专利名称：：具有改进形态发生的植物及其制备方法
技术领域：
：本发明涉及具有各种不同类型的改进形态发生的植物，尤其涉及在形态发生上具有改进茎、叶、花、子房(荚，果实)和种子的植物。本发明进一步涉及这种植物的制备方法。
背景技术：
：植物适合根的各种不同类型的环境因子。例如，植物随生长和发育的环境具有变形能力。一旦植物落地生根，如果该地方的环境对此植物不适合，由于植物不能移动，所以只能通过改变其自身的形状来适合和继续生长和发育。变形能力对植物生存是必要条件。为了改进各种不同类型的形态发生修饰，已经实施了杂交，利用最近的遗传工程技术进行繁殖以及利用植物激素和植物调节剂功能的方法。为了了解植物形态发生和形态修饰的控制机理，利用阿拉伯芥(Arabidopsisthaliana)已经进行众多研究。有报道LEAFY(LFY)，APETALA1(AP1)，AGAMOUS(AG)，SUPERMAN(SUP)和FIL(FIL)为参与花形成的基因。有报道TCH4和dbp等为参与茎形成的基因。有报道LAN1和MAC为参与叶形成的基因。有报道ttg，g12，CPC和IRE为参与根形成的基因。利用遗传工程技术己经创造了具有改进形态修饰和形态发生的植物。有报道通过导入具有锌指基元的转录因子(PetSPL3)带来矮牵牛花的形态变化(日本未审专利公开No.262390/1999)。有报道通过导入CPC基因或IRE基因带来阿拉伯芥根的形态变化(日本未审专利公开No.4978/1998和270873/2000)。然而，其中这些基因已被转基因修饰的大多数植物实际上一直未获得具有工业实用性的足够效果，因此目前还未达到实用水平。多胺为具有2个或多个伯胺基团的脂肪族烃的总称，在生物体中是遍在的自然物质，迄今已发现20多种。典型的多胺包括腐胺，亚精胺和精胺。已知多胺的主要生理作用包括(1)通过与核酸相互作用导致核酸稳定和结构修饰；(2)促进各种不同核酸合成系统；(3)活化蛋白合成系统；以及(4)稳定细胞膜和增强物质的细胞膜通透性。多胺在植物中的作用的报道包括在细胞生长或分裂过程中细胞保护和促进核酸或蛋白生物合成。最近，多胺参与各种类型的环境应激已引起关注。对形态修饰和多胺涉及体细胞胚胎发生和偶生的根形成有若干报道。例如，已经证实多胺促进下列植物的体细胞胚胎发生胡萝卜(Planta，162,532,1984，Science,223,1433，1984)，燕麦(PlantGrowthReg"3,329，1985)，大白菜(PlantSci.，56，167,1988)，和矮牵牛花(PlantSci.，62,123,1989)，并且促进绿豆中偶生的根形成(Physiol.Plant"64,53,1985，PlantCellPhysiol"24，677，1983)。迄今为止，对多胺参与花，茎，叶和子房的形态发生几乎没有任何报道。已知多胺代谢相关的酶涉及植物多胺的生物合成，包括精氨酸脱羧酶(ADC)，鸟氨酸脱羧酶(ODC)，S-腺苷甲硫氨酸脱羧酶(SAMDC)，亚精胺合酶(SPDS)和精胺合酶(SPMS)。若干编码这种多胺代谢相关酶的多胺代谢相关酶基因已经从植物中分离。ADC基因已经从下列植物中分离燕麦(Mol.Gen.Genet"224，431-436(1990))，西红柿(PlantPhysio.,103，829-834(1993))，阿拉伯芥(PlantPhysiol"111,1077-1083(1996))，和豌豆(PlantMol.Biol.,28,997-1009(1995));ODC基因已经从曼陀罗中分离(Biochem.J"314，241-248(1996));SAMDC基因已经从下列植物中分离土豆(PlantMol.Biol.，26，327-338(1994))，菠菜(PlantPhysiol.,107,1461-1462(1995))，以及烟草；SPDS基因已经从阿拉伯芥中分离(PlantCellPhysiol.,39(1)，73-79(1998))。因此，本发明的目的是通过人工控制多胺代谢相关酶基因的表达以及通过改变多胺的水平来制备具有各种类型的改进形态发生的重组植物。附图简述图1示出含有多胺代谢相关酶基因的表达构建体的结构；图2示出黑子南瓜(CucurbitaficifoliaBouche)SPDS基因在转化子中表达的结果。图2中，1.野生型(WT);2.转化子(TSP-14);3.转化子(TSP-15);4.转化子(TSP-16);5.转化子(TSP-17);6.转化子(TSP-19);图3示出野生型植物和导入了多胺代谢相关酶基因的植物中茎的数目的比较；图4的照片示出野生型植物和导入了多胺代谢相关酶基因的植物中茎、叶、花、子房和种子的数目的比较；图5的图表示出野生型植物和导入了多胺代谢相关酶基因的植物中主茎的数目的比较；图6的图表示出野生型植物和导入了多胺代谢相关酶基因的植物中侧茎的数目的比较；图7的图表示出野生型植物和导入了多胺代谢相关酶基因的植物的花期的比较；图8示出表达外源基因的每个单株的花朵数随时间变化的测定结果；以及图9示出表达外源基因的每个单株的花朵数随时间变化的测定结果。发明公开经过广泛研究，结果实现了上述目的，本发明人发现，当参与多胺生物代谢的多胺代谢相关酶基因被分离，导入并在植物中过表达，从而通过操纵多胺代谢给多胺水平带来变化时，形态发生的各种参数，诸如茎、叶、花、子房(荚，果实)和种子(胚珠)得以改进。多胺是每个分子含有许多胺的碱性物质，典型的例子包括二胺腐胺，三胺亚精胺和四胺精胺。参与这种多胺的生物合成的多胺代谢相关酶的例子包括腐胺的ADC和ODC，亚精胺的SAMDC和SPDS，以及精胺的SAMDC和SPMS。编码这种多胺代谢相关酶的多胺代谢相关酶基因已经在若干植物中分离出来。此外，一些多胺代谢相关酶基因整合在植物中。然而，对所得转基因植物的茎、叶、花、子房和种子的形态发生的改进还没有报道。如上所述，作为广泛研究的结果是改进植物的形态发生，本发明人发现，多胺亚精胺和精胺的含量对植物的形态发生是尤其重要的。本发明人真正从植物组织中分离和鉴定出了参与亚精胺和精胺生物合成的多胺代谢相关酶基因(SPDS，SAMDC，ADC)。本发明人在下列发现的基础上实施了本发明在植物中导入和过表达这些基因通过操纵多胺代谢给多胺水平带来了变化，导致茎、叶、花、子房(荚、果实)和种子(胚珠)的各种形态发生参数的改进。本发明旨在提供下列主要方面1.植物及其子代，其稳定地保留至少一种核酸序列，所述核酸序列在一种或多种能够在植物中起作用的启动子控制下调节一种或多种多胺的量，以及植物及其子代与缺乏所述核酸序列的植物比较具有至少一种改进的形态发生。22.植物的制备方法，所述植物稳定地保留至少一种核酸序列，所述核酸序列在一种或多种能够在植物中起作用的启动子控制下调节一种或多种多胺的量，以及所述植物与缺乏所述核酸序列的植物比较具有改进的形态发生，所述方法包括转化缺乏所述核酸序列的植物细胞的步骤。24.植物的制备方法，所述植物与缺乏调节一种或多种多胺的量的核酸序列的植物比较具有改进的形态发生，所述方法包括用至少一种表达载体转化缺乏所述核酸序列的植物细胞的步骤，所述表达载体含有至少一种所述核酸序列，所述核酸序列在一种或多种能够在植物中起作用的启动子控制下。40.具有固定特征的植物的制备方法，所述植物是调节一种或多种多胺的量的核酸序列的纯合体，以及所述植物与缺乏所述核酸序列的植物比较具有改进的形态发生，所述方法包括下列步骤(1)用至少一种表达载体转化缺乏所述核酸序列的植物细胞，所述表达载体含有至少一种所述核酸序列，所述核酸序列在一种或多种能够在植物中起作用的启动子控制下；(2)从转化细胞中再生与缺乏所述核酸序列的植物比较具有改进的形态发生的植物；(3)从植物体收集通过授粉获得的种子；以及(4)从植物体分析通过授粉获得的种子中的核酸序列，所述植物体通过培育种子而获得，以挑选核酸序列的纯合体。41.具有固定特征的愈伤组织的制备方法，所述愈伤组织是调节一种或多种多胺的量的核酸序列的纯合体，以及所述愈伤组织与缺乏所述核酸序列的植物比较具有改进的形态发生，所述方法包括下列步骤(1)用至少一种表达载体转化缺乏所述核酸序列的植物细胞，所述表达载体含有至少一种所述核酸序列的抑制剂，所述核酸序列在一种或多种能够在植物中起作用的启动子控制下；以及(2)从转化细胞中诱导愈伤组织。根据本发明，"器官"表示所有植物的器官(组织)，并且表示例如，茎、块茎、叶、根、块状根、芽、花、花瓣、子房、果实、荚、孢蒴、种子、须根和胚珠等。涉及器官(组织)的形式的特征可属于数量、生长和发育周期、形状、颜色、特性和特征等。因为多胺的表达量密切相关于器官的数量，多胺的增加促进了叶、花、果实、根、块茎、块状根、荚和孢蒴的开始并延迟了上述器官的结束，这些特征可加以评价和享有一段延长的期间。多胺在植物中通过本发明所获得的表达量可增加，而不受生长环境(例如环境压力)的影响，并且可改进形态发生。外源多胺代谢相关酶基因或内源多胺代谢相关酶基因的抑制剂可被引作调节多胺量的核酸序列。外源多胺代谢相关酶基因增加多胺在植物中的量，而内源多胺代谢相关酶基因的抑制剂减少多胺在植物中的量。对本发明而言，"不具有核酸序列调节多胺的量的植物"表示所有在基因组中不具有核酸序列(例如，外源多胺代谢相关酶基因或内源多胺代谢相关酶基因的抑制剂)的植物。结果，除了野生型种以外，该术语包括通过普通杂交建立的栽培变种，天然或人工变体，以及其中已经导入除了多胺代谢相关酶基因外的外源基因的转基因植物。本发明的"多胺"指的是在生物体中遍在的共同天然物质，并且是含有两个或多个伯胺基团的脂肪族烃化合物。例子包括1，3-二氨基丙垸，腐胺，尸胺，去甲亚精胺，亚精胺，同型亚精胺，氨基丙基尸胺，thermine(去甲精胺)，精胺，热精胺(thermospermine)，刀豆四胺(canavalmine)，氨基戊基去甲亚精胺，N,N-双(氨基丙基)尸胺，同型精胺，caldopentamine，homocaldopentamine，caldohexamine禾口homocaldohexamine。多胺代谢相关酶基因如本发明所用，"多胺代谢相关酶基因"是编码参与植物中多胺生物合成的酶的氨基酸的基因。据认为涉及并且是限速的例子包括典型的多胺腐胺的精氨酸脱羧酶(ADC)和鸟氨酸脱羧酶(ODC)基因，亚精胺的S-腺苷甲硫氨酸脱羧酶(SAMDC)和亚精胺合酶(SPDS)基因，以及精胺的S-腺苷甲硫氨酸脱羧酶(SAMDC)和精胺合酶(SPMS)基因。