专利名称：一种改进的植物花粉管转化方法
技术领域：
本发明涉及生物技术遗传育种领域，具体涉及一种改进的植物花粉管转化方法。
背景技术：
1981年，我国的科学家周光宇首次应用花粉管通道法将外源DNA导入陆地棉中，成功培育出抗枯萎病的转基因品种。近年来，花粉管通道法因其独特的优势，被科学家们广泛的利用，进行植株的转基因操作。该方法有以下几个优点首先，花粉管通道法适用范围较广，可以应用到任何开花的植物中，并且可以在不同物种之间进行不同的基因转移，因此其放宽了目的基因和受体植株的范围。第二，其不依靠繁琐的植物组织培养和诱导植物再生的漫长过程，花粉管通道法利用的是自然的生殖过程，可直接获得转化过的转基因种子，简捷、快速。第三，该方法应用于植株转化时，大大加快了转化速度。对于大多数植株而言，从其开花到转基因种子的收获平均在3-4个月的时间。即在当年即可收获转基因种子，并 进行检测。第四，操作简捷，技术易掌握，同时不需要昂贵的设备，因此可以应用于大面积植株的遗传转化。但是该方法在具体的实际应用中，还有一定的缺陷，即该方法转化效率不高，在转化过程中，外源质粒DNA易降解。DNA保护剂主要是一类可以保护抗原的物质，特别是DNA、RNA不受体内酶的分解。DNA保护剂包括氢氧化铝明胶、磷酸钙和乳油保护剂。而在医学中，铝盐佐剂是被允许应用于人类的佐剂。利用这类铝盐胶体，抗原会跟一个不溶的凝胶沉淀剂结合，或者经过相互的电作用形成凝胶粒子。该保护剂的作用原理是因其是一个暂时的储存库，缓释是其非常重要的一个功能。它可以将抗原包裹住，可以避免抗原分子被降解，同时可以避免受体内的清除作用而丧失。乳油保护剂一般是用矿物油、稳定剂及乳化剂(如TWeen20、Tween80及SpanSO)按照一定的比例进行混合，然后与抗原混合制成。这类保护剂是一种油包水的乳齐U，它可以作为一个保存库，避免抗原被水相中的机体水解，进而到达抗原被保护的目的。而传统的花粉管通道法，大多用I X SSC溶液作为回溶剂，回溶目的基因或质粒。
发明内容
本发明的目的是为解决花粉管通道法在转化过程中，外源质粒DNA易降解，转化效率不高的问题，而提供一种改进的植物花粉管转化方法。一种改进的植物花粉管转化方法，其特征在于将外源质粒DNA重悬于质粒DNA保护剂中，制成外源质粒DNA的混合液；浓度为0. 8-1. 2 u g/y L，然后利用植物花粉管通道法转化到植物中；
所述的外源质粒DNA保护剂，它是氢氧化铝溶胶保护剂、磷酸钙保护剂和Tween20保护剂中的一种；
所述的外源质粒DNA的浓度为I y g/ y L。所述的外源质粒DNA的混合液是由下述的方法制备的
(I)在一支玻璃试管中加入2-4mL 1%氯化铝溶液，再加入0.05-2 mL 10%氨水，使其形成沉淀；
(2)弃上清，用蒸馏水清洗沉淀3-5次，采用倾析法除去水分，最后一次用过滤法使洗液与沉淀分离；
(3)将沉淀转入150mL烧杯中，加入蒸懼水20-80 mL,搅拌并加热煮沸。期间加入
0.1-0. 2 mL 0. I mol/L HCl溶液，不断搅拌，即可获得氢氧化铝溶胶；
(4)氢氧化铝溶胶重悬外源质粒DNA。所述的外源质粒DNA的混合液是由下述的方法制备的
(1)用灭菌蒸馏水5-15u L重悬外源质粒DNA，使其浓度为I y g/ y L，再加入50-60U L 2 mol/L CaCl2 溶液混匀；
(2)离心，将上清液取出，加入到400-450UL灭菌蒸馏水中；得外源质粒DNA-CaCl2溶
液；
(3)取一个2mL灭菌的离心管，向其中加入500 u L, pH6. 95-7. 05，2XHEPES缓冲液，向HEPES缓冲液中以吹气的方式逐滴滴入外源质粒DNA-CaC12溶液；
