个中给出的蛋白质的核酸不同或与如(a)到(e)任一个中所定义的核酸不同的核酸，
(h)由于等位基因间的差异，与编码如SEQ ID NOs2，4，6，8，10，12或35中给出蛋白质的核酸或者如(a)到(e)中所定义的核酸不同的核酸，
(i)编码SEQ ID NOs2，4，6，8，10，12或35任一个中给出的蛋白质的核酸，
(j)在(a)到(i)任一个中所定义的核酸具有细胞分裂素氧化酶生物活性的功能性片段，以及
(k)编码植物细胞分裂素氧化酶的核酸，
或者包括表达，优选在根中表达，如下核酸，所述核酸编码降低植物或植物部分中活性细胞分裂素水平的蛋白质。
3、编码具有细胞分裂素氧化酶活性的植物蛋白质的分离的核酸，所述核酸选自
(a)包含SEQ ID NOs29，3，5，9，26，27，31，33或34任一个或其互补序列中给出的DNA序列的核酸，
(b)包含与SEQ ID NOs29，3，5，9，26，27，31，33或34任一个或其互补序列对应的RNA序列的核酸，
(c)与SEQ ID NOs29，3，5，9，26，27，31，33或34任一个或其互补序列中给出的核酸特异性杂交的核酸，
(d)编码具有如下氨基酸序列的蛋白质的核酸，所述氨基酸序列包含在SEQ ID NO32中给出的多肽，并且该氨基酸序列与SEQ ID NO4中给出的氨基酸序列至少70％相似，
(e)编码具有如下氨基酸序列的蛋白质的核酸，该氨基酸序列与在SEQ ID NO6中给出的氨基酸序列至少47％相似，
(f)编码具有如下氨基酸序列的蛋白质的核酸，该氨基酸序列与在SEQ ID NO10或35中给出的氨基酸序列至少47％相似，
(g)编码包含SEQ ID NOs4，6，10，32或35任一个中给出的氨基酸序列的蛋白质的核酸，
(h)由于遗传密码的原因，与SEQ ID NOs29，3，5，9，26，27，33或34任一个中给出的核酸简并的或者与(a)到(g)任一个中所定义核酸简并的核酸，
(i)由于生物间密码子使用的差异，与编码SEQ ID NOs4，6，10或35任一个中给出的蛋白质的核酸不同或与在(a)到(g)任一个中所定义核酸不同的核酸，
(j)由于等位基因间的差异，与编码在SEQ ID NOs4，6，10或35中给出的蛋白质的核酸，或在(a)到(g)中所定义的核酸不同的核酸，
(k)核酸，其编码SEQ ID NOs29，3，5，9，26，27，31，33或34任一个中给出的核酸编码的细胞分裂素氧化酶的免疫活性片段，或者在(a)到(j)任一个中所定义的核酸的免疫活性片段，
(l)核酸，其编码SEQ ID NOs29，3，5，9，26，27，31，33或34任一个中给出的核酸编码的细胞分裂素氧化酶的功能性片段，或者如在(a)到(j)任一个中所定义的核酸的功能性片段，其中所述片段具有细胞分裂素生物学活性，和
(m)编码在SEQ ID NOs4，6，10或35中所定义蛋白质的核酸，条件是所述核酸不是如下面任何一个Genbank记录号所存放的核酸AC005917，AB024035和AC023754。
4、如权利要求3所述分离的核酸，其是DNA、cDNA、基因组DNA或合成DNA、或其中用U置换T的RNA。
5、与权利要求3或4所述核酸特异性杂交的至少15个核苷酸长的核酸分子。
6、特异性扩增权利要求3或4所述核酸的至少15个核苷酸长的核酸分子。
7、包含权利要求3或4所述核酸的载体。
8、如权利要求7所述的载体，其是表达载体，其中核酸可操作地连接一个或多个使得所述核酸在原核生物宿主细胞中表达的控制序列。