精氨酸脱羧酶(ADC:EC4丄1.19.)催化从L-精氨酸生产agmatine和二氧化碳的反应。鸟氨酸脱羧酶(ODC:EC4丄1.17.)催化从L-鸟氨酸生产尸胺和二氧化碳的反应。S-腺苷甲硫氨酸脱羧酶(SAMDC:EC4丄1.50.)催化从S-腺苷甲硫氨酸生产腺苷甲基硫代丙胺的反应。亚精胺合酶(SPDS:EC2.5丄16.)催化从腐胺和腺苷甲基硫代丙胺生产亚精胺和甲基硫代腺苷的反应。这些基因中任何都可能被衍生，可从各种植物中分离。具体的例子包括双子叶植物，诸如葫芦科植物；茄科植物；芸苔科植物(Brassicaceae)，诸如阿拉伯芥；蝶形花科植物(Papilionaceae)，诸如苜蓿和豇豆(Vignaunguiculata);锦葵科植物；紫菀科植物；藜科植物和旋花科植物；或单子叶植物，诸如禾本科植物，包括水稻，小麦，大麦禾B玉米。耐旱仙人掌或松叶菊(Mesembryanthemumcrystallinum)也包括在内。优选葫芦科植物，并且尤其优选黑子南瓜。从中分离本发明的植物衍生的多胺代谢相关酶基因的植物组织可以以种子的形式或处于生长过程中。基因可从部分或全部生长植物的组织中分离。任何部分可用来分离基因，但是优选整个植物，芽，花，子房，果实，叶，茎，根等。本发明所用的多胺代谢相关酶基因的优选的例子包括亚精胺合酶基因，S-腺苷甲硫氨酸脱羧酶基因和精氨酸脱羧酶基因。具体的例子包括DNA，其具有由SEQIDNO.l中第77-1060位碱基代表的碱基序列；DNA，其具有由SEQIDN0.3中第456-1574位碱基代表的碱基序列；以及DNA，其具有由SEQIDNO.5中第541-2661位碱基代表的碱基序列。其他例子包括DNA，其具有在严格条件下能够与上述任何序列杂交的碱基序列，并且编码与这些序列具有等同的多胺代谢相关酶活性的多肽。其他例子还包括DNA，其包括具有1个或多个碱基缺失，替换，插入或添加的上述任何碱基序列，并且编码与这些序列具有等同的多胺代谢相关酶活性的多肽。本发明所指的"严格条件"表示在此条件下，只有编码与多胺代谢相关酶等同的多胺代谢相关酶活性的多肽的碱基序列(由特定多胺代谢相关酶基因序列编码)，才能与特定序列形成杂合体(称为特异杂合体)，而编码没有这种等同活性的多肽的碱基序列不与特定序列形成杂合体(称作非特异杂合体)。本领域普通技术人员通过改变在杂交反应和清洗过程中的温度，杂交反应和清洗过程中的盐浓度等，可容易选择这种条件。具体的例子包括但是不限于杂交条件为在42"C，6XSSC(0.9MNaCl,0.09M拧檬酸三钠)或6XSSPE(3MNaC1，0.2MNaH2P04，20mMEDTA-2Na，pH7.4)，以及产物用0.5XSSC在42"C下清洗。一般而言，本领域专业技术人员众所周知，在具有生物活性蛋白的氨基酸序列中替换，缺失，插入或添加一个或多个氨基酸仍可保持这些生理活性。在本发明所述的"具有1个或多个碱基缺失，替换，插入或添加的碱基序列"包括具有这种修饰并且编码多胺代谢相关酶的基因，这样的基因包括在本发明的范围内。例如，polyA尾或5',3'端非翻译区可被"缺失"，而碱基可"缺失"至一个或多个氨基酸被缺失的程度。碱基还可被替换，只要不产生读码框位移。碱基还可被"添加"到氨基酸被添加的程度。然而，重要的是这种修饰不会导致多胺代谢相关酶活性的丧失。优选"具有一个或若干个碱基缺失，替换或添加的基因"。这种修饰的DNA可通过修饰本发明的DNA碱基序列而获得，从而特定位点处的氨基酸例如，通过位点特异性突变而被替换，缺失，插入或添加(NucleicAcidResearch,Vol.10,No.20,6487-6500(1982))。在本发明中，"反义基因"是指具有与多胺代谢相关酶基因的碱基序列互补的序列的基因。反义DNA例如是互补于SEQIDNOS.l,3或5的碱基序列。反义RNA从此制备。内源多胺代谢相关酶基因的抑制剂抑制剂抑制基因的表达，但并不具体限制，并且例如包括反义DNA，或双链RNA(dsRNA)或选自上游或下游的基因或序列的RNAi。反义DNA可能互补于5'上游一侧的调节区，包括基因的内含子或外显子，或互补于基因的启动子，或终止密码子的下游一侧的区域，其影响基因表达。反义DNA的长度为至少20个碱基，优选至少100个碱基，更优选至少300个碱基，更尤其至少500个碱基。将反义DNA的转录产物与内源多胺代谢相关酶基因的mRNA杂交，或杂交于内源多胺代谢相关酶基因的非编码区(例如启动子，内含子，转录终止因子)或其上游或下游序列。RNAi包括具有与靶基因有关的有义序列和与靶基因有关的反义序列的RNA，以及所述有义序列和反义序列可分别包括在RNA的两条链上，并且用作双链RNA，或可包括在RNA的单链上，并且用作具有双链部分的单链RNA分子和连接有义和反义序列的环序列。具有改进的形态发生的植物及其子代如上所述，本发明中的"器官"表示所有植物的器官(组织)，例如包括茎，块茎，叶，根，块状根，芽，花，花瓣，子房，果实，荚，孢蒴，种子，须根和胚珠等。涉及器官(组织)形式的特征可属于数量，生长和发育期，形状，颜色，特性和特征等。本发明的"形态发生已得以改进的植物"和"已经改进形态发生的植物"指的是一种植物，其中导入了外源多胺代谢相关酶基因或内源多胺代谢相关酶基因的抑制剂以得到涉及形态发生的特征，与导入前比较，所述特征增强，改进或抑制数量，生长和发育期，形状，颜色，特性或特征。例如，通过把多胺代谢相关酶基因或其抑制剂导入植物中，与没有外源多胺代谢相关酶基因或抑制剂的植物比较，涉及茎，叶，花或种子形成的特征得以改进。然而，本发明并不限于此。具体而言，通过调节多胺量的基因序列，"茎数改进的植物"是一种植物茎(包括主茎，侧茎，花柄，躯干，枝条等)数增加的植物，以及一种基于抑制剂植物茎(包括主茎，侧茎，花柄，躯干，枝条等)数降低或减少的植物。"具有改进的叶子数的植物"是一种植物叶子数增加或降低或减少的植物。"具有改进的花朵数或花期的植物"是一种植物花朵数增加或降低或减少的植物，或一种具有植物花期提前或花期延长的植物。"具有改进的子房数或子房发育期的植物"是一种植物子房，果实，荚和孢蒴数增加或降低或减少的植物，或者一种从子房，果实，荚和孢蒴的结实到成熟的生长或发育期增加或降低或减少的植物。"具有改进的种子数的植物"是一种植物种子(包括子房)数增加或降低或减少的植物。以此方式，植物(器宫和组织等)的产品质量，生产率和收率以及产品特征的改进是可以预计的。此外，在可食用植物诸如蔬菜和水果中，减少可食用部分(叶，果实，块茎，块状根等)的多胺量可以在诸如产品质量的特征方面具有有益效果。因此，通过在这些可食用部分表达抑制剂而在其他部分表达多胺代谢相关酶基因来试图改进收率同时改进质量是可能的。此外，通过改进形态发生和改变植物的形状和形成，对各种环境压力适应性(抗性)的改进也是可以预计的。具体而言，似乎叶数和基于叶绿素的叶的绿色可以增加，根(包括块状根和块茎)可以延长，茎的数目和厚度可以增加，因此，植物的环境适应性可以增加。在一种本发明的优选实施方案中，在植物生长期间，植物外观的差异是小的(叶子是深绿色的)，但是诸如叶子，花和茎的器官的显著改进在增殖生长期是更明显的，并且这揭示植物的潜在能力(潜力)得以改进。本发明的植物不仅包括植物整体(整个植物)，还包括愈伤组织，种子，所有植物组织，叶子，茎，块茎，根，块状根，芽，花，花瓣，子房，果实，荚，胚珠和须根。它们的子代也包括在本发明的植物中。本发明中的"从植物及其子代中获得的有用物质"表示由植物及其子代产生的有用物质，其中外源多胺代谢相关酶基因的导入提供形态发生或与导入基因前比较改进形态发生。有用物质的例子包括氨基酸，油和脂，淀粉，蛋白，酚，烃，纤维素，天然胶，色素，酶，抗体，疫苗，药用品以及生物可降解塑料。本发明的植物是没有外源多胺代谢相关酶基因的植物，但其中通过基因工程导入了这种外源多胺代谢相关酶基因，并且以稳定的方式保留。如本发明所用的"以稳定的方式保留"表示多胺代谢相关酶基因在至少已导入多胺代谢相关酶基因的植物中表达，并且在植物细胞中保留足够长的时间以导致形态发生的改进。所以，多胺代谢相关酶基因优选整合在宿主植物的染色体上。一种或多种多胺代谢相关酶基因甚至应该更优选地保留在随后的后代中。如本发明所用的"外源"表示对植物不是内源性的，而是从外部导入的。因此，"外源多胺代谢相关酶基因"可以是同源于宿主植物的多胺代谢相关酶基因(即，衍生自宿主植物)，其是通过基因操作从外部导入的。根据密码子用法的同一性，优选使用宿主衍生的多胺代谢相关酶基因。采用任何基因工程的方法，可将外源多胺代谢相关酶基因导入植物中。例子包括与具有多胺代谢相关酶基因的异种植物细胞进行原生质体融合，用具有病毒基因组的植物病毒感染，所述病毒基因组经遗传操作后表达多胺代谢相关酶基因，或者利用含有多胺代谢相关酶基因的表达载体转化宿主植物细胞。本发明的植物优选为转基因植物，其制备方法是用含有在启动子控制下的外源多胺代谢相关酶基因的表达载体转化缺乏外源多胺代谢相关酶基因的植物细胞，所述启动子能够在植物中起作用。能够在植物中起作用的启动子的例子包括在植物细胞中组成型表达的花椰菜花叶病毒(CaMV)的35S启动子，仙人掌合酶基因(NOS)启动子，章鱼碱合酶基因(OCS)启动子，苯丙氨酸氨裂解酶(PAL)基因启动子，以及查耳酮合酶(CHS)基因启动子。其他众所周知的植物启动子也是可用的，不限于上述这些启动子。不仅在整个器官中组成型表达的启动子诸如35S启动子，而且特异于器官或组织的启动子都可用来仅在靶器官或组织中表达靶基因，从而在特异器官或组织中改进形态发生。例如，多胺代谢相关酶基因和能够特异于花器官起作用的启动子(诸如W099/43818，日本未审专利公开178572/1999，日本未审专利公开316582/2000)可用来改进花朵数和花期。此外，子房和果实的生长和发育的持续时间通过采用特异于子房和果实的启动子可得以改进(PlantMol.Biol"11，651-662,1988)。如果使用时间特定启动子，靶基因仅在特定时间可得以表达，并且形态发生仅在特定时期可得以改进。例如，通过采用多胺代谢相关酶基因和在植物生产期间有效的启动子，形态发生仅在植物生长期间可得以改进。根据生存环境，通过低温，高温，压力，干旱，光，热，激素，损伤等调节的启动子可用来表达靶基因。