(4)将试管放于37°C水浴中孵育3-5min，可见乳白色混浊出现；
(5)10000 r/min离心3 min,弃上清；所得的混合物即为磷酸I丐-外源质粒DNA。所述的外源质粒DNA的混合液是由下述的方法制备的
(1)采用灭菌蒸馏水与蔗糖，配成浓度为8%的蔗糖溶液，115°C灭菌15-20min ；
(2)取上述蔗糖溶液与TWeen20混合，制成浓度为5%的TWeen20保护剂；
(3)取5%的Tween20保护剂10-20u L外源质粒DNA。本发明提供了一种改进的植物花粉管转化方法，分别采用氢氧化铝溶胶、磷酸钙和TWeen20作为外源质粒DNA保护剂，利用植物花粉管通道法转化外源基因，受体烟草和大豆GUS活性组织化学染色结果表明，以氢氧化铝溶胶作为DNA保护剂的gus阳性率分别为
11.1%和3. 76% ;以磷酸钙作为DNA保护剂的gus阳性率分别为8. 89%和2. 91% ;以Tween20作为DNA保护剂的gus阳性率分别为10. 0%和I. 41% ;以IXSSC溶液作为DNA保护剂的gus阳性率分别为7. 78%和I. 97%，提高了转化率。
图I转基因烟草抗性植株；
图2转基因大豆抗性植株；
图3烟草抗性株PCR产物检测结果；
图4大豆抗性株PCR产物检测结果；
图5转基因烟草根部、叶片和种子GUS活性组织的化学染色结果，其中，5-A为根部；5-B为叶片；5-C为种子；
图6转基因大豆种子和叶片GUS活性组织的化学染色结果，其中，6-A为种子；6-B为叶片。下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法。
具体实施例方式 实施例I植物表达载体PCAMBIA1301质粒DNA的提取
按照质粒DNA常规提取方法-碱裂解法，从含有植物表达载体pCAMBIA1301的大肠杆菌中提取质粒DNA。实施例2氢氧化铝溶胶保护剂的制备
(1)在一支玻璃试管中加入2-4mL1%氯化铝溶液，再加入0.05-2 mL 10%氨水，使其形成沉淀；
(2)弃上清，用蒸馏水清洗沉淀3-5次，采用倾析法除去水分，最后一次用过滤法使洗液与沉淀分离；
(3)将沉淀转入150mL烧杯中，加入蒸懼水20-80 mL,搅拌并加热煮沸。期间加入
0.1-0. 2 mL 0. I mol/L HCl溶液，不断搅拌，即可获得氢氧化铝溶胶； (4)取少许氢氧化铝溶胶重悬实施例I中所提取的pCAMBIA1301的质粒DNA沉淀，获得的混合物即为氢氧化铝溶胶-pCAMBIA1301，pCAMBIA1301的质粒DNA的浓度为0. 8-1. 2y g/ y L0实施例3磷酸钙保护剂的制备
(I)用灭菌蒸馏水5-15 U L重悬实施例I所提取的pCAMBI1301的质粒DNA沉淀，使其浓度为I Ug/yL，再加入50-60 UL 2 mol/L CaC12溶液混匀，此时会有少量混浊物质出现。(2)12000 r/min离心10 min,将上清液取出，加入到400-450 U L灭菌蒸懼水中，此即称为pCAMBIA1301-CaC12溶液。(3)取一个2 mL灭菌的离心管，向其中加入500 u L 2XHEPES缓冲液(pH6. 95-7. 05)，向HEPES缓冲液中以吹气的方式逐滴滴入pCAMBIA1301_CaC12溶液。(4)将试管放于37°C水浴中孵育3-5 min，可见乳白色混浊出现。(5) 10000 r/min离心3 min,弃上清。所得的混合物即为磷酸I丐_pCAMBIA1301,PCAMBIA1301 的质粒 DNA 的浓度为 0. 8-1. 2 u g/u L0实施例4 Tween20保护剂的制备