9、如权利要求7所述的载体，其是表达载体，其中核酸可操作地连接一个或多个使得所述核酸在真核生物宿主细胞中表达的控制序列。
10、包含权利要求3或4所述核酸的宿主细胞。
11、包含权利要求7所述载体的宿主细胞。
12、包含权利要求8所述载体的宿主细胞。
13、包含权利要求9所述载体的宿主细胞。
14、如权利要求10所述的宿主细胞，其中宿主细胞是细菌、昆虫、真菌、植物或动物细胞。
15、如权利要求11所述的宿主细胞，其中宿主细胞是细菌、昆虫、真菌、植物或动物细胞。
16、如权利要求12所述的宿主细胞，其中宿主细胞是细菌细胞。
17、如权利要求13所述的宿主细胞，其中宿主细胞是昆虫、真菌、植物或动物细胞。
18、权利要求3或4所述核酸编码的分离的多肽，或其同系物或衍生物，或其免疫活性或功能性片段。
19、如权利要求18所述的多肽，包含SEQ ID NOs4，6，10或35任一个中所述氨基酸序列，或其同系物或衍生物，或其免疫活性或功能性片段。
20、一种产生具有细胞分裂素氧化酶活性的多肽的方法，该方法包括在使得该多肽表达的条件下培养权利要求11所述的宿主细胞，和从培养物回收产生的多肽。
21、一种产生具有细胞分裂素氧化酶活性的多肽的方法，该方法包括在使得该多肽表达的条件下培养权利要求12所述的宿主细胞，和从培养物回收产生的多肽。
22、一种产生具有细胞分裂素氧化酶活性的多肽的方法，该方法包括在使得该多肽表达的条件下培养权利要求13所述的宿主细胞，和从培养物回收产生的多肽。
23、特异性识别权利要求18所述多肽或其特定表位的抗体。
24、特异性识别权利要求19所述多肽或其特定表位的抗体。
25、产生转基因植物、植物细胞或植物组织的方法，包括以可表达形式或载体在其中引入权利要求3或4所述核酸。
26、产生改变的植物、植物细胞或植物组织的方法，包括将权利要求18所述多肽直接引入所述植物的细胞、组织或器官中。
27、产生改变的植物、植物细胞或植物组织的方法，包括将权利要求19所述多肽直接引入所述植物的细胞、组织或器官中。
28、实现权利要求18所述多肽表达的方法，包括向植物细胞基因组中稳定引入编码所述多肽的核酸或包含编码所述多肽的核酸的载体，其中所述核酸可操作地与一个或多个控制序列连接。
29、实现权利要求19所述多肽表达的方法，包括向植物细胞基因组中稳定引入编码所述多肽的核酸或包含编码所述多肽的核酸的载体，其中所述核酸可操作地与一个或多个控制序列连接。
30、如权利要求25所述的方法，还包括从所述植物细胞再生植物。
31、如权利要求28所述的方法，还包括从所述植物细胞再生植物。
32、如权利要求29所述的方法，还包括从所述植物细胞再生植物。
33、包含权利要求3或4所述核酸的转基因植物细胞，所述核酸可操作地与使得所述核酸在植物细胞或转基因植物细胞中转录和/或表达的调节元件连接。
34、如权利要求33所述的转基因植物细胞，其中所述核酸稳定地整合进入所述植物细胞基因组中。
35、包含权利要求33所述植物细胞的转基因植物、植物部分或植物组织。
36、包含权利要求34所述植物细胞的转基因植物、植物部分或植物组织。
37、权利要求35所述植物的可收获部分。
38、权利要求36所述植物的可收获部分。
39、权利要求37所述植物的可收获部分，其选自种子、叶、果实、茎培养物、根茎、根、块茎和鳞茎。
40、权利要求38所述植物的可收获部分，其选自种子、叶、果实、茎培养物、根茎、根、块茎和鳞茎。
41、来源于权利要求35所述植物或植物部分的后代。
42、来源于权利要求36所述植物或植物部分的后代。