例如，多胺代谢相关酶基因和仅当植物接触低温时能够转录的启动子(诸如BN115启动子PlantPhysiol.,106，917-928(1999))可用来仅在低温下控制植物的多胺代谢以及改进形态发生。多胺代谢相关酶基因和仅当植物接触干旱时能够转录的启动子(诸如Atmyb2启动子ThePlantCell,5，1529-1539,1993)可用来在干旱期间控制植物的多胺代谢以及改进形态发生。外源多胺代谢相关酶基因在本发明的表达载体中的位置处于启动子的下游，从而转录受到能够在植物中起作用的启动子的控制。能够在植物中起作用的转录终止信号(终止区)也应加到多胺代谢相关酶基因的下游。例子是终止子NOS(仙人掌合酶)基因。本发明的表达载体也可含有诸如增强子序列的顺式调节元件。表达载体也可含有用于选择转化子的标记基因，诸如药物抗性基因标记，其例子包括新霉素磷酸转移酶II(NPTII)基因，膦丝菌素乙酰基转移酶(PAT)，以及glyophosate抗性基因。由于整合的基因在缺乏选择压力下有时会丢失，因此有利的是确保除草剂抗性基因也存在于载体上，以便在培育过程中使用除草剂总会导致涉及选择压力的条件。为了利于规模生产和纯化，表达载体也应该含有在大肠杆菌(E.coli)中的选择标记基因(诸如氨苄青霉素抗性基因或四环素抗性基因)和能够在大肠杆菌中自动复制的复制起点。本发明的表达载体的构建方法可以简单方式将目的选择标记基因和多胺代谢相关酶基因的表达盒插入到大肠杆菌载体(pUC或pBR系列)的克隆位点。当外源多胺代谢相关酶基因通过感染有根癌农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)或毛根农杆菌(Agrobacteriumrhizogenes)而导入，多胺代谢相关酶基因表达盒可插入在细胞的Ti或Ri质粒上的T-DNA区(转移到植物染色体的区域)中。目前，二元载体系统用于转化农杆菌的标准方法中。T-DNA转移的必需功能独立地由T-DNA本身和Ti(或Ri)质粒所提供，这些结构元件被划分在单独的载体上。二元质粒具有25bp的边缘序列，其两端对切割和组合T-DNA是必需的，并且去除了诱导冠瘿病(或发根)的植物激素基因，同时提供插入外源基因的余地。可商购的二元载体的例子包括pBI101和pBI121(两者均来自Clontech)。参与整合T-DNA的Vir区对称作辅助质粒的单独Ti(或Ri)质粒具有反式作用。各种常规已知的方法可用于转化植物。例子包括PEG方法，其中通过用细胞壁降解的酶诸如纤维素酶或半纤维素酶处理从植物细胞中分离原生质体，并将聚乙二醇加到原生质体和含有上述多胺代谢相关酶基因表达盒的表达载体的悬浮液中，以通过诸如内吞作用的方法将表达载体整合到原生质体；脂质体方法，其中表达载体通过超声处理等导入诸如磷脂酰胆碱的脂质膜囊泡，并将囊泡在PEG存在下与原生质体融合；利用微团以类似方式融合的方法；以及电穿孔法，其中把电脉冲施加给原生质体和表达载体的悬浮液从而将外部溶液中的载体整合到原生质体中。然而，这些方法的复杂性在于它们对原生质体再分化成植株需要培养技术。将基因导入具有细胞壁的完整细胞的方法包括诸如微注射的直接注射，其中微吸管插入到细胞中从而将吸管中的载体DNA在水压或气压下注射到细胞中，或者粒子枪方法，其中包被有DNA的金属微粒通过爆炸物爆炸或气压被加速，并因此导入细胞中，以及涉及使用农杆菌感染的方法。微注射的缺陷是需要相当多的培训以及少量的处理细胞。所以，较理想的是采用诸如农杆菌方法和粒子枪方法的更方便的方法转化植物。粒子枪方法在基因可被直接导入培育的植物的顶端分生组织中是有用的。在农杆菌方法中，诸如西红柿金色花叶病毒(TGMV)或另一二价染色体病毒的植物病毒的基因组DNA同时在边缘序列间插入到二元载体中，以便病毒感染可通过整个植株扩散，以及靶基因简单地通过在培育植株的任何位置处用病毒细胞悬浮液接种细胞可被同时导入整个植株中。获得多胺代谢相关酶基因的方法以及利用农杆菌导入靶基因以制备转化子的方法的具体例子如下给出。关于内源多胺代谢相关酶基因的抑制剂，本领域那些专业人员参照下列说明书可制备转基因植物。1.获得多胺代谢相关酶基因(1)用于PCR的cDNA文库的制备Poly(A)+RNA以常用方式从黑子南瓜的根组织中提取出来，所述根组织在18'C日间/14'C夜间的低温处理下己进行了3天。利用市场上可用的MarathoncDNA扩增试剂盒(Clontech)等从分离的poly(A)+RNA中制备cDNA文库用于PCR。分离的poly(A)+RNA用作模板，以及反转录酶和在3'端修饰有两个简并核苷酸位置的锁对接oligo(dT)引物用于合成第一链cDNA。双链cDNA通过聚合酶反应获得。双链cDNA用T4DNA聚合酶钝化，并且连接MarathoncDNA接头，给出添加有接头的双链cDNA的文库。(2)PCR引物的设计SPDS基因，SAMDC基因，ADC基因，和ODC基因可分离成多胺代谢相关酶基因。SPDS基因可从黑子南瓜或天仙子(Hyoscyamusniger)中分离，SAMDC基因可从土豆，菠菜或烟草中分离，ADC基因可从大豆，豌豆，或西红柿中分离，以及ODC基因可从曼陀罗中分离。碱基序列已经确定。因此，通过比较已知的碱基序列，可选择极度保守区，以及可合成DNA寡聚体以设计PCR用的引物。(3)通过PCR获得SPDS基因，SAMDC基因以及ADC基因片段上述(1)中制备的用于PCR的cDNA文库用作模板，而上述(2)中设计的引物用于进行PCR。PCR产物通过凝胶电泳分离，并且用玻璃奶等纯化。将纯化的PCR产物连接到诸如TA载体的克隆载体上。克隆cDNA的碱基序列的确定方法有Maxam-Gilbert,双脱氧法等。利用市场上可用的试剂盒可实施任一方法，以及全自动测序仪可用于自动测序。(4)分离全长基因以常用方式通过噬斑杂交，RACE(快速扩增cDNA末端)，MarathonRACE等，可获得全长基因。如此获得的基因为参与多胺生物合成的基因，并且利用这些基因，通过在分子生物学水平上控制基因的表达可以控制多胺水平，以及制备具有各种类型的形态发生改进的植物。2.利用农杆菌将靶基因导入阿拉伯芥中，以及制备转基因植物上述1中获得的基因可导入植物宿主中以制备各种类型的形态发生改进的转基因植物，所述各种类型的形态发生尤其诸如茎，叶，花，子房，果实，荚和种子的形态发生。(1)制备表达构建体和转化农杆菌表达构建体的制备方法是用适当的限制性酶切割上述1中获得的多胺代谢相关酶基因，从而包括所有的可读框，然后视需要连接合适的接头，以及将所述基因插入植物转化载体中。可用的植物转化载体的例子包括pBI101和pBI121。将得到的表达构建体在大肠杆菌中扩增，然后通过三重接合(NucleicAcidResearch,12,8711(1984))，冻融，电穿孔等法用根癌农杆菌C58，LBA4404，EHA101等转化所述表达构建体。三重接合例如包括在含有抗生素(诸如rifampicillin,卡拉霉素或潮霉素)的培养基上培养具有含靶基因的表达构建体的大肠杆菌，具有辅助质粒(诸如pRK2013)的大肠杆菌，以及农杆菌，以获得转化的农杆菌。(2)制备转基因植物在本发明中可导入基因的植物部分包括整个植物，植物器官(诸如叶，茎，根，花器官，无性点和种子)，植物组织(诸如表皮层，韧皮部，薄壁组织，木质部和维管束)，以及植物培养的细胞。例如，在用(1)中制备的转化的农杆菌感染植物后，通过愈伤组织再生可导入靶基因(PlantCellReports,12,7-11(1992))。即，以无菌培养的常规方式，MSO平板(4.6gMurashige-Skoog无机盐，10g蔗糖，lmL/L的1000X维生素储液，pH6.2)可用阿拉伯芥的种子接种。生根后，根的切片可在CIM平板(MSO平板补充有2，4-二氯酚氧乙酸至终浓度0.5ug/mL以及激动素至终浓度0.05ug/mL)上用于培养愈伤组织。培养用含有连接到启动子的靶基因，卡拉霉素和潮霉素抗性基因的质粒转化的农杆菌，稀释的样品以等份试样分装到试管中，以及将其上形成愈伤组织的根的切片浸泡若干天，在CIM平板上共培育。当植株长到足以肉眼可见时，将它们在SIMC平板(MSO平板补充有N6-[2-异戊烯基]腺嘌呤至终浓度5iig/mL，吲哚乙酸(IAA)至终浓度0.15ug/mL，以及凯福隆(claforan)至终浓度500ug/mL)上培养若干天消毒。切片最终培养在SIMCS平板(平板含有卡拉霉素和潮霉素)上，并且每周重复移植至新鲜平板上。转化的切片继续生长，导致愈伤组织。没有转化的切片会变成棕色，因为选择是基于抗生素。转化子约5mm，培养直到形成莲座叶。当完整的莲座形式明显时，用解剖刀切开转化子的根，留下愈伤组织，并且移植到RIM平板(MSO平板补充有IAA至终浓度0.5ug/mL)上。当大的愈伤组织相连时，通过愈伤组织显示根，即使它们已经生根，而维管束不会经常与莲座丛连接。约8-10天后，它们种植在浸泡有无机盐(5mMKN03，2.5mM磷酸钾缓冲液(pH5.5)，2mMMgS04，2mMCa(N03)2，50(iMFe-EDTA，IOOOX微量元素(70mMH3B03，14mMMnCl2，0.5mMCuS04，1mMZnS04，0.2mMNaMo04，10mMNaCl，0,01mMCoCl2)1mL/L)的矿毛绝缘纤维上。将已经开花和形成荚的植株移植到浸泡有无机盐培养基的土壤中，获得种子。将种子消毒，并使之在接种MSH(MSO平板补充有潮霉素至终浓度5U/mL)后发芽，由此得到转化子。通过在减压下浸润(ThePlantJournal,19(3),249-257(1999))，植物可感染有(1)中制备的转化的农杆菌以导入靶基因。即，市售盆栽育苗土(诸如Metromix)接种阿拉伯芥的种子，所述种子在22'C、长白昼(诸如日间16小时和夜间8小时)的条件下培育。在大约3-4周后，切下延长的主轴(花柄)以开始诱导侧芽。在大约1周的顶部修枝后，将阿拉伯芥浸泡在培养的农杆菌转化子的悬浮液中，并放置在干燥器中，所述干燥器用真空泵抽吸至-0.053MPa(400mmHg)，然后在室温下放置IO分钟。将感染的盆转移至深底碟子并在其一侧翘起以让少量的水滴到碟的底部，将透明盖放在其上，然后在潮湿条件下放置大约1天。接着栽培被感染的盆，以及在22'C的长白昼的条件下开始培育以收集种子。收集种子大约2-4周，将收集的种子通过茶过滤器等过滤，以去除碎片和外壳，并且干燥和保存在干燥器中。