(I)采用灭菌蒸馏水与蔗糖，配成浓度为8%的蔗糖溶液，115°C灭菌15-20 min。(2)取上述蔗糖溶液与TWeen20混合，制成浓度为5%的TWeen20保护剂。(3)取5%的Tween20保护剂10_20 u L重悬实施例I所提取的pCAMBIA1301的质粒DNA沉淀，使其浓度为0. 8-1. 2 ug/u L0实施例5三种不同DNA保护剂处理的质粒DNA pCAMBIA1301花粉管通道转化方法 分别采用大豆和烟草作为受试材料。( I)大豆花粉管通道转化法 ①大豆材料种植
将事先准备好的大豆种子在试验田内播种长至盛花期。②选择大豆自花授粉6 h后进行质粒DNA导入，标志是花冠完全开放后的花。③使用镊子把一个节点部位的其他花朵去掉，剩余1-2朵完全开放的花。④用镊子将剩余花朵的萼片和翼瓣出去，用小剪刀把突出的柱头剪去部分。⑤使用微量注射器将5-10 UL实施例2、3、4制备的质粒DNA溶液滴加到切口处。同时用IXSSC缓冲液重悬的质粒DNA做对照进行同样处理。⑥挂好记录有质粒DNA样品、导入时间及受体植株品种的标牌。⑦待20-30 min后，重新滴加一次。
⑧大豆在进行外源基因导入3-7 d后，定期去杂，保证转化的花朵可以结实。每种不同保护剂混合的质粒DNA分别导入大豆100棵。 (2)烟草花粉管通道转化法 ①烟草材料种植
由于烟草种子过小，先在MS培养基培育无菌苗，25 d后，待无菌苗根系发育良好，先炼苗5-7 d，然后移栽至小花盆中。待其长至25 cm左右，移栽至温室中。在其盛花期进行目的基因的导入。②在烟草授粉后10 h，用剪刀在子房上部I cm处剪去花柱。③使用微量注射器将5-10 UL实施例2、3、4制备的质粒DNA溶液滴加到切口处。同时用IXSSC缓冲液重悬的质粒DNA做对照进行同样处理。
④挂好记录有质粒DNA样品、导入时间及受体植株品种的标牌，每种DNA保护剂分别转化烟草90棵。实施例6转基因植株的检测
(I)转基因植株抗性筛选
将收获的烟草和大豆种子分别放入含有潮霉素浓度为10 mg/L的MS筛选培养基中进行抗性筛选，如图1、2所示。( 2 )抗性植株的PCR检测
①根据植物基因DNA的常规提取方法-CTAB法分别提取抗性植株和未转化植株的基因组 DNA。②植物表达载体PCAMBIA1301上含有gus基因(￠-葡萄糖苷酸酶基因)，长度2000bp，选取其中长度为1007 bp的部分序列设计特异性引物，以提取植株基因组DNA为模板，扩增gus基因，其中抗性植株为实验组，未转化植株为阴性对照组，并以PCAMBIA1301的质粒DNA作为阳性对照组。③PCR产物经0. 8%琼脂糖凝胶电泳检测，如图3、4所示，随机检测的5株烟草和大豆抗性植株均扩增出了 1007 bp的特异性条带，且同阳性对照组的位置相同，而阴性对照组未见1007 bp的特异性条带。结果表明，在转基因阳性植株中含有gus基因，其来源为花粉管通道转化法导入的。( 3 )⑶S活性组织的化学染色试验
对PCR检出阳性的烟草植株的叶片、根部和大豆植株的种子和叶片进行常规GUS活性组织化学染色。如图5所示，转基因烟草的叶片(5-A)、根部(5-B)种子(5-C)均检测出⑶S活性，而未进行转化的烟草各个部位皆未能染色，说明其不具有GUS活性。如图6所示，转基因大豆的种子(6-A)、叶片(6-B)均检测出GUS活性，而未进行转化的烟草各个部位皆未能染色，说明其不具有GUS活性。结果表明，gus基因在烟草和大豆植株内均获得表达，夕卜源DNA成功转入受体植株中。对实施例2、3、4制备的DNA保护剂转化的受体烟草和大豆⑶S活性组织化学染色结果表明，以氢氧化铝溶胶作为DNA保护剂的gus阳性率分别为11. 1%和3. 76% ;以磷酸钙作为DNA保护剂的gus阳性率分别为8. 89%和2. 91% ；以Tween20作为DNA保护剂的gus阳性率分别为10. 0%和I. 41% -M IXSSC溶液作为DNA保护剂的gus阳性率分别为7. 78%和