43、一种刺激根生长的方法，包括权利要求3或4所述核酸的表达，或者包括降低植物或植物部分中活性细胞分裂素水平的另一种蛋白质的表达。
44、一种增加侧根或不定根形成的方法，包括权利要求3或4所述核酸的表达，或者包括降低植物或植物部分中活性细胞分裂素水平的另一种蛋白质的表达。
45、一种改变根向地性的方法，包括改变权利要求3或4所述核酸的表达，或者包括降低植物或植物部分中活性细胞分裂素水平的另一种蛋白质的表达。
46、如权利要求43所述方法，其中所述方法引起产量的增加。
47、如权利要求44所述方法，其中所述方法引起产量的增加。
48、如权利要求45所述方法，其中所述方法引起产量的增加。
49、如权利要求43所述的方法，其中在强组成型启动子控制下发生所述核酸的所述表达。
50、如权利要求44所述的方法，其中在强组成型启动子控制下发生所述核酸的所述表达。
51、如权利要求45所述的方法，其中在强组成型启动子控制下发生所述核酸的所述表达。
52、如权利要求43所述的方法，其中在优先在根中表达的启动子控制下发生所述核酸的所述表达。
53、如权利要求44所述的方法，其中在优先在根中表达的启动子控制下发生所述核酸的所述表达。
54、如权利要求45所述的方法，其中在优先在根中表达的启动子控制下发生所述核酸的所述表达。
55、鉴定和获得与权利要求18所述多肽相互作用的蛋白质的方法，包括利用权利要求18所述多肽的筛选测定法。
56、鉴定和获得与权利要求19所述多肽相互作用的蛋白质的方法，包括利用权利要求19所述多肽的筛选测定法。
57、如权利要求55所述的方法，包括双杂交筛选测定法，其中利用权利要求18所述多肽做为饵，cDNA文库做为捕获物。
58、如权利要求56所述的方法，包括双杂交筛选测定法，其中利用权利要求19所述多肽做为饵，cDNA文库做为捕获物。
59、一种调节权利要求18所述多肽和通过筛选测定法可获得的相互作用的蛋白质伴侣之间相互作用的方法，其中利用所述多肽。
60、一种调节权利要求19所述多肽和通过筛选测定法可获得的相互作用的蛋白质伴侣之间相互作用的方法，其中利用所述多肽。
61、一种鉴定和获得与权利要求18所述多肽相互作用的化合物的方法，包括步骤
(a)提供双杂交系统，其中表达权利要求18所述多肽和通过权利要求55所述方法可获得的相互作用的蛋白质伴侣，
(b)将所述化合物和a)中所定义的表达多肽形成的复合物相互作用，
(c)进行所述化合物与所述多肽或a)中所定义的表达多肽形成的复合物相互作用的测定。
62、一种鉴定和获得与权利要求19所述多肽相互作用的化合物的方法，包括步骤
(a)提供双杂交系统，其中表达权利要求19所述多肽和通过权利要求56所述方法可获得的相互作用的蛋白质伴侣，
(b)将所述化合物和a)中所定义的表达多肽形成的复合物相互作用，
(c)进行所述化合物与所述多肽或a)中所定义的表达多肽形成的复合物相互作用的测定。
63、一种鉴定与权利要求18所述多肽特异性结合的化合物或化合物混合物的方法，包括
(a)在适于允许复合物形成的条件下，将所述化合物或化合物混合物和权利要求18所述多肽合并，和
(b)检测复合物形成，其中复合物存在鉴定了特异性结合所述多肽的化合物或混合物。
64、一种鉴定与权利要求19所述多肽特异性结合的化合物或化合物混合物的方法，包括
(a)在适于允许复合物形成的条件下，将所述化合物或化合物混合物和权利要求19所述多肽合并，和
(b)检测复合物形成，其中复合物存在鉴定了特异性结合所述多肽的化合物或混合物。
65.如权利要求61所述的方法，其中所述化合物抑制所述多肽的活性，并且可以用于化学试剂的合理设计。