转基因植物的选择包括以常规方式使收集的种子消毒，并且悬浮于大约9mL的0.iy。琼脂水溶液，然后在选择培养基(诸如1XMS盐，1XGamborgB5维生素，1%蔗糖，0.5g/LMES，0.8%琼脂，100mg/L羧苄青霉素，50mg/L卡拉霉素，40mg/L潮霉素)上涂铺悬浮液，于22X:下无菌培养。对抗生素具有抗性的转基因植株会生长良好，并且可在大约l-2周内得以鉴定。将具有大约4-6片真叶的转基因植株移植至含有市售盆栽育苗土的盆中以在22。C、长白昼期间开始培育。以常规方式从所得转基因植物中抽提DNA，用适当的限制性酶切割DNA，以及多胺代谢相关酶基因可用作Southern杂交中的探针以确定基因是否被导入。以常规方式从转基因植物或非转基因植物中抽提RNA，以制备带有多胺代谢相关酶基因有义序列或反义序列的探针，以及探针可用于Northern杂交中以研究靶基因的表达。从所得转基因植物中诱导愈伤组织以产生愈伤组织。由减压浸润获得转基因植物(Tl)，通过自授粉产生的转化的子代T2的比例一般会遵循Mendel定律。例如，当多胺代谢相关酶基因杂合地整合在基因座位上时，T2子代中转化子的比例为3:1。根据T2子代培育后通过自授粉产生的T3子代，当转化子出现在所有子代中时，T2转基因植物将是纯合的，而当转化子以3:1的比例分离时，T2转基因植物对导入的多胺代谢相关酶基因而言，将是杂合的。如此选择的植物对导入的多胺代谢相关酶基因是纯合的，在种子工业领域中作为固定了改进的形态发生的独立品系是非常有用的。其基因表达分析多胺代谢相关酶基因通过Southern分析或Northern分析进行的转基因植物可评价多胺含量和各种类型的形态发生。在多胺测定的情况下，例如，将5%过氯酸水溶液添加到0.05-1g样品中以抽提多胺。抽提的多胺的测定包括通过苯甲酰作用，丹磺酰作用等荧光标记，接着利用高效液相色谱(HPLC)通过UV检测器或荧光检测器以内标进行分析。例如，有方法评价各种类型的形态发生。通过下列步骤可评价茎形成播种在合适的培养基中或将由转基因植物的自授粉获得的T2或T3种子盆栽在土壤中，在20-25。C、长白昼条件(日光/黑暗16小时/8小时)下生长，并且研究茎的数目和形状(例如，主花柄，侧花柄，枝等)。通过下列步骤可评价叶形成播种在合适的培养基中或将由转基因植物的自授粉获得的T2或T3种子盆栽在土壤中，在20-25°C、长白昼条件(日光/黑暗16小时/8小时)下生长，并且研究叶的数目和形状(例如，莲座叶，真叶等)。通过下列步骤可评花叶形成在合适的培养基中发芽或将由转基因植物的自授粉获得的T2或T3种子盆栽在土壤中，在20-25'C、长白昼条件(日光/黑暗16小时/8小时)下生长，并且研究花朵的数目，开花时间，花期，形状和颜色等。通过下列步骤可评价子房形成在合适的培养基中发芽或将由转基因植物的自授粉获得的T2或T3种子盆栽在土壤中，在20-25'C、长白昼条件(日光/黑暗16小时/8小时)下生长，并且研究子房的数目，形状，颜色和从坐果到成熟的发育期(例如，荚和果实等)。通过下列步骤可评价种子形成在合适的培养基中发芽或将由转基因植物的自授粉获得的T2或T3种子盆栽在土壤中，在20-25t:、长白昼条件(日光/黑暗16小时/8小时)下生长，并且研究种子的数目和形状以及收获后的发芽率等。在本发明中可被转化的植物的例子包括，但不限于，双子叶植物，单子叶植物，草本植物，和灌木。例子包括甘薯，西红柿，黄瓜，南瓜，甜瓜，西瓜，烟草，阿拉伯芥，柿子椒，茄子，蚕豆，芋头，菠菜，胡萝卜，草莓，白马铃薯，水稻，玉米，苜蓿，小麦，大麦，大豆，油菜籽或改良油菜(canola)，高梁，桉树，白杨，洋麻，杜仲(Eucommiaulmoides)，甘蔗或糖用甜菜，藜(Chenopodiumalbum)，百合，兰花，康乃馨，玫瑰，矮牵牛花，蓝猪耳(Toreniafournieri)，金鱼草(Antirrhinummajus)，仙客来(Cyclamenpersicum)，霞草(Gypsophilaelegans)，天竺葵(Pelargoniumgraveolens)，向日葵，结缕草(Zoisiajaponica)，棉花，松莺菌燕(matsutakemushrooms)，椎茸(shiitakemushrooms)，蘑菇，人参，柑橘类水果，香蕉以及猕,兆(kiwifruit)，木薯(Manihotutilissima)，西谷椰子(MetroxylonsaguRoxb)。优选甘薯，白马铃薯，西红柿，黄瓜，水稻，玉米，大豆，小麦，矮牵牛花，蓝猪耳，桉树和棉花。根据本发明，在植物中改进各种类型的形态发生是可能的，并且可以预见植物器官和组织的质量，价值，产率和收率可得以改进，或者通过矮化等抗倒伏可得以改进。具体而言，可以预见，当通过增加茎，叶，花，子房，果实，荚和种子的数目产生作为农产品的器官时，质量，产率和收率增加是可预计的。例如，可以预计增加每棵水稻植物的种子数会提高可收获的水稻收率。可以预计增加每棵玉米植株的雌穗数会提高粒数。可以预计增加每棵大豆植株的荚数会提高豆的收率。可以预计增加每棵植株的棉铃数会提高棕的收率。可以预计增加白马铃薯和甘薯的块茎和块状根的数会提高土豆的收率。对果树而言，可以预计增加坐果(子房)数以及延长发育期会改进产率。对观赏植物而言，可以预计增加茎，叶尤其是花朵的数目，以及推迟花期和通过小型化使视觉效果更吸引人，会提高商品价值。此外，可以预计通过改变植物的形状和形成，各种环境适应性可得以改进，培育的稳定性和产率可得以改进，以及耕种土地可得以扩大。实施本发明的最佳方式本发明以下列实施例更详细加以说明，但这些实施例仅仅是示例性的，而不以任何方式限制本发明的范围。实施例l:植物诱导的多胺代谢相关酶基因的克隆(1)Poly(A)+RNA的制备蛭石用黑子南瓜接种，并在子叶发育期将植物移植到装满了可商购的细土(Sansan土，Takii&Co.,Ltd.)的盆中。把盆栽的黑子南瓜放置在培养箱(空气温度日间26°。/夜间22°C，13小时长白昼)中用于植物培育。在两个叶阶段，培养箱温度降低到日间18'C/夜间14x:以开始低温处理。3天低温处理后，将植物分成采样用的根，茎和叶。样品存储在-80'C冷冻器中直到RNA提取。使大约4g的黑子南瓜根组织快速冷冻在液氮中，并在液氮存在下用臼和槌细磨。然后添加10mL的0.2MTris乙酸缓冲液(5M异氰酸胍，0.7%3-巯基乙醇，1%聚乙烯吡咯垸酮(分子量360,000)，0.62%N-月桂酰肌氨酸钠盐，pH8.5)抽提，利用Polytron匀浆机(Kinematica)在冰上冷却的同时研磨组织2分钟。仅用前加入巯基乙醇和聚乙烯吡咯垸酮。然后，研磨的产物以17，000Xg离心20分钟，并且回收上清液。上清液通过mira布过滤，过滤液轻轻地分层在放置于超离心管的1.5mL的5.7M氯化铯溶液中，内容物以155，000Xg离心20小时，然后丢弃上清液，并且回收RNA沉淀。将沉淀溶解在3mL的10mMTris-HCl，lmMEDTA-2Na，pH8.0(称作TE缓冲液)，进一步加入等当量的苯酚:氯仿:异戊醇(体积比为25:24:1)，混合成分然后离心，并回收上水层。向水层中加入1/10倍3M乙酸钠(用冰醋酸调节至pH6.2)和2.5倍乙醇，混合成分，并让混合物在-2(TC中放置过夜。接着以17,000Xg离心混合物20分钟，并用70%乙醇洗涤所得的沉淀，以及减压下干燥。将干燥的沉淀溶解在500uL的上述TE缓冲液中，得到总RNA溶液。把RNA溶液在65。C下温育5分钟，然后在冰上猝灭。向RNA溶液中加入等量的2X结合缓冲液(10mMTris-HCl，5mMEDTA-2Na，1MNaCl，0.5%SDS，pH7.5)，并将溶液分层在用平衡缓冲液(10mMTris-HCl，5mMEDTA-2Na，0.5MNaCl，0.5%SDS，pH7.5)平衡的oligodT纤维素柱(Clontech)上。接着用大约IO倍的上述平衡缓冲液冲洗柱子，并且用洗脱缓冲液(10mMTris-HCl，5mMEDTA-2Na，pH7.5)洗脱poly(A)+RNA。向所得洗脱液中加入上述的1/10倍3M乙酸钠水溶液和2.5倍乙醇，混合成分，并且让混合物放置在-7(TC。然后以10，000Xg离心混合物20分钟，用70%乙醇洗涤所得的沉淀，并且减压下干燥。将干燥的沉淀再次溶解在500uLTE缓冲液中，并且在oligodT纤维素柱上反复纯化。从低温处理的黑子南瓜的根中获得的poly(A)+RNA用于制备PCR用的cDNA文库以及分离全长基因的cDNA文库。(2)PCR用的cDNA文库的制备cDNA文库的制备方法是利用MarathoncDNA扩增试剂盒(Clontech)。从黑子南瓜的根中获得的poly(A)+RNA用作模板，而逆转录酶和在3'端用两个简并的核苷酸位置修饰的锁一对接oligo(dT)引物用于合成双链cDNA，上述方法依据Gubler,Hoffman等(Gene,25，263-269(1983))。将MarathoncDNA接头(5，端磷酸化利于用T4DNA连接酶结合到双链cDNA的两端)连接到所得cDNA的两端。所得接头连接的cDNA用作黑子南瓜根衍生的PCR用cDNA文库。(3)PCR引物的设计将已分离自植物或哺乳动物的精氨酸脱羧酶，S-腺苷甲硫氨酸脱羧酶以及亚精胺合酶基因的碱基序列进行比较。极度高保守同源性的区域被选择来合成DNA寡聚体(序列引物I-VI)。SPDS引物I(SEQIDN0.7):5，-GTTTTGGATGGAGTGATTCA-3'SPDS引物II(SEQIDN0.8):5，-GTGAATCTCAGCGTTGTA陽3'SAMDC弓l物III(SEQIDN0.9):5，-TATGTGCTGTCTGAGTCGAGC-3'SAMDC弓l物IV(SEQIDNO.10):5，陽GCTAAACCCATCTTCAGGGGT-3'ADC弓l物V(SEQIDNO.ll):5，-GGGCT(T/G)GGA(G/A)T(G/C)GACTA(C/T)陽3，ADC弓l物VI(SEQIDNO.12):5，陽(T/C)CC(A/G)TC(A/G)CTGTC(G/A)CA(G/C)GT-3，(4)PCR扩增(2)中获得的PCR用cDNA文库用作模板，而(3)中设计的序列引物用于PCR。PCR步骤包括5个循环94°C、30秒，45°C、l分钟，以及72。