I.97%，见表 1、2。
表I三种DNA保护剂使质粒DNA转入烟草的转化率
权利要求
1.一种改进的植物花粉管转化方法，其特征在于将外源质粒DNA重悬于质粒DNA保护剂中，制成外源质粒DNA的混合液；浓度为0. 8-1. 2 ug/UL,然后利用植物花粉管通道法转化到植物中。
2.根据权利要求I所述的一种改进的植物花粉管转化方法，其特征在于所述的外源质粒DNA保护剂，它是氢氧化铝溶胶保护剂、磷酸钙保护剂和TWeen20保护剂中的一种。
3.根据权利要求I或2所述的一种改进的植物花粉管转化方法，其特征在于所述的外源质粒DNA的浓度为I y g/ y L。
4.根据权利要求I所述的一种改进的植物花粉管转化方法，其特征在于所述的外源质粒DNA的混合液是由下述的方法制备的 (1)在一支玻璃试管中加入2-4mL1%氯化铝溶液，再加入0.05-2 mL 10%氨水，使其形成沉淀； (2)弃上清，用蒸馏水清洗沉淀3-5次，采用倾析法除去水分，最后一次用过滤法使洗液与沉淀分离； (3)将沉淀转入150mL烧杯中，加入蒸馏水20-80 mL，搅拌并加热煮沸； 期间加入0. 1-0. 2 mL 0. I mol/L HCl溶液，不断搅拌，即可获得氢氧化铝溶胶； (4)氢氧化铝溶胶重悬外源质粒DNA。
5.根据权利要求I所述的一种改进的植物花粉管转化方法，其特征在于所述的外源质粒DNA的混合液是由下述的方法制备的 (1)用灭菌蒸馏水5-15u L重悬外源质粒DNA，使其浓度为I y g/ y L，再加入50-60U L 2 mol/L CaCl2 溶液混匀； (2)离心，将上清液取出，加入到400-450UL灭菌蒸馏水中；得外源质粒DNA-CaCl2溶液； (3)取一个2mL灭菌的离心管，向其中加入500 u L, pH6. 95-7. 05，2XHEPES缓冲液，向HEPES缓冲液中以吹气的方式逐滴滴入外源质粒DNA-CaC12溶液； (4)将试管放于37°C水浴中孵育3-5min，可见乳白色混浊出现； (5)10000 r/min离心3 min,弃上清；所得的混合物即为磷酸I丐-外源质粒DNA。
6.根据权利要求I所述的一种改进的植物花粉管转化方法，其特征在于所述的外源质粒DNA的混合液是由下述的方法制备的 (1)采用灭菌蒸馏水与蔗糖，配成浓度为8%的蔗糖溶液，115°C灭菌15-20min ； (2)取上述蔗糖溶液与TWeen20混合，制成浓度为5%的TWeen20保护剂； (3)取5%的Tween20保护剂10-20u L外源质粒DNA。
全文摘要
本发明公开了一种改进的植物花粉管转化方法，分别采用氢氧化铝溶胶、磷酸钙和Tween20作为外源质粒DNA保护剂，利用植物花粉管通道法转化外源基因，受体烟草和大豆GUS活性组织化学染色结果表明，以氢氧化铝溶胶作为DNA保护剂的gus阳性率分别为11.1%和3.78%；以磷酸钙作为DNA保护剂的gus阳性率分别为8.89%和2.91%；以Tween20作为DNA保护剂的gus阳性率分别为10.0%和1.41%；以1×SSC溶液作为DNA保护剂的gus阳性率分别为7.78%和1.97%，解决了植物花粉管通道法转化率低的问题，提高了转化率。
文档编号C12N15/82GK102864168SQ201210406418
公开日2013年1月9日 申请日期2012年10月23日 优先权日2012年10月23日
发明者王丕武, 付永平, 张君, 曲静, 姚丹, 马建, 王鑫雨, 单睿, 关淑艳 申请人:吉林农业大学