66.如权利要求62所述的方法，其中所述化合物抑制所述多肽的活性，并且可以用于化学试剂的合理设计。
67.如权利要求63所述的方法，其中所述化合物或化合物混合物抑制所述多肽的活性，并且可以用于化学试剂的合理设计。
68.如权利要求64所述的方法，其中所述化合物或化合物混合物抑制所述多肽的活性，并且可以用于化学试剂的合理设计。
69.一种产生植物生长调节剂或除草剂组合物的方法，包括权利要求55所述方法的步骤和以适于应用在农业或植物细胞或组织培养中的形式配制从所述步骤获得的化合物。
70.一种产生植物生长调节剂或除草剂组合物的方法，包括权利要求56所述方法的步骤和以适于应用在农业或植物细胞或组织培养中的形式配制从所述步骤获得的化合物。
71.一种产生植物生长调节剂或除草剂组合物的方法，包括权利要求57所述方法的步骤和以适于应用在农业或植物细胞或组织培养中的形式配制从所述步骤获得的化合物。
72.一种产生植物生长调节剂或除草剂组合物的方法，包括权利要求58所述方法的步骤和以适于应用在农业或植物细胞或组织培养中的形式配制从所述步骤获得的化合物。
73.一种产生植物生长调节剂或除草剂组合物的方法，包括权利要求59所述方法的步骤和以适于应用在农业或植物细胞或组织培养中的形式配制从所述步骤获得的化合物。
74.一种产生植物生长调节剂或除草剂组合物的方法，包括权利要求60所述方法的步骤和以适于应用在农业或植物细胞或组织培养中的形式配制从所述步骤获得的化合物。
75.一种产生植物生长调节剂或除草剂组合物的方法，包括权利要求61所述方法的步骤和以适于应用在农业或植物细胞或组织培养中的形式配制从所述步骤获得的化合物。
76.一种产生植物生长调节剂或除草剂组合物的方法，包括权利要求62所述方法的步骤和以适于应用在农业或植物细胞或组织培养中的形式配制从所述步骤获得的化合物。
77.一种产生植物生长调节剂或除草剂组合物的方法，包括权利要求63所述方法的步骤和以适于应用在农业或植物细胞或组织培养中的形式配制从所述步骤获得的化合物。
78.一种产生植物生长调节剂或除草剂组合物的方法，包括权利要求64所述方法的步骤和以适于应用在农业或植物细胞或组织培养中的形式配制从所述步骤获得的化合物。
79.包含权利要求3或4所述核酸分子的诊断组合物。
80.包含权利要求7所述载体的诊断组合物。
81.包含权利要求8所述载体的诊断组合物。
82.包含权利要求18所述多肽的诊断组合物。
83.包含权利要求19所述多肽的诊断组合物。
84.包含权利要求23所述抗体的诊断组合物。
85.包含权利要求24所述抗体的诊断组合物。
86.一种增加根分生组织大小的方法，包括表达权利要求3或4所述核酸或者权利要求2中定义的核酸，或者包括表达编码降低植物或植物部分，优选根中活性细胞分裂素水平的蛋白质的核酸。
87.一种增加根大小的方法，包括表达权利要求3或4所述核酸或者权利要求2中定义的核酸，或者包括表达编码降低植物或植物部分，优选根中活性细胞分裂素水平的蛋白质的另一种核酸。
88.一种增加枝条分生组织大小的方法，包括优选在枝条中下调权利要求3或4所述核酸，或权利要求2中定义的核酸的表达。
89.一种延迟叶衰老的方法，包括优选在开始衰老的叶中下调权利要求3或4所述核酸，或权利要求2中定义的核酸的表达。
90.一种改变叶衰老的方法，包括在开始衰老的叶中表达权利要求3或4所述核酸，或权利要求2中定义的核酸。
91.一种增加叶厚度的方法，包括表达权利要求3或4所述核酸，或权利要求2中定义的核酸，或者包括表达编码降低植物或植物部分中活性细胞分裂素水平的蛋白质的核酸。