C、2分钟，接着30个循环94°C、30秒，55°C、1分钟，以及72'C、2分钟。(5)琼脂糖凝胶电泳PCR扩增的产物在1.5%琼脂糖上电泳，接着对电泳凝胶进行溴化乙锭染色，并且在UV透射仪上检测扩增的条带。(6)PCR扩增产物的验证和回收检测的扩增条带得到验证，并从琼脂糖中用剃须刀切出。胶条转移至1.5mL微管，以及利用QIAEXII凝胶抽提试剂盒(QIAGEN)从凝胶中分离和纯化出DNA片段。将回收的DNA片段亚克隆到pGEMT克隆载体(Promega)，转化大肠杆菌(E.coli)，然后以常规方式用于制备质粒DNA。(7)测序插入到质粒中的序列通过双脱氧法(Messing,MethodsinEnzymol.:101,20-78(1983))进行测序。三种SPDS基因，一种SAMDC基因以及两种ADC基因得以分离。(8)同源性的检测这些基因的碱基序列对已知基因碱基序列的数据库进行同源性检索揭示出SPDS基因与已知植物衍生的SPDS基因具有70%的同源性，SAMDC基因与已知植物衍生的SAMDC基因具有至少70%的同源性，而ADC基因与已知植物衍生的ADC基因具有至少67%的同源性。(9)获得全长基因通过噬斑杂交获得全长基因。利用ZAP-cDNA合成试剂盒(Stratagene)制备cDNA文库。(1)中获得的来自黑子南瓜根的poly(A)+RNA用作模板，以及oligo(dT)引物用于合成双链cDNA，方法根据Gubler，Hoffman等(Gene,25,263-269(1983))。将EcoRI接头(具有内Xhol和Spel位点)连接到所得cDNA用Xhol消化后的两端，把片段连接到入噬菌体载体(入ZAPII)臂的EcoRI和XhoI位点，然后利用体外包装试剂盒(GigapackGold,Stratagene)进行包装，感染大肠杆菌SURE株(OD660=0.5)，得到众多的重组入噬菌体。这些用作黑子南瓜根衍生的cDNA文库。文库大小为8.0X106。为了制备探针，从(6)中制备的SPDS，SAMDC和ADC基因的质粒DNA中分离和纯化插入cDNA，所得cDNA用作模板，以及随机引物DNA标记试剂盒(USB)用于制备32P标记的探针。所得32P标记的cDNA用作探针。用于构建黑子南瓜根衍生的cDNA文库的噬菌体用于感染在LB琼脂培养基上增殖的大肠杆菌，以及大约50,000个拷贝的噬菌体DNA转移至尼龙膜(HyBond-N，Pharmacia)。其上转移噬菌体DNA的尼龙膜转移至含有碱变性溶液(0.5MNaOH，1.5MNaCl)的滤纸上，让膜放置4分钟，然后将它们转移到含有中和溶液(0.5MTris-HCl，1.5MNaCl，pH8.0)的滤纸上，并放置5分钟。膜用2XSSC(0.3MNaCl，0.03M柠檬酸三钠)洗涤，然后利用Stratalinker(Stratagene)将DNA固定到膜上。把其上已固定DNA的尼龙膜放置在杂交溶液(50%甲酰胺，0.5%SDS，6XSSPE(3MNaCl，0.2MNaH2P04，20mMEDTA-2Na,pH7.4)，5XDenhardt氏溶液(0.1%Ficoll，0.1%聚乙烯吡咯烷酮，0.1%牛血清白蛋白)，50ixg/mL变性鲑鱼精子DNA)中，在42。C预杂交3小时，加入已制备的cDNA探针，并在42"C下杂交18小时。然后取出膜，在42'C用含有2XSSC，1XSSC，0.5XSSC和0.1XSSC的溶液洗涤1-2小时。干燥膜，然后放置在X-线胶巻上，曝光过夜。因此，可以选择杂交有获自SPDS，SAMDS和ADC基因片段的探针的阳性克隆。带有cDNA插入的质粒克隆通过从阳性克隆的噬菌体DNA中体内切除而制备。体内切除之后是ZAP-cDNA合成试剂盒(Stratagen)的方法。将200yL分别含有SPDC，SAMDC和ADC基因的各个噬菌体溶液，200uL大肠杆菌XL1-Blue悬浮液以及1wL辅助噬菌体R408悬浮液混合，使混合物在37。C下温育15分钟，加入3mL的2XYT培养基，在37'C振荡培养物2小时，7(TC下处理培养物20分钟，离心(4,000Xg,IO分钟)以及回收上清液。将30uL所得上清液和30nL大肠杆菌SURE悬浮液混合，使混合物在37。C下温育15分钟，并把数UL用于接种含有50ppm氨苄青霉素的LB琼脂培养基，在37。C下培养过夜。大肠杆菌形成菌落含有cDNA插入的质粒。对插入序列在质粒中的碱基序列通过双脱氧法(Messing,MethodsinEnzymol.，101，20-78(1983))进行测序。结果显示质粒含有起始密码子。所得来自黑子南瓜的全长亚精胺合酶基因命名为FSPD1(SEQIDNOs.l和2)，S-腺苷甲硫氨酸脱羧酶基因命名为FSAM24(SEQIDNOs.3禾[34)，而精氨酸脱羧酶基因命名为FADC76(SEQIDNOs.5和6)。所得FSPD1的氨基酸与已知植物衍生的亚精胺合酶基因进行比较(表1)。表1结果显示来自黑子南瓜根的FSPD1在氨基酸水平上与其他植物衍生的SPDS基因具有高同源性。表l黑子南瓜FSPD1基因与其他SPDS基因的比较<table>tableseeoriginaldocumentpage31</column></row><table>所得FSAM24的氨基酸与已知植物衍生的S-腺苷甲硫氨酸脱羧酶基因进行比较(表2)。表2结果显示来自黑子南瓜根的FSAM24在氨基酸水平上与其他植物衍生的SAMDC基因具有高同源性。表2黑子南瓜FSAM24基因与其他SAMDC基因的比较植物起源氨基酸同源性(％)阿拉伯芥66.3Spinacia秧苗63.3Solanumtuberosum68.2Pisumsativum未分化的愈伤组织65.2所得FADC76的氨基酸与已知植物衍生的精氨酸脱羧酶基因进行比较(表3)。表3结果显示来自黑子南瓜根的FADC76在氨基酸水平上与其他植物衍生的ADC基因具有高同源性。表3黑子南瓜FADC76基因与其他ADC基因的比较植物起源氨基酸同源性(％)Lycopersiconesculentum果实77.1Nicotianasylvestris75.4阿拉伯芥70.7Pisumsativum果实70.6实施例2:转基因阿拉伯芥的制备(1)表达构建体的制备FSPD1多胺代谢相关酶基因示于SEQIDNO.l中，用Xhol切害l]，其切割方式包括碱基序列的整个阅读框，并且通过玻璃奶方法纯化片段。然后，用XhoI切割pGEM-7Zf(Promega)，并以有义和反义方向亚克隆FSPD1片段。FSPD1片段再次用Xbal和Kpnl限制性酶在pGEM-7Zf的多克隆位点处切割，并以有义和反义方向亚克隆到已连接有35S启动子的二元载体pBI101-Hm2。所得质粒命名为pBI35S-FSPDl。这种表达构建体的结构示于图1中。转化的大肠杆菌JM109命名为大肠杆菌JM109/pBI35S-FSPDl+/-。多胺代谢相关酶基因FSAM24示于SEQIDN0.3，用Notl切害ij，其切割方式包括碱基序列的整个阅读框，并把末端钝化。将片段亚克隆到已连接有(钝化)35S启动子的二元载体pBI101-Hm2。所得质粒命名为pBI35S-FSAM24+/-。转化的大肠杆菌JM109命名为大肠杆菌JM109/pBI35S-FSAM24+/-。多胺代谢相关酶基因FADC76示于SEQIDN0.5,用Notl切割，其切割方式包括碱基序列的整个阅读框，并把末端钝化。将片段亚克隆到已连接有(钝化)35S启动子的二元载体pBI101-Hm2。所得质粒命名为pBI35S-FADC76+/-。转化的大肠杆菌JM109命名为大肠杆菌雇09/pBI35S-FADC76+/-。(2)质粒导入农杆菌将(1)中获得的大肠杆菌pBI35S-FSPDl+/-，大肠杆菌pBI35S-FSAM24+/-，或大肠杆菌pBI35S-FADC76+/-和含有辅助质粒pRK2013的大肠杆菌HB101株在37。C下、含有50mg/L卡拉霉素的LB培养基上培养l夜，而将农杆菌C58株在37'C下、含有50mg/L卡拉霉素的LB培养基上培养2夜。从1.5mL各个Eppendorf管的培养物中收集细胞，然后用LB培养基洗涤。将细胞悬浮于lmL的LB培养基中，分别把100uL的三种细胞混合后接种到LB琼脂培养基中，并在28°C培养以让质粒与农杆菌结合(三重结合)。l或2天后，用铂环刮一部分，并涂抹在含有50mg/L卡拉霉素，20mg/L潮霉素和25mg/L氯霉素的LB琼脂培养基上。28'C培养2天后，挑选单菌落。所得转化子命名为C58/pBI35S-FSPDl+/陽，C58/pBI35S-FSAM24+/-和C58/pBI35S-FADC76+/-。通过减压过滤(下文(3)至(6))或愈伤组织再生(下文(7)至(12))制备转基因阿拉伯芥。(3)培育阿拉伯芥将盆栽的市售育苗土Metromix(HyponexJapan)放置在塑料盆中，表面覆盖有格筛，通过格筛间隙接种2-5粒阿拉伯芥(下文称为"哥伦比亚株"或"野生型")种子(由NaraInstituteofScienceandTechnologyGraduateUniversity的TakayukiKohchi教授馈赠)。将盆在低温室中4'C下放置2天发芽，然后转移培育在22"C的长昼条件(16小时长日间/8小时夜间)下。大约4-6周后，通过从顶部修剪植物诱生侧芽，其中主轴花柄延伸至5-10cm。顶部修剪大约l-2周后，用农杆菌感染植物。(4)农杆菌悬浮液的制备感染前2天，上述(2)中制备的农杆菌用于接种10mL含有抗生素(50iig/mL卡拉霉素，20ug/mL潮霉素)的LB培养基，并在28。C下振荡培养物24小时。将一部分培养物转移至1000mL含有抗生素(50ug/mL卡拉霉素，20ug/mL潮霉素)的LB培养基，并在28。C下另振荡培养物大约24小时(至OD6Q()介于1.2-1.5)。室温下从培养物中收集细胞，并重悬浮于过滤用悬浮培养基(0.5XMS盐，0.5XGamborgB5维生素，1%蔗糖，0.5g/LMES，0.44uM苄基氨基嘌呤，0.02%Silwet-77)中至OD6oo介于0.8-1。(5)农杆菌感染给上述(3)中制备的阿拉伯芥盆里的盆栽土洒水以防止盆栽土吸收上述(4)中制备的农杆菌悬浮液。近200-300mL的农杆菌悬浮液放置在1000mL烧杯中，并把盆栽的阿拉伯芥头朝下让植物浸泡在悬浮液中。