92.一种减小导管大小的方法，包括表达权利要求3或4所述核酸，或权利要求2中定义的核酸，或者包括表达编码降低植物或植物部分中活性细胞分裂素水平的蛋白质的核酸。
93.一种增加导管大小的方法，包括在植物或植物部分中下调权利要求3或4所述核酸，或权利要求2中定义的核酸的表达。
94.一种诱导单性结实的方法，包括权利要求3或4所述核酸，或权利要求2中定义的核酸的表达，或者包括编码降低植物或植物部分中，优选胎座、胚珠和由它们衍生的组织中活性细胞分裂素水平的蛋白质的核酸的表达。
95.一种改进幼苗直立性的方法，包括权利要求3或4所述核酸，或权利要求2中定义的核酸的表达，或者包括编码降低幼苗中，优选幼苗根中活性细胞分裂素水平的蛋白质的核酸的表达。
96.一种增加分枝的方法，包括在植物或植物部分中表达权利要求3或4所述核酸，或权利要求2中定义的核酸。
97.一种改进倒伏抗性的方法，包括在植物或植物部分中，优选茎或腋芽中权利要求3或4所述核酸，或权利要求2中定义的核酸的表达。
98.包含过量表达植物细胞分裂素氧化酶的转基因砧木的转基因植物。
99.权利要求98所述转基因植物，还包含接穗。
100.权利要求98或99所述植物的可收获部分。
101.刺激根生长和发育的方法，包括在转基因植物细胞或组织培养物中编码植物细胞分裂素氧化酶的核酸的表达。
102.如权利要求61所述的方法，其中所述核酸是权利要求3所述的或权利要求2中定义的核酸中的至少一个。
103.一种增加种子大小或重量的方法，包括增加植物中细胞分裂素氧化酶的水平或活性，或者增加降低植物或植物部分，优选种子中活性细胞分裂素水平的蛋白质的水平或活性。
104.一种增加胚大小或重量的方法，包括增加植物中细胞分裂素氧化酶的水平或活性，或者增加降低植物或植物部分，优选胚中活性细胞分裂素水平的蛋白质的水平或活性。
105.一种增加子叶大小的方法，包括增加植物中细胞分裂素氧化酶的水平或活性，或者增加降低植物或植物部分，优选子叶中活性细胞分裂素水平的蛋白质的水平或活性。
106.一种增加种子大小或重量的方法，包括权利要求3或4所述核酸，或权利要求2中定义的核酸的表达，或者包括编码降低植物或植物部分，优选种子中活性细胞分裂素水平的蛋白质的核酸的表达。
107.一种增加胚大小或重量的方法，包括权利要求3或4所述核酸，或权利要求2中定义的核酸的表达，或者包括编码降低植物或植物部分，优选胚中活性细胞分裂素水平的蛋白质的核酸的表达。
108.一种增加子叶大小的方法，包括权利要求3或4所述核酸，或权利要求2中定义的核酸的表达，或者包括编码降低植物或植物部分，优选子叶中活性细胞分裂素水平的蛋白质的核酸的表达。
109.如权利要求106所述的方法，其中核酸受启动子控制，该启动子控制优先在种子中表达。
110.如权利要求107所述的方法，其中核酸受启动子控制，该启动子控制优先在胚中表达。
111.如权利要求108所述的方法，其中核酸受启动子控制，该启动子控制优先在子叶中表达。
112.如权利要求109所述的方法，其中启动子还对胚乳或糊粉是特异的。
113.如权利要求106所述的方法，其中所述方法引起产量的增加。
114.如权利要求106所述的方法，其中所述方法引起了幼苗生长的增加或早期活力的增加。
115.如权利要求107所述的方法，其中所述方法引起产量的增加。
116.如权利要求107所述的方法，其中所述方法引起了幼苗生长的增加或早期活力的增加。
117.如权利要求108所述的方法，其中所述方法引起产量的增加。