其中已放置盆的烧杯转移到干燥器中，用真空泵抽吸至大约-0.053Mpa(400mmHg)，然后让植物放置约10分钟。负压逐渐释放，从农杆菌悬浮液中取出植物，过量的农杆菌悬浮液用手巾(Kimtowel)拭去，将盆放置在深底盘的侧面上。引入少量的水，并用莎纶覆盖物(saranwrap)覆盖植物。让植物以这种方式放置大约1天。接着去除莎纶覆盖物，把盆竖直放置，停止浇灌约1周。然后，将盆栽的市售育苗土逐渐洒水，从成熟的荚中收集种子大约3-5周。使收集的种子通过茶滤器过滤以消除碎片和外壳，并且将种子置于干燥器中充分干燥。(6)获得转化的植物将上述(5)中获得的100yL(约2000粒)种子转移到1.5mLEppendorf管中，并浸没在70%乙醇中2分钟，以及浸没在5%次氯酸钠溶液中15分钟，最终用无菌水洗涤种子5次消毒。把消毒的种子转移到15mLfalcon管，加入约9mL的0.1%无菌琼脂溶液，剧烈混合内容物。将0.1%种子的琼脂混合物如涂铺噬菌体一样均匀地涂在选择培养基(1XMS盐，1XGamborgB5维生素，1%蔗糖，0.5g/LMES，0.8%琼脂，100mg/L羧苄青霉素，50mg/L卡拉霉素，40mg/L潮霉素，8g/L植物琼脂(Phytagar)，pH5.7)上。平板在洁净台上干燥约30分钟，4'C下低温处理2天，将平板转移到22'C的生长室中，挑选具有抗生素抗性的转化子。把长有约3-5片真叶的植物再次转移到新鲜选择培养基中，并且培育一直长成4-6片真叶。具有抗生素抗性的转化子(Tl)种植在填充有市售育苗土的盆中，并且在潮湿条件下适应约5-7天。水土适应后，将植物培育在23"C、长白昼条件下(16小时长日间/8小时夜间)。对所得转基因植物(Tl)和从获自转基因植物的种子中生长出的植物(T2)的导入基因通过PCR或Southern杂交进行分析，并且通过Northern杂交分析其表达水平，从而确认靶多胺代谢相关酶基因以一致的方式已被掺入，以及转化子已得以表达。种子T3也从植物T2中收集，以及进行了抗生素抗性测试(分异分析)，从而根据转化子出现的比例获得纯合体(T2)。种子T2和从纯合体获得的种子T3(T3纯合细胞系)用于下列测试。(7)无菌阿拉伯芥培育将阿拉伯芥Wassilewskija株(下文称作WS株)的10粒种子(由NaraInstituteofScienceandTechnologyGraduateUniversity的AtsuhikoShinmyo教授馈赠)引入1.5mL管中，加入lmL的70%乙醇，让种子放置3分钟。然后把种子浸在消毒溶液(5%次氯酸钠，0.02%TritonX-100)中3分钟，用无菌水洗涤5次，接着种植在MSO平板(4.6gMurashige-Skoog无机盐，10g蔗糖，lmL/L1000X维生素储液，pH6.2)中。使平板在4'C放置2天，进行低温处理，然后在植物温育箱(MLR-350HT，Sanyo)中、22。C的长昼(16小时长日间，8小时夜间)以及光强度为6000勒克斯的条件下培养21天。为了提高感染效率，植物再次无菌拔出，将根展开在新鲜MSO平板的表面上，另继续培养2天。(8)农杆菌感染将上述培养21天的WS株的几个根排列，用解剖刀切成大约1.5-2.0cm，并把它们彼此并排放置在CIM平板(MSO平板补充有2,4-二氯苯氧基乙酸至终浓度0.5ug/mL以及激动素至终浓度0.05"g/mL)上。在光强度为3000勒克斯、16小时亮/8小时暗的条件下已培养2天的样品，用MS稀释液(6.4g/LMurashige-Skoog无机盐，pH6,3)稀释3倍后，以lmL份等分到试管中，将其上长有愈伤组织的根的切片浸泡在试管中10分钟。切片放置在双倍消毒的滤纸上，去除过量的水份，并将切片排列在新鲜CIM平板上，在同样条件下共培育2天。(9)消毒将其上株已长成足以肉眼可见的切片转移到消毒溶液(MS稀释溶液补充有凯福隆至终浓度200ug/mL)，轻轻振荡洗涤60分钟。这些操作重复5次，用无菌滤纸去除水份，并将切片放置在SIMC平板(MSO平板补充有2-ip至终浓度5"g/mL，IAA至终浓度0.15ug/mL，以及凯福隆至终浓度500yg/mL)上以光强度为6000勒克斯、16小时亮/8小时暗的条件培养2天。(10)转化子的挑选将上述培养2天的切片转移至SIMCS平板(SIMC平板补充有潮霉素B至终浓度4.6U/mL)，在光强度为6000勒克斯、16小时亮/8小时暗的条件下培养。随后每周把切片转移至新鲜SIMCS平板。转化的切片继续生长，形成圆顶形状的愈伤组织，但是没有被转化的切片变成棕色。约2周后，转化子的愈伤组织变成绿色。约1月后，叶子形成，其后形成莲座叶丛。(11)转化子的再生将具有莲座叶的植物的根用刀或手术刀切割，留下愈伤组织，并经插入后轻轻漂浮在RIM平板上。8-10天后，用镊子种植那些其上已形成若干约l-2cm的根的愈伤组织，并培育在浸泡有无机盐培养基(5mMKN03，2.5mM磷酸钾缓冲液(pH5.5)，2mMMgS04，2mMCa(N03)2，50uMFe-EDTA，IOOOX微量元素(70mMH3B03，14mMMnCl2，0.5mMCuSO4，lmMZnS04，0.2mMNaMoO4，10mMNaCl，0.01mMCoCl2)lmL/L)的石绒小型盆(NittoBoseki)中。开花和形成荚后，将植物移植到通过以1:1比例混合珍珠岩和蛭石(TES)而制成的土中，然后用无机盐培养基浸泡。约1月后，获得各株的几百粒种子。下文称这些种子为T2种子。(12)获得抗生素抗性株将约100粒T2种子以与(7)中相同的方式灭菌，用于接种MSH平板。潮霉素B抗性株以约3:1的比例发芽。(13)DNA提取和Southern杂交用镊子将上述发芽的T2种子移植到浸泡有无机盐的石绒小型盆中，并在光强度为6000勒克斯、22'C及16小时亮和8小时暗的条件下培养。2周后，用解剖刀切掉顶层土，以让石绒的表面用刀划线，和用液氮立即冷冻样品。样品在液氮存在下用臼和槌细磨，每克加入3mL的DNA提取缓冲液(200mMTris-HCl(pH8.0)，100mMEDTA-2Na，1。/。N-月桂酰肌氨酸钠，100ug/mL蛋白酶K)，并充分混合成分。在60。C下温育混合物1小时，然后离心(10，000Xg，10分钟)，以及上清液通过mira布过滤，并转移至新鲜试管中。用酚:氯仿异戊醇(25:24:1)抽提3次，然后沉淀在乙醇中。沉淀物溶解于TE缓冲液中。从约2.0g的各个植物中获得20ug的各个基因组DNA。用EcoRI和HindIII限制性酶切割1ug的DNA用于1%琼脂糖电泳和Southern杂交。未转化的WS株的种子发芽和生长，DNA以相同方式从植物中提取，并用EcoRI和Hindlll限制性酶消化用于1%琼脂糖电泳和Southern杂交。FSPD1，FSAM24和FADC76基因片段用作杂交探针。依据《分子克隆实验室操作指南》(MolecularCloning,aLaboratoryManual)(第9章，第31陽58页(ColdSpringHarbor(1989)))中的方法进行Southern杂交。具体而言，DNA在1%琼脂糖凝胶上电泳，接着碱变性和在尼龙膜(Hybond-N，Amersham)上Southern印迹过夜。通过用UV透射仪照射(254nm)3分钟固定DNA。膜在50°C下、5mL预杂交缓冲液(5XDenhardt氏，6XSSC，0.1%SDS，10ug/mL鲑鱼精子DNA)中预杂交2小时。加入探针在5(TC下杂交过夜。杂交后，膜用含有2XSSC和0.1%SDS的洗涤溶液洗涤两次共10分钟，然后用同样溶液在5(TC下洗涤两次共30分钟。干燥膜，并在-8(TC下在装有X-线胶巻(Kodak)的暗盒中曝光过夜自显影拍照。通过Southern杂交检测的信号模式与未转化的株(1)，含有FSPDl,FSAM24，和FADC76的转化子(2)以及仅含有载体的转化子(3)进行比较。除了(1)，(2)和(3)共享的内源信号以外，在(2)的EcoRI消化物和HindlII消化物中观察到了特定的信号，证实靶基因已整入(2)中。实施例3:Northern印迹分析为了确认耙基因是否真正表达在实施例2所获得的T2转化子中，以下列方式进行了Northern印迹。从未转化的野生型(WT)和T2转化子(细胞系TSP-14,15，16，17，19)的莲座叶中提取总RNA。以实施例2相同的方式提取RNA。将10"g的所得总RNA在1.5%甲醛琼脂糖凝胶上电泳，并在HyBondN尼龙膜上印迹过夜。用UV交联剂固定RNA，然后在预杂交缓冲液(50%甲醛，5XSSPE，5XDenhardt氏，0.1%SDS，80yg/mL鲑鱼精子DNA,pH7.0)中42t:下预杂交2小时。用32P-dCTP和随机标记试剂盒(Amersham)从转化的黑子南瓜SPDS基因片段的cDNA中制备探针。向预杂交混合物中加入探针，用于在42'C下杂交过夜。杂交后，膜在55。C下洗涤两次共30分钟，开始用含有2XSSC和0.1%SDS的洗涤溶液洗涤，结束用含有0.1XSSC和0.1%SDS的洗涤溶液洗漆。用X-线胶巻(Kodak)对膜进行放射自显影拍照。Northern印迹的结果示于图9中。图9的结果显示在野生型(WT)中未检测到内源黑子南瓜SPDS基因的表达，但在所有的T2转化子中黑子南瓜SPDS基因(FSPD1)的表达水平极高。实施例4:多胺含量的评价(1)筛选含有靶基因的细胞系通过PCR(或Southern分析)和Northern分析实施例3中制备的转化子，在确认靶基因已被导入后选择细胞系，挑出细胞系TSP-114，115，116，117，119，131，132，151,152,221和222。针对导入FSPD1的TSP-114禾卩115，导入FSAM24的TSP-131和132，导入FADC76的TSP151和152以及反义方向导入FSPD1的TSP-221和222，确定多胺含量。(2)多胺含量的分析大约0.1-0.3g来自转基因植物(TSP)和同时培育的野生型植物(WT)的莲座叶(或真叶)采样，冷冻和存储在可被密封的塑料瓶中。向采集的样本中加入稀释内标溶液(1,6-己二胺，内标含量二7.5nmo1)和5%高氯酸水溶液(每l.Og样本鲜重为5-10mL)，并利用全能混合器在室温下充分研磨和抽提。研磨溶液4"C下35,000Xg离心20分钟，收集上清液，并用作游离多胺溶液。将400uL游离多胺溶液，200"L饱和碳酸钠水溶液和200uL丹磺酰氯/丙酮溶液(10mg/mL)加入到带有螺帽的微管中，轻轻混合。在用管塞紧紧封闭和用铝箔覆盖后，在60。C水浴中加热1小时进行丹磺酰化作用。让试管冷却后，加入200yL脯氨酸水溶液(100mg/mL)并混合。试管用铝箔覆盖后，再次在水浴中加热30分钟。放置冷却后，通过喷雾氮气去除丙酮，然后加入600uL甲苯，剧烈混合。使试管静置分成2相，将上层300yL甲苯分离到微管中。通过喷雾氮气完全去除甲苯。向微管中加入100-200uL甲醇，溶解丹磺酰化的游离多胺。利用与荧光检测仪(激发波长为365nm，而发射波长为510nm)的高效液相色谱，通过内标法，对腐胺，亚精胺和精胺的游离多胺含量进行分析。^BondapakC18(由Waters,Co.生产，027324，3.9X300mm，粒度10um)用作HPLC柱。样本中的多胺含量的计算方法是从标准溶液和样本的HPLC图中推出多胺和内标的峰面积。结果示于表4中。表4<table>tableseeoriginaldocumentpage41</column></row><table>表4显示其中以有义方向导入多胺代谢相关酶基因的细胞系TSP-114,115，116，117，119，131，132，151和152比野生型(WT)具有显著高水平的腐胺，亚精胺和精胺含量，以及总多胺含量同样也显著高于野生型(WT)。具体而言，亚精胺和精胺含量明显增加。此外，其中以反义方向导入多胺代谢相关酶基因的TSP-221和222比野生型(WT)具有显著低的水平，尤其是亚精胺和精胺含量，以及总多胺含量同样也显于野生型(WT)。结果显示多胺代谢相关酶基因以有义或反义方向导入植物中使得多胺含量提高或降低。结果显示多胺代谢相关酶基因导入植物使得多胺含量通过操纵多胺代谢得以控制。实施例5:各种形态发生的评价(1)茎、叶、花和荚的数目的评价将实施例2中获得的T3转基因植物(细胞系TSP-16-1，16-2，其中以有义方向导入FSPD1)和野生型植物(WT:哥伦比亚株)的种子种植在含有Metromix盆栽土(由HyponexJapan,Co.制造)的塑料盆中。在4"低温下种植和处理约2天后，将盆放置在塑料桶中，并开始在23'C下以长白昼条件(日光/黑暗的长度16小时/8小时)培育。种植后将植物生长15周。生长后，对各个品系的单株植物研究茎(花柄)的数目。各个品系研究30株单个植物。结果示于图3中。图3的结果表明，与野生型植物相比，每个T3转基因植物(TSP-16-1，16-2)在茎数上显著增加约7-8个茎。此外，还表明每个植物的茎数，叶(茎生叶)数，花和荚(子房)数也显著增加。野生型和TSP-16-1的植物习性示于图4中。(2)主茎和侧茎的数目的评价从(1)中的结果可以证实，与野生型植物相比T3转基因植物中的茎数显著增加。然后，由于阿拉伯芥的茎可分成主茎(主花柄)和侧茎(侧花柄)，因此决定对主茎和侧茎的数分别进行研究。T3转基因植物(细胞系TSP-161B，162B，其中以有义方向导入FSPD1)和野生型植物(WT:哥伦比亚株)的种子种植在含有Metromix盆栽土(由HyponexJapan,Co.制造)的塑料盆中。在4。C低温下种植和处理约2天后，将盆放置在塑料桶中，并开始在23'C下以长白昼条件(日光/黑暗的长度16小时/8小时)培育。种植后将植物生长7周，从第7周(第49天)到第13周(第91天)每周一次对各个品系中的每株单个植物的主茎(主花柄)和侧茎(侧花柄)的数目分别进行研究。各个品系研究32株单个植物。结果示于图5和6中。图5的结果显示，自第49天开始，与野生型植物相比，T3转基因植物的主花柄数显著增加，以及在第70天，与野生型植物相比，T3转基因植物中每个植株增加约1个茎。T3转基因植物和野生型植物的主花柄的增加程度持续大致相同直至第91天，而T3转基因植物中最终的主花柄数高于野生型植物。图6的结果显示，自第49天开始，与野生型植物相比，T3转基因植物的侧花柄数显著增加，以及在第70天，与野生型植物相比，T3转基因植物中每株植物增加约4个茎。在第91天，与野生型植物相比，T3转基因植物中每株植物增加大约5-6个茎，而T3转基因植物中最终的侧花柄数显著高于野生型植物。(3)叶、花和荚的数目的评价从(1)的结果证实，与野生型植物相比，T3转基因植物中的叶、花和荚(子房)的数目显著增加。接着对各种器官的数目进行详细研究。T3转基因植物(细胞系TSP-15-3，16-1，其中以有义方向导入FSPD1)和野生型植物(WT:哥伦比亚株)的种子种植在含有Metromix盆栽土(由HyponexJapan,Co.制造)的塑料盆中。在4'C低温下种植和处理约2天后，将盆放置在塑料桶中，并开始在23t:下以长白昼条件(日光/黑暗的长度16小时/8小时)培育。种植后将植物生长67天，并在第67天，对各个品系中每株单个(植物)的叶(茎生叶)、带有白花瓣的花，和荚(荚长度5mm或以上)的数目加以研究。各个品系研究30株单个植物。结果示于表5中。表5(<table>tableseeoriginaldocumentpage44</column></row><table>表5的结果表明，与野生型植物相比，每株T3转基因植物的真叶、花和荚的数目显著增加。在此研究后，让所有品系的荚成熟和裂口，并且收集成熟的种子。对每个荚的种子数而言，T3转基因植物和野生型植物之间揭示出非显著差异，但证实了在T3转基因植物中每株植物收集的种子的总数显著增加，其结果是每株植物的荚数增加了约1.6-2.0倍。当利用野生型的种子和收集自T3转基因植物的T4种子进行发芽率比较试验时，T4种子和野生型种子的发芽率均为95-100%。(4)花期和子房(荚)发育期的评价实施例2中获得的T3转基因植物(细胞系TSP-15-3，16-1，其中以有义方向导入FSPD1)和野生型植物(WT:哥伦比亚株)的种子种植在含有Metromix盆栽土(由HyponexJapan,Co.制造)的塑料盆中。在4。C低温下种植和处理约2天后，将盆放置在塑料桶中，并开始在23。C下以长白昼条件(日光/黑暗的长度16小时/8小时)培育。在所有各种品系的植物中研究初始筛分(bolting)的天数和开花(第一株花)的天数，并从第一株花开花的天数一直到荚(子房)成熟的天数(开始裂口日)对植物进行研究。各个品系研究30株单个植物。开花天数结果示于图7中，而荚(子房)发育期的结果示于表6。图7的结果表明T3转基因植物的开花天数早于野生型。平均而言，T3转基因植物比野生型植物早大约6-7天。表6(<table>tableseeoriginaldocumentpage45</column></row><table>表6的结果表明与野生型植物相比，T3转基因植物的荚(子房)发育期显著增加。实施例6:转基因矮牵牛花的评价(1)转基因矮牵牛花的产生利用氯化l丐法(例如，HandbookofNewBiochemistryExperiment3，KagakuDojinpage121-122,1996)将pBI101-35S-FSPDl+禾口pBI101-35S-FSAM24+导入根癌农杆菌AglO株(Lazo等，BioTechnology9:963-967(1991))中。将如此获得的转化的农杆菌分别传播到衍生自矮牵牛花(种间杂交矮牵牛花)品种SafiniaPurpleMini(SuntoryFlowersCo.,Ltd.)的叶盘上，通过挑选对潮霉素显示抗性的植物细胞以及再分化获得转基因矮牵牛花。采用众所周知的方法(Horsch等，Science227:1229-1231(1985))对矮牵牛花进行转化。以pBI101-35S-FSPDl+和pBI101-35S-FSAM24+转化的各种不同的矮牵牛花进行试验PT144和试验PT146。在PT144中获得23株独立的转基因植物，而在PT146中获得43株植物。(2)导入基因表达的分析分别利用DNeasy植物小型试剂盒和RNeasy植物小型试剂盒(QiagenCo.,Ltd.,Tokyo)制备来自这些植物的染色体DNA和RNA。PT144和PT146矮牵牛花发现是基于采用染色体DNA作为模板进行的PCR反应分别保留SPDS(FSPD1)和SAMDC(FSAM24)基因的转基因植物，对PT144而言，PCR反应利用引物FSPD1F(5，-TAGTAGAGGGATTATTATGTCTGCGGA-3，)和FSPD1R(5，-ATGACGCTGATCACAATATAAAGCGAC-3，)进行，而对PT146而言，利用引物FSAM24F(5'-TGAAGGCTATGAAAAGAGGCTTGAAGTA-3，)和FSAM24R(5'-TCATGAGGATTGACCTTGGGATGACG-3')进行。95。C维持1分钟后，反应进行30个循环，每个循环为95'C、l分钟，52°C、2分钟，72°C、3分钟，然后72'C另维持1分钟。此外，利用从这些转基因矮牵牛花叶中提取的总RNA，基于RT-PCR分析各种不同个体的基因表达，其中利用TR-PCR的superscript快速链合成系统(InvitrogenCo.:Ltd.,Tokyo)和oligo(dT)12-18引物进行逆转录反应，以及其中利用逆转录产物作为模板通过同样的引物和涉及染色体DNA的循环进行PCR。在PT144植物中证实有9个个体表达外源基因(SPDS)，而在PT146植物中证实有27个个体表达外源基因(SAMDC)。(3)多胺含量的评价在表达最多的转基因植物的个体(细胞系)中分析游离多胺含量。将大约0.3-0.6g来自转基因植物(PT144,PT146)和同时培育的野生型植物(原始株PT144-C，PT146-C)的叶采样，冷冻和存储。向采集的样本中加入稀释内标溶液(1，6-己二胺，内标含量二7.5nmo1)和5%高氯酸水溶液(每l.Og样本鲜重为5-10mL)，并利用全能混合器室温下充分研磨和抽提。研磨溶液4'C下以35，000Xg离心20分钟，收集上清液，并用作游离多胺溶液。将400uL游离多胺溶液，200uL饱和碳酸钠水溶液和200uL丹磺酰氯/丙酮溶液(10mg/mL)加入到带有螺帽的微管中，轻轻混合。在用管塞紧紧封闭和用铝箔覆盖后，在60。C水浴中加热1小时进行丹磺酰化作用。让试管冷却后，加入200"L脯氨酸水溶液(100mg/mL)并混合。试管用铝箔覆盖后，再次在水浴中加热30分钟。