118.如权利要求108所述的方法，其中所述方法引起了幼苗生长的增加或早期活力的增加。
119.如权利要求114所述的方法，其中幼苗生长或早期活力的增加与增加的胁迫耐受性有关。
120.如权利要求116所述的方法，其中幼苗生长或早期活力的增加与增加的胁迫耐受性有关。
121.如权利要求118所述的方法，其中幼苗生长或早期活力的增加与增加的胁迫耐受性有关。
122.一种增加植物中种子大小或重量的方法，该方法包括SEQ IDNOs1，5，25，或27任一个所示核酸或所述核酸的直向同源物的表达，其中所述直向同源物对该植物物种是特异的。
123.一种增加植物中胚大小或重量的方法，该方法包括SEQ ID NOs1，5，25，或27任一个所示核酸或所述核酸的直向同源物的表达，其中所述直向同源物对该植物物种是特异的。
124.一种增加植物中子叶大小的方法，该方法包括SEQ ID NOs1，5，25，或27任一个所示核酸或所述核酸的直向同源物的表达，其中所述直向同源物对该植物物种是特异的。
125.如权利要求122所述的方法，其中核酸受启动子控制，该启动子控制优先在种子中表达。
126.如权利要求123所述的方法，其中核酸受启动子控制，该启动子控制优先在胚中表达。
127.如权利要求124所述的方法，其中核酸受启动子控制，该启动子控制优先在子叶中表达。
128.如权利要求125所述的方法，其中启动子还对胚乳或糊粉是特异的。
129.如权利要求122所述的方法，其中所述方法引起产量的增加。
130.如权利要求122所述的方法，其中所述方法引起了幼苗生长的增加或早期活力的增加。
131.如权利要求123所述的方法，其中所述方法引起产量的增加。
132.如权利要求123所述的方法，其中所述方法引起了幼苗生长的增加或早期活力的增加。
133.如权利要求124所述的方法，其中所述方法引起产量的增加。
134.如权利要求124所述的方法，其中所述方法引起了幼苗生长的增加或早期活力的增加。
135.如权利要求130所述的方法，其中幼苗生长或早期活力的增加与增加的胁迫耐受性有关。
136.如权利要求132所述的方法，其中幼苗生长或早期活力的增加与增加的胁迫耐受性有关。
137.如权利要求134所述的方法，其中幼苗生长或早期活力的增加与增加的胁迫耐受性有关。
全文摘要
本发明涉及刺激根生长和/或增加侧根和/或不定根形成和/或改变根向地性的方法，该方法包括在植物或植物部分中植物细胞分裂素氧化酶的表达。本发明也提供了增加种子大小和/或重量，胚大小和/或重量，子叶大小和/或重量的方法。该方法包括植物细胞分裂素氧化酶的表达或降低植物或植物部分中活性细胞分裂素水平的另一种蛋白质的表达。本发明也涉及新的植物细胞分裂素氧化酶蛋白质，编码细胞分裂素氧化酶蛋白质的核酸序列及包含所述序列的载体，宿主细胞、转基因细胞和植物。本发明也涉及所述序列用于改进根相关特性，包括增加产量和/或增强早期活力和/或修饰根冠比和/或改进倒伏抗性和/或增加干旱耐受性和/或促进外植体体外繁殖和/或修饰细胞命运和/或植物发育和/或植物形态学和/或植物生物化学和/或植物生理学的用途。本发明也涉及所述序列在上述方法中的用途。本发明也涉及鉴定和获得与细胞分裂素氧化酶蛋白质相互作用的蛋白质和化合物的方法。本发明还涉及所述化合物做为植物生长调节剂或除草剂的用途。
文档编号G01N33/50GK1650016SQ0282669
公开日2005年8月3日 申请日期2002年12月10日 优先权日2001年12月10日
发明者托马斯·施穆林, 托马斯·维尔纳 申请人:托马斯·施穆林, 托马斯·维尔纳