放置冷却后，通过喷雾氮气去除丙酮，然后加入600PL甲苯，剧烈混合。使试管静置分成2相，将上层甲苯分离到300UL微管中。通过喷雾氮气完全去除甲苯。向微管中加入100-200uL甲醇，溶解丹磺酰化的游离多胺。利用与荧光检测仪相连的高效液相色谱，通过内标法对腐胺，亚精胺和精胺的游离多胺含量进行分析。uBondapakC18(由Waters,Co.生产，027324，3.9X300mm，粒度10um)用作HPLC柱。样本中的多胺含量的计算方法是从标准溶液和样本的HPLC图中推出多胺和内标的峰面积。结果示于表7中。野生型植物(144-C，146-C)中游离腐胺含量的平均值为29.46nmol/gFW(FW:鲜重)，而转基因植物(144，146)中的平均值为38.67nmol/gFW。野生型植物中游离亚精胺含量的平均值为37.03nmol/gFW(FW:鲜重)，而转基因植物中的平均值为50.40nmol/gFW。游离腐胺和游离亚精胺的量均增加。采用5%显著性水平对野生型植物和转基因植物之间的t-检验分析的结果揭示出在游离亚精胺方面的差异，以及表明尤其是亚精胺的量在转基因植物中增加。进一步证实与野生型植物(146-C)相比，PT146转基因植物中的游离精胺含量显著增加。表7<table>tableseeoriginaldocumentpage47</column></row><table>146-547.4232.66146-1036.7629.12146-1129.9966.14146-1239.4232146-1530.2631.89146-1655.4833.79146-1864.2551.85146-1949.8750.96146-2052.5550.23146-2152.5568.67146-2545.1544.6146-2724.0261.25146-3427.0162.67146-3737.6940.55146-3938.943.16146-4160.0277.8(4)转基因矮牵牛花的形态修饰的评价将矮牵牛花培养在空气温度为约25'C和用人工光补充自然光使周期为16小时亮、8小时暗的密封系统温室中。随时间测量每株单个植物的花朵数从表达外源基因的各株植物修剪后立即到第60天之间的变化。结果示于表8，图8和9中。表8，图8和9中的结果清楚地揭示出与原始母株(野生型植物)相比，转基因矮牵牛花的枝条和花朵数增加。在测量期间，原始母株SafiniaPurpleMini的花朵数不超过10朵，但在PT144植物中有6株(67%)和在PT146植物中有18株(67%)的花朵数超过10朵。此外，在许多原始母株的植物中，每个枝条的花朵数为0-3，而几乎没有观察到任何枝条上的花超过5朵。然而，高百分比的转基因植物的枝条上具有5朵以上的花，包括PT144植物中的3株(33%)和PT146植物中的5株(19%)。表8<table>tableseeoriginaldocumentpage49</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage50</column></row><table>本发明人发现了矮牵牛花中多胺量增加与花朵数和枝条数增加之间的相关性，并且业已证实导入的基因增加了多胺的量以及带来了花朵数和枝条数的增加。为了研究在此观察的花朵数的增加是否由延长单个花朵的花期引起，或是否由同时开花的花芽数的增加引起，花期长度在每个枝条上具有最多花朵的单个植株(PT144中有5个植株，PT146中有9个植株)中进行研究，其中从开花后立即一直到花瓣凋谢的期间称为花期；测量每株单个植物的5朵花；以及比较平均值。原始母株的花期的平均值为8.34天，而转基因植物的花期的平均值为9.35天，因此花期在转基因植物中趋于增加了。<table>tableseeoriginaldocumentpage51</column></row><table>teaattccaaaccccaaaaaggttetcgttateggtggaggagacggc448SerlieProAsnProLysLysValLeuVallieGlyGlyGlyAspGly110115120ggtgttttgcgagaggtggetcgccatteatctgttgagcagatagat496GlyValLeuArgGluValAlaArgHisSerSerValGluGinlieAsp125130135140atetgtgaaategacaagatggtagttgatgtttecaaagaatttttc544lieCysGlulieAspLysMetValValAspValSerLysGluPhePhe145150155cctcgcgtagetgtcgggtttgaggatcctcgtgtcactcttcatatt592ProArgValAlaValGlyPheGluAspProArgValThrLeuHislie160165170ggtgatggcgtcgcatttctgaaggetgttcctgaaggcacttatgat640GlyAspGlyValAlaPheLeuLysAlaValProGluGlyThrTyrAsp175180185gcagtgatagtggattcttctgatcctattggtcctgcacaagagetc688AlaVallieValAspSerSerA印ProlieGlyProAlaGinGluLeu190195200tttgagaagcctttttttgetteagttgccaaagetcttcgaccagga736PheGluLysProPhePheAlaSerValAlaLysAlaLeuArgProGly205210215220ggcgttgtgtgtactcaagcagagageatttggcttcacatgcatate784GlyValValCysThrGinAlaGluSerlieTrpLeuHisMetHislie225230235attgaagacattgtaacaaactgccgccaaatattcaaaggctctgtc832lieGluA印lieValThrAsnCysArgGinliePheLysGlySerVal240245250aactatgcatggactacagttcctacatatccaageggagtgattggg880AsnTyrAlaTrpThrThrValProThrTyrProSerGlyVallieGly255260265tttatgetctgcteaactgaggggcctcctcttgatttcaagcatcca928PheMetLeuCysSerThrGluGlyProProLeuAspPheLysHisPro270275280gtcaacccagtagaggtgaacggtategacaccgtgaagagtccgetc976ValAsnProValGluValAsnGlylieAspThrValLysSerProLeu285290295300aagttttacaacteggagattcatacagcagetttctgtttgccttct1024LysPheTyrAsnSerGlulieHisThrAlaAlaPheCysLeuProSer305310315tttgcgaagaagateategatteaaaagcaaaatgaaaaggtttcc1070PheAlaLysLyslielieAspSerLysAlaLys320325cccacagcgttgaagaagcagaaattggcggtcttggagtgtgccaatgtaataagtgga1130ggcttaaattagagtcgaaatggtcgctttatattgtgatcagegtcataaagtttcttg1190agatgttatgagtagtagaaatagcttttgttttcctccccaaaattttccccgtccttt1250ttcattgaaaagtgacatctggtgttctagcttctataaataaatatgetaaataaatat1310atttagecaaaaaaaaaa1328〈210>2<211>327〈212〉PRT〈213>Cucurbitaficifolia<400>2MetSerAlaGluHislieValGlySerAlaAlaAspAlaAlaAlaLys151015LysProGlulieGluAsnGlyValSerAlaSerGinProAspSerlie202530SerSerVallieProGlyTrpPheSerGlulieSerProMetTrpPro354045GlyGluAlaHisSerLeuLysValGluLysValLeuPheGinGlyLys505560SerAspTyrGinAsnValLeuValPheGinSerSerThrTyrGlyLys65707580ValLeuValLeuA印GlyVallieGinLeuThrGluArgAspGluCys859095AlaTyrGinGluMetlieThrHisLeuProLeuCysSerlieProAsn100105110ProLysLysValLeuVallieGlyGlyGlyAspGlyGlyValLeuArg115120125GluValAlaArgHisSerSerValGluGinlieAsplieCysGlulie130135140AspLysMetValValAspValSerLysGluPhePheProArgValAla145150155160<formula>formulaseeoriginaldocumentpage54</formula><formula>formulaseeoriginaldocumentpage54</formula>cgtaaaccatcctgagttctgctgaattccgtttttcctgcgcaccgagatccttagttt360tctataatttttactgtgtcttttttctttagtactctactttcctcgttctctcgttca420atctctcaacattagtaacttccttttaagaa犯gatgacgtttcctacctct473MetTh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